犬遺傳病基因篩查的研究與應用

余傳剛 李 濤 魏榮興 李 強

近代以來，犬在軍事戰(zhàn)爭、刑事偵查、消防安全、搶險救災和維穩(wěn)導盲等領域發(fā)揮著不可替代的作用。為維持品相、性能和血統(tǒng)等特征，在犬培育過程中常采用近交純繁的方式，促使犬遺傳病頻發(fā)，且發(fā)病后致死率和致殘率極高。目前，遺傳病已成為危害犬身心健康和工作質量的重要因素，給養(yǎng)犬機構的繁育工作和工作犬培訓工作帶來嚴重阻力。遺傳病基因篩查技術可對犬遺傳病決定基因和關鍵位點進行檢測診斷，在發(fā)病前檢測出患病風險，做到早發(fā)現、早預警、早處置，用相對較小的成本，解決關鍵問題，從源頭上減少病犬產生，提高犬群質量。

一、犬遺傳病基因篩查技術簡介

犬遺傳病基因篩查技術是通過分析犬樣本細胞中的DNA 系列，檢測其是否存在相關的致病基因和突變位點。目前研究領域采用的遺傳病基因篩查技術主要有熒光定量PCR、基因芯片和高通量測序，實踐中需根據樣本遺傳信息、檢測成本和預期目標等合理選擇，充分發(fā)揮犬遺傳病基因篩查的作用和價值。

熒光定量PCR 技術是在常規(guī)PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個PCR 進程，最后通過Ct 值和標準曲線對起始模板進行定量分析。該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡單和成本低廉等特點，適合對已知致病基因或位點的單基因遺傳病進行檢測，如犬的垂體性侏儒癥、擴張型心肌病和肛門癤病等，但熒光定量PCR 可包含的基因數目受限，檢測病種相對較少。

基因芯片是利用堿基互補配對原則，在基片表面固定大量已知序列的核酸探針，通過與標記樣品分子雜交，然后檢測探針分子信號強度來獲取樣品分子數量和遺傳信息，從而確定待測樣本中是否存在目標基因?；蛐酒淮慰晒潭〝等f個探針，一次性完成多個樣本多種遺傳病篩查，具有高通量、高效率和高自動化的特點，在犬遺傳病篩查上具有獨特的運用前景和商業(yè)價值。

高通量測序技術又被稱為二代測序技術，其主要包含了Panel 測序、全外顯子組測序和全基因組測序。目前在遺傳疾病篩查實踐中運用最廣的是Panel 測序，Panel 測序可由檢測機構根據需要自由組合基因種類、數量，并且一次檢測的基因和位點數量可從數種到數百種之多，具有針對性強、耗時較短和檢測成本較低等優(yōu)勢，但其也無法檢測未知致病基因和位點，同時相比致病基因的發(fā)現速度，存在一定滯后性。全外顯子組測序是利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區(qū)域DNA 捕捉并富集后進行高通量測序的方法，其優(yōu)勢在于檢測范圍廣和可檢測出未知致病基因，但不能獲得完整的基因組信息，檢測成本較高，還容易出現假陰性和假陽性，目前該技術用于犬遺傳疾病篩查存在一定局限性。全基因組測序是檢測遺傳病的終極手段,可獲得個體全部遺傳性息，其中不僅包含已發(fā)現的致病基因和位點，還有未知基因和位點的變異信息，但其也存在著成本高、耗時長且數據存儲分析難等問題，目前將它大規(guī)模用于犬遺傳病基因篩查存在很大挑戰(zhàn)。

二、犬遺傳病基因篩查研究應用

目前大部分品種的犬都有遺傳病高發(fā)傾向，尤其是在純種犬中。犬遺傳病涵蓋了呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、皮膚骨骼、腫瘤癌癥、心腦血管、眼部疾病等方方面面。如德國牧羊犬的髖關節(jié)發(fā)育不良、癲癇、胃脹氣、胰腺功能不全和皮膚??；吉娃娃犬的肛門囊炎、心臟病、干性角膜結膜炎、肺動脈狹窄和軟骨發(fā)育不全；貴賓犬的白內障、青光眼、進行性視網膜萎縮、甲減和隱睪；羅威納犬的幼年白內障、肘關節(jié)發(fā)育不良、瓣膜下狹窄、髖關節(jié)發(fā)育不良和肥厚性心肌病等。

近年來，經過世界各地犬類研究人員的不懈努力，大量犬遺傳疾病的決定基因和關鍵變異位點被成功定位解析。如2019 年白靜等人針對已報道的與犬髖關節(jié)發(fā)育不良顯著相關的15 個SNP 位點進行檢測分析，確定COL6A3（CFA25:51040259）、FN1（CFA37:25095511）和COL1A2（rs22356416）三個基因位點可作為篩選髖關節(jié)發(fā)育不良（CHD）病犬的基因標記；特發(fā)性癲癇（IE）是犬常見神經系統(tǒng)疾病，早在2012 年Seppa¨ la¨ EH 等人已證實ADAM23 是一種導致比利時牧羊犬患IE 的風險基因，2017 年Koskinen LLE 等人通過對8 個犬種的全基因組關聯分析，進一步支持ADAM23 在多個犬種中作為特發(fā)性癲癇常見風險基因的作用，2020 年Belanger J M 等人為進一步探索影響比利時牧羊犬IE 的其他基因座，通過GWAS 分析確定了CFA14 和CFA37上兩個相互作用的基因座，強化了之前關于CFA37 基因座(ADAM23)參與的發(fā)現，并表明CFA14 上的另一個相互作用基因座與犬的IE 相關;患擴張型心肌?。―CM）的犬通常會有呼吸急促、運動不耐受、嗜睡、厭食、咳嗽和干嘔等癥狀，是犬類心臟病中常見病癥，2012 年Meurs K M 等人證實杜伯文犬家族性擴張型心肌病與PDK4 基因中剪接位點缺失有關，2017 年Taggart K 等人證明了PDK4 在營養(yǎng)利用率較低時引起細胞凋亡，促使心臟重塑，最終導致擴張型心肌病。

大量犬遺傳病決定基因和關鍵變異位點的解析定位使犬進行遺傳病普遍篩查不再是難題，通過將這些已發(fā)現的基因、位點進行整合，合理設計引物，可快速高效檢測出個體有無相關的遺傳病。目前國內外均有相關的檢測產品問世，如深圳深知生物科技有限公司研發(fā)了一款犬類多重遺傳病篩查試劑盒，可同時檢測髖關節(jié)發(fā)育不良、肘關節(jié)發(fā)育不良、白血病和漸進性視網膜萎縮等71個疾病位點信息；美國偉思寵物基因檢測（Wisdom Panel）開發(fā)了一款基因檢測芯片，其不僅可對犬祖源信息、性狀特征進行檢測，還能針對犬的29 種遺傳病進行篩查。

三、討論與展望

隨著基因檢測技術不斷創(chuàng)新以及遺傳病基因篩查相關研究不斷開展，犬遺傳病的決定基因和關鍵位點被不斷識別定位，大批量進行犬遺傳病的早期檢測成為可能。遺傳病基因篩查技術的運用推廣能極大降低因遺傳病給養(yǎng)犬機構繁育和工作犬培訓工作造成的人力、財力、物力和時間上的損失，減少后期資源浪費，以相對較少的成本，解決關鍵問題。相信在遺傳病基因篩查技術輔助下，犬遺傳病高發(fā)現象能得到有效遏制。