尿足細(xì)胞標(biāo)記物在特發(fā)性膜性腎病診療中的研究進(jìn)展

楊文正 葛 俊 劉 航 劉 曄 王 凱 柳曉明

濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東煙臺 264100

△濱州醫(yī)學(xué)院2022級內(nèi)科學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生

尿足細(xì)胞標(biāo)記物指尿液中來自足細(xì)胞各結(jié)構(gòu)的特異性靶標(biāo)，包括裂孔隔膜、腎小球毛細(xì)血管基底膜和細(xì)胞骨架蛋白，以及相應(yīng)的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA），可以通過蛋白質(zhì)印跡法和mRNA定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法進(jìn)行檢測[1]。特發(fā)性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是腎病綜合征的一種重要病理類型，近年來在我國原發(fā)性腎小球疾病中的比例仍在增加[2-3]，約40%患者十年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病[4]。目前研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與自身抗體攻擊足細(xì)胞相關(guān)，需要長期免疫抑制治療，因此其早期診斷和病情監(jiān)測十分關(guān)鍵[5]。現(xiàn)階段確診IMN主要依賴腎組織活檢[6]，但因有創(chuàng)檢查患者接受率低、IMN合并癥風(fēng)險(xiǎn)大而推廣受限。同時(shí)IMN多起病隱匿，且常用指標(biāo)如尿蛋白、血清肌酐、血清抗體等在早期診斷和病情監(jiān)測方面亦存在局限。尿足細(xì)胞標(biāo)記物檢測作為一種非侵入性指標(biāo)，可以對足細(xì)胞進(jìn)行直接監(jiān)測，具有無創(chuàng)、便捷、敏感的特點(diǎn)，可以用來輔助早期診斷和療效觀察，幫助解決IMN早期多漏診、病程難監(jiān)測的問題。隨著技術(shù)發(fā)展，尿足細(xì)胞標(biāo)記物的研究也取得了長足的進(jìn)步，本文將深入探討這方面的最新發(fā)現(xiàn)，以期為臨床實(shí)踐提供有價(jià)值的指導(dǎo)。

1 IMN與尿足細(xì)胞標(biāo)記蛋白

正常足細(xì)胞足突分為基底部、頂部以及與相鄰足細(xì)胞間的裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）三部分[7]。目前認(rèn)為IMN主要機(jī)制是針對足細(xì)胞表面靶抗原的自身抗體形成免疫復(fù)合物（immune complexes，ICs），介導(dǎo)補(bǔ)體激活形成膜攻擊復(fù)合物，造成足細(xì)胞損傷并表現(xiàn)為蛋白尿[5]。因此對上述足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行監(jiān)測可以反映足細(xì)胞損傷[8]，包括對特異性標(biāo)記蛋白本身、標(biāo)記蛋白相關(guān)RNA、標(biāo)記蛋白外泌體等進(jìn)行檢測。常用的檢測方法包括流式細(xì)胞術(shù)法、ELISA法、免疫熒光法、免疫透射比濁法。其中最準(zhǔn)確的方法是免疫熒光細(xì)胞培養(yǎng)法，但因耗時(shí)較長，識別細(xì)胞困難[9]，不適用于長期疾病監(jiān)測。與直接檢測標(biāo)記蛋白相比，檢測其特異性mRNA可以定量，具有更高的臨床價(jià)值。

2 常用尿足細(xì)胞標(biāo)記物

2.1 頂端細(xì)胞蛋白

頂端膜區(qū)蛋白分子主要包括Podoplanin和足細(xì)胞標(biāo)記蛋白（Podocalyxin，PCX）。研究表明[10]，腎臟缺血再灌注損傷后，小鼠尿液中Podoplanin濃度增加，因此該分子可作為新型生物標(biāo)記物，但目前尚無相關(guān)臨床研究。PCX是一種定位于腎小球足細(xì)胞頂端細(xì)胞提供電荷排斥維持濾過通道的跨膜蛋白[11]。1984年Kerjaschki等[12]發(fā)現(xiàn)PCX是足突細(xì)胞細(xì)胞膜或糖蛋白外層的主要組成部分，從此PCX開始成為在各類組織中檢測足細(xì)胞的特異性蛋白。隨后Hara等[13]用免疫熒光法檢測腎臟組織和尿液中的PCX以追蹤其來源，發(fā)現(xiàn)尿中PCX明顯多于腎組織中，電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)镻CX來自受損的腎小球。據(jù)此推斷尿PCX（urinary Podocalyxin，u-PCX）的含量與腎小球的急性期損傷正相關(guān)，并在后續(xù)臨床研究[14]中得以證實(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)u-PCX是來源于損傷的足細(xì)胞，而非尿中的脫落足細(xì)胞，且其升高早于尿微量白蛋白。現(xiàn)今u-PCX因檢測方法多樣、靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)現(xiàn)已成為最常用的尿足細(xì)胞標(biāo)記蛋白[15]，在多型腎病中都有廣泛應(yīng)用[16-17]。Imaizumi等[18]基于u-PCX建立的IMN診斷模型敏感度為80.5%，特異度為73.5%，在IMN的早期診斷方面具有很高的價(jià)值。Mella等[19]建立了u-PCX評分以監(jiān)測疾病活動(dòng)情況，但由于晚期耗竭的影響，該指標(biāo)更適合用于非晚期患者的病情監(jiān)測[13]。此外PCX也參與胚胎發(fā)育和癌癥轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞黏附和遷移過程，致使其低水平表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞[20]，因而其特異性仍待進(jìn)一步研究。

2.2 骨架蛋白與SD相關(guān)蛋白

Synaptopodin是一種足細(xì)胞的骨架蛋白，是維持足細(xì)胞形態(tài)和穩(wěn)定性的重要蛋白。研究表明[21]，腎小球腎炎患者尿Synaptopodin與血肌酐升高有關(guān)，與尿白蛋白排泄無關(guān)，因此它比傳統(tǒng)指標(biāo)更敏感，可獨(dú)立評估腎小球的損害情況。且尿液中Synaptopodin的含量可以反映膜性腎病活動(dòng)程度，對預(yù)后評估有一定的幫助[22]。SD相關(guān)蛋白主要包括Nephrin與Podocin，既往研究認(rèn)為Nephrin僅表達(dá)于腎組織，但后續(xù)研究指出，尿Nephrin mRNA水平與腎功能下降率相關(guān)，可預(yù)測膜性腎病的進(jìn)展[23-24]。Podocin也有類似研究，Wickman等[25]發(fā)現(xiàn)在疾病活動(dòng)期，尿足細(xì)胞Podocin mRNA升高，疾病緩解時(shí)恢復(fù)到基線，蛋白尿和足細(xì)胞尿之間的關(guān)聯(lián)因腎小球疾病類型不同而有顯著差異，因此亦可以監(jiān)測IMN活動(dòng)性。在檢測方法方面，B?chor等[26]通過液相色譜-質(zhì)譜-多反應(yīng)監(jiān)測（LC-MS-MRM）法更靈敏的檢測Podocin胰蛋白肽，這使得定量分析監(jiān)測膜性腎病活動(dòng)性更可靠。依目前研究，尿中骨架蛋白與裂孔隔膜相關(guān)蛋白可用于評估膜性腎病嚴(yán)重程度、腎小球?yàn)V過膜損傷程度，并對預(yù)后評估具有一定幫助，但相較于PCX它們的敏感度和特異度還需要進(jìn)一步研究[27]。

2.3 尿足細(xì)胞外微粒檢測

尿細(xì)胞外微粒（microparticles，MPs）是一類由泌尿系細(xì)胞釋放到胞外的囊泡狀結(jié)構(gòu)，含有蛋白及核酸成分，并由脂質(zhì)雙分子層包裹。按van der Pol等[28]分類，可分為外泌體、微囊泡（microvesicles，MV）以及凋亡小體（apoptotic bodies，ApoBDs）。MPs檢測時(shí)去除了細(xì)胞和細(xì)胞碎片等成分，與全尿檢測意義可能存在不同。目前研究認(rèn)為足細(xì)胞的激活和損傷都可能產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡[29]，足細(xì)胞常用的標(biāo)記蛋白基本都可以在MPs中檢測到，且足細(xì)胞MPs的出現(xiàn)早于白蛋白尿的產(chǎn)生[30]。但有研究曾指出，除糖尿病腎病外其他腎小球疾病的PCX在MPs中無法檢測到[31]，其原因可能需要進(jìn)一步探索。雖然檢測技術(shù)復(fù)雜，但MPs內(nèi)的蛋白質(zhì)較尿液中更穩(wěn)定[30]，可能是更可靠的標(biāo)記物，已有研究利用多種尿MPs RNA計(jì)量變化聯(lián)合評估IMN的危險(xiǎn)性和預(yù)后[32]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IMN患者與健康人之間尿MPs miRNA譜存在顯著差異[33]，可以對疾病進(jìn)行診斷、監(jiān)測和分層[34]，雖然其中一些RNA是否來源于足細(xì)胞、與疾病危重程度關(guān)系尚不明朗，但都有作為IMN新型生物標(biāo)記物的潛力。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，目前監(jiān)測足細(xì)胞損傷的傳統(tǒng)檢查方法仍存在經(jīng)濟(jì)性、準(zhǔn)確度和敏感度的不足。尿液中的足細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物可以彌補(bǔ)上述不足，可能是更為適當(dāng)?shù)姆乔秩胄员O(jiān)測工具，根據(jù)相關(guān)模型不僅能監(jiān)測IMN病情變化還有一定診斷價(jià)值。現(xiàn)階段雖然相關(guān)標(biāo)記蛋白已成為最常用的尿液足細(xì)胞標(biāo)記物之一，但標(biāo)記蛋白mRNA檢測可能是早期檢測和監(jiān)測足細(xì)胞損傷的更好方法。尿MPs標(biāo)記物檢測更具特異性，但其在膜性腎病中的意義仍需繼續(xù)研究。未來，探索更具特異性和敏感性的無創(chuàng)足細(xì)胞損傷標(biāo)記物有望成為重要趨勢，其在腎小球疾病的診斷、監(jiān)測及研究疾病發(fā)生機(jī)制方面都將發(fā)揮重要作用。