卡介苗通過抑制大鼠急性脊髓損傷中炎癥級聯反應保護脊髓的機制

蒲興魏 歐陽北平 陸庭盛 姚書眈 崔松 羅春山

(貴州省骨科醫院,貴州 貴陽 550002)

脊髓損傷(SCI)后繼發的免疫及炎癥反應是導致脊髓繼發損傷的重要因素[1],其產生大量的促炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β及IL-6等,能抑制神經功能的恢復,而TGF-β和IL-10等[1-3]抑炎因子具有強烈的炎癥抑制活性,具有神經保護作用。卡介苗(BCG)是結核桿菌的減毒活疫苗,可誘導調節性T細胞(Treg)生成,可誘導機體產生免疫炎癥反應,對機體具有免疫保護作用[8-9]。因此能否通過BCG誘導并調節機體自身免疫炎癥反應,從而發揮對SCI的保護性作用,這對于SCI的早期治療可能具有重要意義。本研究通過向SCI大鼠模型注射BCG,通過用BBB評分、HE染色及檢測炎癥因子變化情況以探究BCG對SCI的影響,為BCG在SCI中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組72只SPF級的健康成年SD大鼠(體重250～300 g),購自貴州醫科大學動物實驗中心,全部為雄性。隨機分為假手術組、模型組和BCG治療組,各24只。

1.2 主要試劑卡介苗佐劑(上海嘉楚生物工程有限公司);4%多聚甲醛(上海嘉楚生物工程有限公司);蘇木素染液(ZLI-9610,中衫金橋);伊紅染色液(G1100,Solarbio);TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、TGF-β試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.3 實驗模型的制備參照Allen法制作大鼠脊髓損傷模型。用40 g/L戊巴比妥鈉溶液按40 ms/kg行腹腔注射麻醉。固定四肢于手術臺,定位T10棘突,剔除背部3 cm×4 cm大小周圍毛發,3%絡合碘消毒皮膚后,鋪設洞巾,沿脊柱方向在T10水平開一長約3 cm切口,暴露背部肌肉、筋膜組織,剪開深筋膜,剝離棘突兩側肌肉顯露椎板,假手術組僅去除T10椎板,顯露硬膜囊大小約1 cm×0.6 cm,墊一塑料墊片,模型組和BCG治療組用滅菌后自制的脊髓打擊器—10 g重的打擊桿自25 mm高度自由下落(打擊桿底部直徑2.5 mm),打擊脊髓,觀察大鼠尾巴和雙下肢短暫抽搐,脊髓硬膜囊輕微腫脹,造模成功。大鼠術后麻醉清醒,模型組和BCG治療組大鼠雙后肢癱瘓,小便功能喪失,每日予以膀胱按摩并擠尿3次,直至恢復自主排尿功能。實驗組大鼠于建立模型后30 min、24 h、48 h于大鼠腹腔注射BCG(105CFU),共3次,對照組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,注射時間同實驗組,假手術組不給予干預措施。

1.4 術后大鼠后肢功能評價采用Basso,Beattie &Bresnahan locomotor rating scale-BBB評分系統。評定方法為將大鼠置于高7 cm、直徑90 cm的平坦不滑的木板上,任其自由爬行,由兩名熟知BBB評分的非實驗人員觀察記錄,持續時間≥4 min,總分21分,0分表示無運動功能,21分表示運動功能正常,分別評分,取其平均值。在術后的第1、3、5、7、14天分別對各組進行BBB評分。

1.5 標本采集動物麻醉成功后。剖胸經左心室至主動脈插管,并以止血鉗固定;剪開右心耳,見靜脈血流出,當即從灌注針灌入PBS緩沖液約80 mL,待右心耳流出清澈液體后將灌注液體更換為4%多聚甲醛,多聚甲醛灌注速度為先快后慢,快速灌注50 mL后放慢速度,緩慢滴注維持即可,每只大鼠約需100 mL,持續灌注至大鼠四肢和全身肌肉不停抽動;將僵硬的大鼠俯臥至手術臺,沿原切口打開皮膚及肌肉,見到原脊髓打擊部位,去除椎管周圍增生粘連組織,小心取出損傷中心上下長約1.5 cm脊髓組織,每組取16個脊髓標本予以制成脊髓勻漿,用于TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10檢測;其余16個脊髓標本作HE染色用。

1.6 HE染色取出脊髓組織塊用PBS反復沖洗后置于40 g/L多聚甲醛PBS(pH=7.4)中固定12 h后,梯度乙醇脫水、透明、包埋、修剪平齊后連續切片,制備3 μm組織切片、貼片、烤片,用于HE染色鏡檢。

1.7 免疫酶聯法(ELISA)檢測各組脊髓組織中炎癥因子變化將所取脊髓組織放入勻漿器中,以0.1 g∶0.9 mL加入預冷的等滲鹽水研磨制備腦組織勻漿液,勻漿后以800 r/min離心10 min,取上清液,為10%組織勻漿液,上清液中加入等體積三氯甲烷混勻后,以3 500 r/min離心15 min,取上清液分為3管,采用ELISA檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10水平,嚴格按TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10試劑盒說明書操作,勻漿中蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定,最后標本TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-10含量以ns/g蛋白質表示。

2 結 果

2.1 肢體功能行為學對術后兩周內大鼠脊髓損傷后進行后肢運動評分,發現假手術組沒有任何運動障礙,而模型組和BCG治療組在術后均表現出后肢的癱瘓,BBB評分趨近于0,模型型組和BCG治療組相比,前者評分顯著低。見表1。

表1 不同分組實驗動物術后的BBB評分比較分,n=24]

2.2 大鼠脊髓損傷的組織病理學變化通過HE染色觀察大鼠脊髓損傷的組織病理學,結果顯示假手術組無明顯炎性細胞浸潤、膠質細胞增生和細胞空泡變性;模型組可見大量細胞空泡變性和炎性細胞浸潤,部分細胞核固縮;BCG治療組可見炎癥細胞減少、空洞較模型組減小,結構排列較完整。見圖1。

圖1 HE染色觀察大鼠脊髓損傷組織病理學變化(×400倍)

2.3 Elisa法檢測脊髓損傷后炎癥因子的表達模型組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量高于BCG治療組(P<0.05),TGF-β和IL-10含量低于卡介苗治療組(P<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓組織中炎癥因子含量比較

3 討 論

SCI后經歷了穩態被破壞、免疫炎癥反應、再生及瘢痕形成和組織重塑四個階段,免疫反應是損傷修復必經的一個病理生理過程,也是下一步組織再生的先決條件[6-7]。近些年的研究發現SCI后機體產生的免疫反應具有神經保護作用[8],主動或被動用脊髓自身抗原免疫提高動物脊髓損傷后自身免疫T細胞的數量和活性能明顯增加損傷后神經元的存活和神經功能的恢復[9],調節性T細胞是一類自然產生的能控制體內自身免疫反應的T細胞亞群,對自身抗原有很高的親和力,通過直接接觸或分泌抗炎因子IL-10、TGF-β等抑制T細胞的增殖和活化[10]。相關研究表明[11-12],BCG具有非特異性免疫刺激作用,可誘導Treg生成,可誘導機體產生免疫反應,對機體具有免疫保護作用。

本研究結果顯示,模型組和BCG組的促炎因子IL-1β、TNFα及IL-6均較假手術組升高,BCG組促炎因子較模型組有下降;在抑炎因子IL-10,TGFβ的表達上,模型組抑炎因子較假手術組升高,說明BCG具有免疫調節及抗炎作用,進而調節SCI后的免疫炎癥反應。既往研究[3]表明,SCI后最早參與反應的是脊髓固有的小膠質細胞,活化的小膠質細胞形態由靜息狀態的高度分枝樣變為阿米巴樣,吞噬清理組織碎片,并分泌多種促炎因子,如IL-1β、TNFα、IL-6等,作用于血管內皮細胞、神經元和膠質細胞上的相應受體,刺激炎癥介質的表達,募集外周血源性免疫細胞進入損傷區,同時啟動并維持適應性免疫反應[13-14]。有學者研究發現SCI后給予TNF-α抑制劑或通過TNF-α的基因敲除可改善運動功能、減少細胞凋亡和組織損傷并降低與SCI有關的炎癥反應[15];IL-10與其抗體結合對神經元產生保護作用[9,16-17];IL-6在創傷性中樞神經系統損傷中起重要作用,是SCI后急性和亞急性期最常見的促炎細胞因子之一[18];TGF-β細胞因子是有效的人類免疫調節劑,TGF-β信號傳導可以將CD4+細胞轉化為Treg ,早期應用TGF-β可拮抗TNF-α的促炎作用,減輕活化的單核巨噬細胞介導的繼發性損傷[10]。研究[12]表明,BCG具有免疫調節及抗炎作用,調節炎癥反應中免疫因子變化,抑制相關細胞免疫反應。本研究中,HE染色顯示BCG治療組炎癥細胞較模型組減少、空洞較模型組減小,結構排列較模型組完整。術后大鼠后肢BBB評分結果也顯示BCG治療組優于模型組,充分說明BCG可能具有免疫調節及抗炎作用,進而對損傷的脊髓有保護作用。

綜上所述,卡介苗可通過對調節性T細胞的表達,并進一步調節SCI后的炎癥反應,可能在一定程度上對大鼠SCI具有保護作用。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過貴州省骨科醫院倫理委員會批準(20220512),為動物實驗,故知情同意免除。