NAD依賴性蛋白脫乙酰酶Sirtuin-3對糖尿病心肌病影響及機制

武瀚林, 楊晢銘, 王 靜, 布雨鑫, 王雅妮, 劉 丹

1.大連醫(yī)科大學,遼寧 大連 116044;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內科,遼寧 沈陽 110016

糖尿病是一種以高血糖為特征的多因素代謝疾病,根據世界衛(wèi)生組織的數(shù)據,到2025年,糖尿病患者的數(shù)量預計將達到3.33億[1-2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者最重要的心血管并發(fā)癥之一[3-5]。DCM病理機制復雜,高脂和高糖刺激可通過活性氧系統(tǒng)損傷心肌細胞而誘發(fā)DCM[6]。減輕心肌細胞的氧化應激損傷對DCM的治療有著重要意義。NAD依賴性蛋白脫乙酰酶Sirtuin-3(NAD-dependent protein deacetylase Sirtuin-3,Sirt3)是線粒體中的去乙酰化修飾酶,主要對線粒體的結構和功能進行調節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),Sirt3可抑制活性氧產生和細胞凋亡[7-8],還會對心血管疾病和代謝控制具有深遠的影響[9]。本研究旨在探討Sirt3對DCM的影響及其相關機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6只8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自江蘇集萃藥康公司。將小鼠分入正常組和DCM模型組,每組各3只。DCM模型組:高脂飲食(脂肪提供總熱量的60%;中國協(xié)同生物)喂養(yǎng)小鼠4周后,連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲菌素20 mg/(kg·d),鏈脲菌素累積劑量為100 mg/kg。正常組:正常飲食(脂肪提供總熱量的10%;中國協(xié)同生物),腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液5 d。糖尿病模型建立成功的標準是小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L。高脂飲食喂養(yǎng)28周為實驗終點。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 H9C2細胞培養(yǎng)及siRNA轉染 大鼠心肌細胞系H9C2購自上海富衡生物科技有限公司。H9C2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。用300 μmol/L的棕櫚酸(palmitic acid,PA;美國Sigma-Aldrich公司)刺激H9C2細胞24 h來構建心肌細胞脂毒性模型。將PA處理過的細胞納入PA組,未處理過則納入對照組。當細胞密度達到80%時進行Sirt3的干擾RNA(si-Sirt3)和對照試劑(si-con)轉染,轉染24 h后給予PA刺激24 h并收集細胞。將細胞按照處理方式不同分入4組:si-con組,si-Sirt3組,si-con+PA組,si-Sirt3+PA組。

1.3 Western blot 用RIPA緩沖液裂解提取心肌組織和H9C2細胞總蛋白。等量的蛋白質通過SDS-PAGE分離1 h,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與兔抗Sirt3(1∶1 000)、兔抗超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)(1∶1 000)、兔抗ac-SOD2(1∶1 000)、兔抗GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育過夜。孵育后,洗凈膜,用山羊抗兔IgG (1∶2 000)在室溫下孵育2 h,洗凈膜,增強型化學發(fā)光試劑曝光,分析數(shù)據。

1.4 DHE染色 在培養(yǎng)的H9C2細胞上清中加入DHE工作液(10 μmol/L),37℃避光孵育30 min。孵育后,用PBS洗滌掉未被吸附的DHE。熒光顯微鏡下觀察DHE染色情況。

2 結果

2.1 正常組及DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平比較 與正常組比較,DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平比較

2.2 對照組及PA組細胞中Sirt3蛋白水平比較 與對照組比較,PA組細胞中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和PA組細胞中Sirt3蛋白水平比較

2.3 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細胞中SOD2乙酰化水平比較 與si-con組比較,si-con+PA組ac-SOD2/SOD2水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與si-con+PA組比較,si-Sirt3+PA組ac-SOD2/SOD2水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細胞中SOD2乙酰化水平比較

2.4 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細胞中活性氧水平比較 與si-con組比較,si-con+PA組活性氧水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與si-con+PA組比較,si-Sirt3+PA組活性氧水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細胞中活性氧水平比較

3 討論

脂肪酸代謝失調通過各種機制和信號通路使心肌細胞及其間質纖維化,促進心室重構、肥大,導致心律失常和心力衰竭,介導DCM的發(fā)生和發(fā)展[10]。高脂刺激能夠引起細胞脂毒性,產生大量活性氧,活性氧會直接損傷心肌細胞,誘發(fā)DCM[11-12]。

Sirt3是哺乳動物Sirtuin蛋白家族的成員[13-14],表現(xiàn)出NAD依賴性脫乙酰酶活性。既往研究報道,Sirt3在心血管疾病中發(fā)揮重要作用:在心肌肥厚中,Sirt3能夠維持線粒體功能,保護心肌細胞;心力衰竭直接與Sirt3的活性受損相關;心肌缺血再灌注損傷導致的Sirt3活性下降可能是心肌損傷的關鍵原因;在動脈粥樣硬化中,Sirt3發(fā)揮抗氧化功能,保護心肌細胞[15-16]。本研究結果顯示:與正常組比較,DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這提示,Sirt3在DCM的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。本研究結果還顯示:在H9C2細胞中,PA刺激會使Sirt3蛋白水平降低、SOD2乙酰化水平升高,在敲低Sirt3后,SOD2乙酰化水平進一步提升。這些結果說明,Sirt3是通過調控SOD2乙酰化水平來參與氧化應激調控的。進一步檢測活性氧水平發(fā)現(xiàn),在H9C2細胞中,PA刺激會使活性氧水平升高,在敲低Sirt3后,活性氧水平進一步提升。這證明了Sirt3在調控活性氧水平中的重要作用。

綜上所述,Sirt3可通過SOD2的去乙酰化消除心肌細胞中的活性氧,減少心肌細胞氧化應激損傷,在DCM的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。