鮑曼不動桿菌OmpA蛋白的生物學特性分析

趙丹 李尼克 李雯 彭春紅 趙德剛 張湘燕△

(1.貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科,貴州 貴陽 550002;2.國家衛生健康委員會肺臟免疫性疾病重點實驗室,貴州 貴陽 550000;3.貴州醫科大學,貴州 貴陽 550000;4.貴州大學農業生物工程研究院/山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550000)

細菌的外膜蛋白(Outer membrane protein,Omp)廣泛存在于革蘭氏陰性桿菌科中,主要含有外膜蛋白A(Outer membrane protein A,OmpA)、孔蛋白C和F等,是其毒力的主要部分,具有致病性及免疫原性[1]。OmpA是鮑曼不動桿菌含量最多的外膜蛋白之一,過去對鮑曼不動桿菌的研究主要集中在耐藥性及免疫原性,但其結構與耐藥性及免疫原性之間的關系探索相對較少。為進一步確定鮑曼不動桿菌OmpA的生物學特征,本研究對鮑曼不動桿菌OmpA基因進行檢測、測序分析,預測其三級結構、跨膜結構等,為進一步研究鮑曼不動桿菌OmpA的致病性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料鮑曼不動桿菌臨床分離株12株(由貴州省人民醫院檢驗科微生物室惠贈),鮑曼不動桿菌標準株(ATCC17978)購于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 主要器材移液槍、高速低溫離心機(德國Eppendorf公司),DNA Engine PCR儀(美國伯樂Bio-rad公司),凝膠成像系統(美國Bio-rad公司),電泳儀(北京六一公司),臺式恒溫搖床(美國Thermo公司),細菌培養箱(美國Thermo Fisher公司),超純水儀(臺灣艾柯公司),超凈工作臺(蘇州蘇凈集團安泰公司),VITEK-32全自動微生物分析鑒定儀(法國梅里埃公司)。

1.3 主要試劑LB培養基(英國Oxoid公司),瓊脂糖(英國OXOID公司),細菌DNA提取試劑盒(康維世紀),2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(Thermo Scientific,#K0221),2×ES Taq MasterMix(康維世紀,CW0690S),DEPC H2O(均來自天根生化科技有限公司),合成引物購及基因測序(上海生工公司)。

1.4 主要試劑配置50×TAE緩沖液1 L(pH值8.5):Tris 242 g、Na2EDTA·2H2O 37.2 g,加入800 mL的雙蒸水充分混勻,乙酸57.1 mL,加入雙蒸水定容至1 L,室溫保存。10×TBE緩沖液(pH值8.3):Tris 108 g、Na2EDTA·2H2O 7.44 g、硼酸55 g、雙蒸水800 mL,上述溶液充分混勻后,加入雙蒸水定容至1 L,室溫保存。溴乙錠(工作濃度0.5 g/mL):10 mg/mL溴乙錠1 g,雙蒸水100 mL,充分混勻,轉移至棕色瓶中,室溫避光保存。氨芐青霉素(Amp)(5 mL):Amp 0.5 g,ddH2O 5 mL,充分混勻、過濾,分裝于1.5 mL EP管中(每支200 μL),于-20 ℃保存?？ɡ顾?Kan)(5 mL):Kan 0.5 g,ddH2O 5 mL,充分混勻、過濾,分裝于1.5 mL EP管中(每支200 μL),于-20 ℃保存。

1.5 方法

1.5.1 菌株培養本研究所用鮑曼不動桿菌臨床分離株12株,為貴州省人民醫院檢驗科微生物室臨床分離惠贈,采用VITEK-compact2全自動微生物鑒定藥敏系統,紙片擴散法及E-test條藥敏試驗,藥敏試驗判斷標準和結果解釋參照美國CLSI標準(Clinical and Laboratory Standards Institute,2010),并用標準菌株做藥敏質量控制,剔除同一患者重復分離的相同細菌。無菌操作臺滅菌30 min后,75%酒精棉球消毒包括手在內的所有物品;用滅菌接種環蘸取1環菌液LB培養平板24 h;挑單克隆菌,放入3 mL LB培養基中,于37 ℃振搖培養12～16 h(150 r/min);經洗滌、懸浮后繼續培養至對數生長期,再用新鮮LB懸浮至OD600為0.05。

1.5.2 OmpA基因及鮑曼不動桿菌管家基因DNA擴增將復蘇好的鮑曼不動桿菌臨床分離株菌液各取200 μL,12 000 r/min,離心2 min收集沉淀的菌體,用含有400 mg/L溶菌酶的100 μL TE緩沖液懸浮菌體。采用 Genbank中的OmpA基因序列設計并合成DNA引物,擴增鮑曼不動桿菌7個管家基因gltA,gyrB,gdhB,recA,cpn60,gpiF,rpoD(Bartual SG,2005),見表1。將DNA模板、Primer Mix、dNTP mix、DTT、RT Buffer、HiFi Script和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。配置反應體系,總體積為20 μL,dNTPmix,2.5 mM Each 4 μL,Primer Mix 2 μL,RNA Template X μL,5XRT Buffer 4 μL,DTT,0.1 M 2 μL,Taq DNA Polymerase,BPI 200 μL 1μL,加入RNase-Free Water至20 μL。反應程序:95 ℃,5 min;95 ℃,40 s,56 ℃,40 s,72 ℃,1 min,共30個循環;72 ℃,10 min。反應產物于-80℃保存。

表1 PCR擴增管家基因及OmpA基因引物

1.5.3 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳按照瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍,采取1%濃度制膠,即1.8 g瓊脂糖加入180 mL雙蒸水于錐形瓶中微波爐加熱溶解,使溶液冷卻至50～60 ℃左右,加入溴乙錠溶液(終濃度0.5 μg/mL),并充分混勻。將瓊脂糖溶液倒入插上齒梳的制膠模中,小膠倒入25～30 mL左右瓊脂糖溶液,大膠倒入60～70 mL左右瓊脂糖溶液。室溫下放置30 min至1 h,待膠凝固。上樣,取于PCR反應產物4 μL與20 μL 6×上樣緩沖液混勻,用微量移液槍取20 μL小心加入樣品槽中。電泳:加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源,控制電壓保持在110 V,電流在40 mA以上。當條帶移動到距離前沿約2 cm時(約40 min),停止電泳。紫外線下拍照并觀察。

1.5.4 PCR產物回收將目的基因DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下,放入干凈的離心管、稱質量。加入等倍體積溶液PN,50 ℃水浴至膠塊完全溶解。將所得溶液加入500 μL平衡液BL處理的吸附柱CA2中,室溫5 min,12 000 r/min,離心30～60 s,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管。加入600 μL漂洗液PW,12 000 r/min,離心30～60 s,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管,重復清洗1次。12 000 r/min,離心2 min,棄去廢液,室溫晾置數分鐘,轉入新的離心管,吸附膜中間懸空滴加30 μL ddH2O,室溫5 min,12 000 r/min,離心2 min,得到DNA溶液。反應產物于-80℃保存。

1.5.5 鮑曼不動桿菌MLST基因分析分別擴增12株臨床分離的鮑曼不動桿菌的7個管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD,多位點序列分型(MLST)引物參照鮑曼不動桿菌的MIST數據庫(http://pubmlst.org/abaumanni/),擴增產物雙向測序由上海生工生物工程公司進行第二代高通量測序,測序結果與鮑曼不動桿菌MLST數據庫進行比對分析(http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst＿abaumannii＿seqdef),獲得每個等位基因的數值,然后將每株細菌按照的順序排列成等位基因譜,對每株細菌進行序列分型及SNP分析。

1.5.6 OmpA的三級結構預測及跨膜結構分析擴增12株臨床分離的鮑曼不動桿菌外膜蛋白OmpA基因,DNA產物測序由上海生工生物工程公司完成。OmpA的三級結構預測(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、跨膜結構預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

2 結 果

2.1 臨床分離的鮑曼不動桿菌管家基因鑒定及MLST分型12株臨床分離鮑曼不動桿菌管家基因擴增,見圖1。7個管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpiF和rpoD的PCR擴增結果經測序比對后顯示,12株鮑曼不動桿菌主要可分為6個ST型(ST 208,1-3-3-12-2-96-3;ST 229,1-3-3-12-2-94-3;ST 191,1-3-3-12-2-94-3;ST 195,1-3-3-12-1-96-3;ST 540,1-3-3-12-1-96-3;ST 1145,1-3-3-12-2-94-3),如表2所示。12株臨床分離鮑曼不動桿菌管家基因的MLST分析有24個SNP位點,主要集中cpn60及gpiF基因,見表2及圖2。

注:A.gltA 基因DNA電泳條帶;B.gyrB基因DNA電泳條帶;C.gdhB基因DNA電泳條帶;D.recA基因DNA電泳條帶;E.cpn60基因DNA電泳條帶;F.gpiF基因DNA電泳條帶;G.rpoD基因DNA電泳條帶。

圖2 12株臨床分離鮑曼不動桿菌SNP位點分析

表2 12株鮑曼不動桿菌的MLST基因及構成比(%)

2.2 臨床分離的鮑曼不動桿菌OmpA DNA表達水平12株鮑曼不動桿菌均檢測到OmpA基因,分子量為1 070 bp ,見圖3。

注:從上到下分子量依次為2 500、2 000、1 500、1 000、800、200 bp,其中1 000 bp加亮。

2.3 鮑曼不動桿菌OmpA的三級結構分析OmpA基因測序序列進行三級結構預測提有6種三級結構,均由β-桶狀結構組成的保守結構域,見圖4。

圖4 鮑曼不動桿菌OmpA基因三級結構預測

2.4 鮑曼不動桿菌OmpA的蛋白跨膜結構分析OmpA基因測序序列進行蛋白跨膜結構預測為跨膜蛋白,見圖5。

圖5 鮑曼不動桿菌OmpA跨膜結構預測

3 討 論

鮑曼不動桿菌廣泛存在于自然界,具有生存及侵襲能力強等特點,能在各級醫療機構廣泛流行,是一種重要的條件致病菌,在免疫力較低及長期大量使用抗生素的患者中感染率尤其高,可引起呼吸機相關性肺炎及皮膚、泌尿系、傷口及中樞神經系統等感染。由于地域不同、醫院治療方案不同及環境消毒的差別,鮑曼不動桿菌的臨床特征及耐藥情況不同[2]。MLST分型可獲得等位基因圖譜,有群體遺傳學分析的功能,且能夠準確提供菌種評估的信息,是目前臨床中監控鮑曼不動桿菌傳播的常用方法[3]。多位點序列分型(sequencetype,ST)是測定鮑曼不動桿菌7個管家基因的部分DNA序列,根據每一序列的特異性賦予一個特定的等位基因編號,每一菌株7個管家基因的7個特異性編號即構成該菌株的序列型,根據ST分型發現菌株的變異[4]。本研究擴增了12株臨床分離的鮑曼不動桿菌管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpiF及rpoD,通過MLST分型結果12株菌株中的6個ST分型均已公布,未發現變異菌株,其中4株為ST 208,3株為ST 229,2株為ST 191,在ST 195、ST 540和ST 1 145中,分別各1株。本研究結果以ST 208為主,SNP等進行預測分析結果顯示其SNP突變不多,主要在cpn60及gpir基因中,與既往研究結果一致[5]。

Omp是革蘭氏陰性菌的主要成分,大約占外膜結構的50%左右,其位于細菌膜表面或鑲嵌其中,主要以磷脂組成內層結構,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組成的外層結構所組成。Omp主要起到維持細菌外膜完整性、阻隔細菌等外界物質入侵,同時因其是一個重要的膜孔蛋白[6],通過外膜小泡分泌和傳遞致病因子給宿主細胞,在細菌對宿主的感染及致病過程中具有重要的病理生理作用[7-9],目前該蛋白已逐漸成為鮑曼不動桿菌的研究熱點。鮑曼不動桿菌OmpA是一個分子量大小為38 kD,氨基酸保守性>99%的蛋白質,因此菌種間蛋白差異較小,是目前功能研究最確定的毒力因子[10],本實驗研究結果提示鮑曼不動桿菌OmpA基因片段的核苷酸序列長度為1 070 bp,與GeneBank中序列相一致,與張欣等[11]和E.H.Kawther等[12]研究外膜蛋白OmpA核苷酸序列結果相一致。在分離的12株臨床菌株中都有OmpA基因的表達,說明外膜蛋白的氨基酸序列高度保守。

OmpA由N-端及C-端兩個富含脯氨酸的區域組成,N-端為β-桶狀跨膜蛋白區域,為170殘基、八鏈、反向平行的β-桶狀結構,模擬的晶體結構可見β-鏈相對于桶軸平均呈450傾斜,圓桶橫截面直徑為26A,長為57A,這些短鏈被連接在細胞質邊上,更多以環狀連接在細胞膜外。鮑曼不動桿菌的OmpA包含三個不同的結構域:N端信號肽、β-桶狀結構和C端OmpA樣結構域,模擬的晶體結構可見β-鏈相對于桶軸平均呈450傾斜。N-端β-桶狀跨膜蛋白區域具有線粒體定位信號序列,C-端的細胞周質區為OmpA樣區域,由150殘基組成,以球狀附著在細胞質的間隙[13]。OmpA樣區域是一個保守序列,富含OmpA相關的外膜蛋白和MotB蛋白,在結合肽聚糖層和肽聚糖相關磷脂(diaminopimelate,DAP)時具有重要功能,保持外膜蛋白整體的完整性并調控外膜蛋白的產生[13],C-端細胞周質區域具有細胞核定位信號序列。本研究將鮑曼不動桿菌OmpA比對Pubmed上三級空間結構,結果發現6種β-桶狀結構,具有維持細胞的形狀和穩定性作用,同時也參與生物膜的形成、細菌黏附、侵襲宿主細胞、鐵蛋白的獲取和免疫逃逸等過程。OmpA蛋白跨膜分析屬于跨膜蛋白,與既往的研究結果一致[14]。但其跨膜的同時,中心形成膜孔,可以將復合物從細胞周質泵出細胞外,與內膜蛋白流出泵系統配對,參與鮑曼不動桿菌耐藥機制的產生[15]。隨著基因編輯技術的發展,當前對OmpA的研究更加深入。既往的研究發現Omps在許多細菌中為有效抗原,能夠誘導機體產生強烈的免疫反應,具有作為亞單位疫苗的潛力,因此有報道[16-18]將OmpA原核表達、純化作為疫苗運用。鮑曼不動桿菌OmpA的結構相對保守,維持細胞的形狀和穩定性的同時,參與細菌耐藥機制,同時有望成為免疫疫苗運用于臨床中。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過貴州省人民醫院倫理委員會批準(倫預審字[2019]090號),為微生物實驗研究,故知情同意免除。