羅漢果甜苷提純工藝優化研究

＊張延飛 馮茂財 賈如輝 賀志壯 趙吉合

（1.中國科學院青島生物能源與過程研究所 山東 266101 2.青島農業大學 山東 266101 3.山東省青島第六十七中學 山東 266101 4.青島浩然海洋科技有限公司 山東 266101）

引言

羅漢果甜苷無毒性[1-3]，具有降低血糖[4]、治療肺部炎癥[5-7]、抗氧化[8]、抗菌[9]、保護肝臟[10]等多種生理活性和功效。因此其分離純化引起了研究者的廣泛關注。

目前所報道的提取方法主要有水提取法、超聲提取法、微波提取法和閃式提取法等[11]。水提取法主要使用水、乙醇或者兩者的混合作為溶劑進行提取。如閆家瑋等[12-13]將羅漢果水煮后，用不同的膜或大孔吸附樹脂對羅漢果浸出液進行分離濃縮，獲得了較高的產品收率。朱曉韻等[14]采用微波技術進行了羅漢果甜苷的提取，結果表明，微波提取法的效率明顯優于常規水煮法。劉振洋等[15-16]利用閃式提取法進行羅漢果甜苷的提取，利用正交試驗法進行了工藝優化，得到羅漢果甜苷的純度達到92%以上。但在羅漢果甜苷提取研究中，存在較多干擾成分，如脂肪、蛋白、黃酮等含量較多，嚴重影響了甜苷質量。

本研究主要針對羅漢果甜苷提取中的脂肪、蛋白等干擾組分，選擇成本較低的水提技術作為對比，采用有機溶劑索氏提取脂肪和堿沉蛋白的方法，丙酮做為索氏提取劑，Ca(OH)2作為澄清劑和蛋白質變性劑，使用大孔樹脂作為提純物質，優化了溶劑、料液比和樹脂等條件，得到羅漢果甜苷在此條件下的最佳產率為81.1%。

1.試驗部分

(1)試驗試劑

Ca(OH)2（95%）、濃硫酸（95%～98%）、石油醚（90%）、丙酮（99.5%）、活性炭、732強酸苯乙烯陽離子交換樹脂、NaCl（99%）、香蘭素（99%），國家集團化學試劑有限公司；無水乙醇（99.7%），天津市富宇精細化工有限公司；YKD151大孔丙烯酸陽離子交換樹脂，天津允開樹脂科技有限公司；硅膠（粒度200～300），青島海洋化工；牛血清蛋白（99%），Biosharp公司。

(2)試驗儀器

紫外/可見分光光度計（5100型），上海元析儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-4），友誠新能源有限公司；數控超聲波清洗器（KQ-300DE型），昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機（Neofuge 15R），力康生物醫療科技控股有限公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9203A），上海精宏實驗設備有限公司；高效液相色譜儀（U3000），美國賽默飛世爾科技。

(3)甜苷分離

選取300mL玻璃柱，分別裝入柱高1/3的大孔丙烯弱酸陽離子樹脂和強酸苯乙烯陽離子樹脂，上層用0.5cm厚的硅膠封柱。將試管中的提取液2.5mL加入色譜柱中，用60%的乙醇溶液洗脫。用錐形瓶接收洗脫液，觀察柱子的下口滴出有顏色的瞬間，更換干凈的錐形瓶，持續滴加乙醇溶液，直到下口滴出顏色變為無色，等乙醇溶液下降至硅膠表面時，更換新的錐形瓶同時純水繼續洗脫，等顏色變為無色。將洗脫液放于蒸發皿中待溶液蒸發，得甜苷樣品粉末。

(4)甜苷和蛋白檢測

甜苷檢測：準確稱取0.200g甜苷對照品，溶解定容100mL，得2mg/mL溶液。使用移液槍移取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5.0mL羅漢果甜苷的對照溶液于50mL容量瓶中定容，得0.08mg/mL、0.10mg/mL、0.12mg/mL、0.14mg/mL、0.16mg/mL、0.18mg/mL、0.20mg/mL溶液。再分別稀釋100倍后裝入離心管待用。把50mL的濃硫酸緩慢加入10mL水中，等待冷卻至室溫，加入1.0g香蘭素并攪拌，使其完全溶解。加入5mL顯色劑到離心管中沸水中加熱1h。比色皿中加入標準溶液，制作標準曲線。如圖1所示，線性回歸方程a＝3.9125x＋0.20679，R2＝0.9975。然后依次加入樣品溶液，并記錄數據，計算樣品含量。

圖1 甜苷的標準曲線和蛋白的標準曲線

蛋白檢測：按照50體積BCA試劑加1體積Cu試劑配制成BCA工作液，充分混勻。用蒸餾水稀釋100μL到1mL，得到濃度為0.5mg/mL的牛血清蛋白標準液。分別配置0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的牛血清蛋白標準溶液200μL，將配制好的待測蛋白溶液與2mL的BCA工作液混合后立即搖勻，在37℃下放置15～30min，將反應完全的試劑倒入比色皿中，用紫外可見分光光度計測562nm處的吸光度制作標準曲線，標準曲線的方程y=2.7751x+0.0364，R2=0.9948。將第一次水煮只經過Ca(OH)2處理和最終所得到的樣品液兩份樣品200μL加入2mL工作液，在37℃下反應15～30min，待反應完全，用分光光度計測定562nm處的吸光度，根據標準曲線計算蛋白質含量。

2.結果與討論

(1)溶劑對去除脂肪的影響

本實驗采用石油醚和丙酮分別進行索氏提取，脂肪去除率的計算公式為：X=（m1-m0）/m2×100%（X指的是在提取條件下，每百克的脂肪的總含量，以g/100g的形式計算；m1是在這種條件下，樣品與濾紙包的總質量，以g計算；m0是在這種條件下，去掉濾紙包之后，樣品的總質量，以g計算；m2則是在沒有進行任何改變之前，樣品與濾紙包的總質量，以g計算。）計算所得石油醚和丙酮提取脂肪率分別為：

由上式可知，丙酮在提取羅漢果的脂肪方面要強于石油醚。

(2)溶劑對糖苷提取的影響

在索氏提取中使用了石油醚和丙酮兩種極性不同的物質和不使用索氏提取三種方法作為對照。由圖2可知使用丙酮提取效率最好，使用水煮的方法次之，效果最差的是使用石油醚提取。但是當料液比低于1:10時石油醚效果強于水煮，三者都是在料液比為1:15時提取量最高，使用丙酮的料液比為1:15和1:20的提取效果相差不大。

圖2 不同溶劑提取的糖苷的吸光度

圖3 不同料液比下強弱離子樹脂對糖苷提取的影響

(3)提取次數的影響

對羅漢果粉末進行三次水煮提取，采用強酸苯乙烯陽離子樹脂分離提取液，測得不同料液比下的吸光度如圖4所示。結果表明，第一次水煮所得出的含量數值很高，且當料液比為1:15時遠高于其1:5、1:10和1:20這三種情況的吸光度，當水煮次數超過三次之后，其吸光度基本消失，在1:20時提取不完整，在水煮第四次仍有部分吸光度。因此三次提取效果較佳。

圖4 水煮次數對糖苷提取的影響

3.結論

本實驗針對羅漢果甜苷提取中脂肪、蛋白等干擾組分，探索了索氏溶劑提取的條件。得出最優方法是使用丙酮做提取劑，料液比為1:15，水煮溫度為65℃，水煮3次，加入Ca(OH)2作為澄清劑和蛋白質變性劑，使用強酸性離子交換樹脂作為提純物質，得出產率最佳為81.1%。