泰山黃精寄生真菌的分離鑒定

穆淑媛 付均惠 秦 寧 董 斌 龐獻偉 仉 勁

黃精（Polygonatum sibiricumRed.）， 又 名 老 虎姜、仙人余糧，為百合科黃精屬多年生草本植物，是泰山四大名藥之一，在國內享有盛譽。黃精以其根莖入藥，具有補氣養陰、健脾潤肺、益腎的功效，在我國已有2 000 多年的藥用歷史。 其根莖富含多糖、脂肪、蛋白質、胡蘿卜素、維生素等，兼具藥用和食用價值， 國內研發了多種具有保健功能的黃精食品、飲品、護膚品等。目前在四川、貴州、安徽、河南、遼寧等地已有規模化人工栽培，山東泰安、威海等地也得到快速發展。但隨著集中栽培規模的不斷擴大，黃精病害也日益嚴重，影響了黃精的產量和質量。已報道的黃精病害主要有葉斑病、炭疽病、葉枯病、根腐病、花腐病、病毒病等，以真菌病害為主，但目前對泰山黃精病害的研究較少。 筆者對泰安市林業局實驗林場人工栽培的泰山黃精的寄生真菌進行了分離與鑒定，為病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 2021 年6 月，在泰安市林業局實驗林場黃精栽培基地采集泰山黃精病株7 株。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離 將不同癥狀的病葉、 病根用清水清洗晾干后，用75%酒精浸沒消毒30 s，0.1%升汞浸沒消毒1 min，無菌水清洗3 遍，用無菌吸水紙吸取葉片水分后， 剪取病健交界部放到PDA 培養皿上，28 ℃避光培養3~5 d， 觀察同一培養物上長出的菌落顏色、形狀等是否相同，若有則進一步分離純化，直至長出單一菌落。

1.2.2 形態學鑒定 觀察PDA 培養基上菌落的顏色、形態變化，并在光學顯微鏡下觀察記錄孢子形態特征。 查閱《真菌鑒定手冊》等，初步鑒定菌株種類。

1.2.3 分子生物學鑒定 用真菌基因組DNA 提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）提取菌株的基因組DNA。 ITS 序列PCR 擴增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL ITS1、1 μL ITS4、0.25 μL Taq 酶、1 μL DNA 模板，17.25 μL ddH2O。 擴增程序：94 ℃4 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，33 個循環，72 ℃10 min，4 ℃保存。 ITS 序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 的合成及PCR 反應產物測序均由深圳華大基因科技服務有限公司完成。通過NCBI-Nucleotide BLAST 分析測序結果， 以相似度最高的序列作為參考序列，根據Per.Ident 值確定目的菌株分類地位。

2 結果與分析

2.1 寄生真菌分離結果 從采集樣品中共分離出18皿真菌（圖1），對分離出的寄生真菌菌落形態特征觀察記錄并統計（表1），分析可知，18 株菌株可歸為11組。

表1 泰山黃精寄生真菌的菌落數統計和菌落形態

圖1 泰山黃精寄生真菌的菌落形態圖

2.2 分子生物學鑒定結果 由表2 可知， 各菌株ITS 序列與參考序列的相似值均超過99%， 可初步認定為同一種。 綜合分析表1~2、圖2 可知，分離出鏈格孢屬真菌共7 株，占菌落總數的38.89%，其中包括細極鏈格孢菌2 株，交互鏈格孢菌5 株；分離出刺盤孢屬真菌共6 株，占菌落總數的27.78%，其中包括旋卷蔥刺盤孢菌2 株、山茶刺盤孢菌2 株、膠孢炭疽菌1 株； 鐮刀菌屬真菌2 株， 占菌落總數的11.11%；此外還分離出聚生小穴殼菌、高粱附球菌、Diaporthe eres、數絲頂多毛孢各1 株。

表2 寄生真菌ITS 序列在NCBI 庫中的比對結果

因此，可初步認定，泰安市林業局實驗林場人工栽培黃精的優勢寄生種為鏈格孢屬真菌和刺盤孢屬真菌， 且有包括鐮刀菌在內的其他多種寄生真菌混合侵染。

3 討論與結論

本研究確定泰山黃精的葉部病害主要致病菌為鏈格孢屬和刺盤孢屬真菌。 刺盤孢屬真菌能引起黃精炭疽病，但對葉斑病病原菌研究有不同觀點，主要認為葉斑病的病原菌有交互鏈格孢菌（A.alternata）、細極鏈格孢菌（A.tenuissima）、葉點霉屬（Phyllostictasp. sp）等。 因此，根據本次分離鑒定結果和發病癥狀，初步認為鏈格孢菌侵染泰山黃精引起葉斑病、刺盤孢屬真菌引起黃精炭疽病， 在防治泰山黃精病害時，應以鏈格孢屬和刺盤孢屬真菌為主，篩選敏感藥劑，提高防治效果。