無醇酵母的篩選及其發酵性能研究

萬秀娟，姜宗祥，趙玉祥，陳 嶸，賀 揚

（青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東青島 266100）

隨著人們對酒精危害認識的加深，以及消費者對健康的關注越來越多，無醇啤酒漸漸走進人們的生活，受到消費者的青睞[1]。與傳統啤酒相比，無醇啤酒的生產工藝流程具有較大差異，從而使得其口感與傳統啤酒存在差異。目前，生產無醇啤酒主要有兩大類的經典方法，分別是物理方法和生物方法。物理方法是在啤酒發酵結束后去除酒精，通常使用熱處理去除啤酒中的酒精（也就是脫醇），如真空蒸餾、膜過濾（透析、反滲透）等；生物方法是在發酵過程中盡量控制酒精的產生量，如冷接觸和限制發酵等[2]。使用特殊酵母進行無醇啤酒的生產是生物方法中的一種，這種方法主要是利用酵母對糖的利用情況不同，根據需要，可配合相應的糖化工藝，使得發酵后酒液的酒精含量較低，符合無醇啤酒的要求。與傳統釀造酵母相比，“特殊”酵母因無法發酵麥汁中的某些可發酵性糖，傾向于產生較少量的乙醇。例如已在商業上應用多年的非釀酒酵母Saccharomycodes ludwigii[3]。

本研究以Saccharomycodes ludwigii酵母TTNA-01 為對照酵母，通過糖利用試驗、酒花耐受試驗、酒精度、風味、成熟度等指標，進行無醇酵母的篩選，從多株酵母中篩選出1 株無醇酵母TTNA-05，通過發酵試驗，該酵母在原麥汁濃度7°P 時，發酵產生酒精濃度≤0.5 %vol，符合無醇啤酒的要求。并通過DOE 試驗對TTNA-01、TTNA-05 酵母進行發酵工藝優化，根據優化工藝，使用兩株酵母分別進行無醇啤酒的生產，所得無醇啤酒沒有麥汁味，TTNA-01 具有果香味，TTNA-05 具有輕微4-VG味，可作為新口味的無醇啤酒的生產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料及菌種：酵母，本公司保藏；麥芽、酒花，本公司使用。

耗材：30 %異構α-酸鉀鹽酒花浸膏，巴特哈斯；YPD 培養基，生工；新型微生物微量生化鑒定管，環凱生物。

儀器設備：離心機，英國SIGMA 公司；顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；渦旋振蕩器，IKA 公司；Lambda 2S 分光光度計，PERKIN ELMER 公司；培養箱，德國賓德；啤酒全自動分析儀，奧地利ANTON PAAR公司；氣相色譜儀，美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥汁制備

麥芽粉碎后與水按照料水比1∶4 混合，首先在50 ℃糖化40 min，同時開始攪拌，隨后升溫至70 ℃進行第二段糖化，用碘液檢驗糖化程度，直到碘液與糖化液不發生藍色反應，糖化結束。煮沸過程分三次添加酒花，添加量為0.08 %，第一次在麥汁煮沸10 min 時，加入總量10%，第二次在煮沸35 min時，加總量50 %，第三次在煮沸70 min 時，加入總量40%。一共煮90 min。

1.2.2 酵母擴培

酵母擴培流程：酵母活化—小試管培養（5 mL）—大試管培養（10 mL）—小三角瓶（220 mL）—大三角瓶（2200 mL）—酵母回收。

將待測酵母活化后分別接入小試管、大試管、小三角瓶、大三角瓶進行培養，25 ℃，36 h。將大三角瓶中培養好的酵母降溫至4 ℃澄清4 h，倒去上清液于4000 r/min離心10 min，進行酵母回收。

1.2.3 酵母糖利用實驗

將活化好的酵母取50 μL 分別加入到含有不同碳源的微生物微量生化鑒定管中，加全塞，25 ℃培養1～3 d 觀察顏色變化（根據顏色變化情況確定酵母是否能夠利用該種碳源）。

1.2.4 酵母酒花耐受實驗

將活化好的酵母按照1∶100 的比例添加到不同苦味值的YPD 培養基中，每梯度進行平行試驗，25 ℃培養3 d，檢測OD 值（通過OD 值的變化來判斷酵母在該苦味值下的生長情況），每組試驗進行3次平行。

1.2.5 其他檢測

發酵度、酒精度測定：啤酒全自動分析儀檢測；雙乙酰含量的測定：氣相色譜法[4]；風味物質的測定：氣相色譜法[4]。

1.2.6 發酵試驗

2 L 發酵瓶中裝7 °P 麥汁1.6 L，接入酵母泥，使滿罐酵母數控制在10×106個/mL，20 ℃發酵。

1.2.7 無醇酵母DOE試驗及驗證

1.2.7.1 無醇酵母DOE試驗

為進一步了解TTNA-01、TTNA-05 酵母的發酵性能，確定最佳無醇啤酒生產工藝，設計實驗方案：酵母：TTNA-01、TTNA-05，實驗室擴培；麥汁：13°P 生產麥汁；發酵溫度：12～20 ℃；充氧量：180 r/min，10～30 min；發酵時間：3～5 d；酵母數：3×106個/mL～10×106個/mL；規模：0.5 L。

1.2.7.2 驗證試驗

通過該試驗驗證DOE 試驗確定的發酵工藝的準確性。試驗方案：采用DOE 試驗確定的酵母及工藝進行發酵試驗。

2 結果與分析

2.1 酵母糖利用

不同酵母對糖的利用情況是不同的，利用微生物微量生化鑒定管，鑒定酵母對麥汁中不同糖是否能夠利用，可以了解該酵母對糖的利用情況，初步判定酵母是否可以用于無醇啤酒的生產。

根據1.2.3 實驗方法對7 株酵母的糖利用情況進行檢測，檢測結果見表1。由表1 結果可看出不同酵母糖利用存在差異，TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04 僅能利用麥汁中的葡萄糖及果糖；TTNA-01、TTNA-05 酵母能利用麥汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖；TTNA-06、TTNA-07 能利用麥汁中的葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖。

表1 不同酵母可利用麥汁中糖的種類

2.2 酵母酒花耐受

因為收集的酵母，大部分都不是釀酒酵母，所以其對酒花的耐受能力是未知的，為了便于了解酵母的酒花耐受能力，更好的應用于啤酒生產，通過不同苦味值的（苦味質梯度設置為0 BU、10 BU、20 BU、30 BU、50 BU、100 BU）單因子試驗，確定7株酵母對酒花物質的耐受能力。

根據1.2.4 實驗方法對不同酵母不同苦味值下的生長情況進行檢測，將檢測結果取平均值減去空白后得到數據表2。

表2 酵母在不同苦味值下OD值

由表2 數據可以看出，TTNA-04 酵母在苦味值達到50 BU 時生長受到明顯抑制，其他6 株酵母在苦味值達到100 BU時生長情況無明顯影響。

2.3 發酵試驗

為了進一步確定酵母的發酵性能，篩選出優良的無醇酵母菌株，使用步驟1.2.2 回收的酵母進行2 L 發酵試驗，試驗中除添加酵母不同，麥汁、充氧及其他工藝控制均相同。

表3 是發酵后冷貯酒的發酵度、酒精度及成熟度指標，由表3 數據可以看出，采用7°P 無醇麥汁，5 株酵母TTNA-01、TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04、TTNA-05 酒精度在0.5 %vol 以下，符合無醇啤酒的要求；TTNA-06、TTNA-07 酵母酒精度在0.5%vol～2.5%vol 之間可以作為低醇酵母。酒液的發酵度、酒精度與酵母對糖的利用明顯相關。從成熟度數據來看，TTNA-01、TTNA-03、TTNA-05、TTNA-06成熟度較好。

表3 冷貯酒發酵度、酒精度及成熟度

表4 是不同酵母發酵后冷貯酒的風味指標，由表4數據可以看出，無醇酵母：TTNA-04酵母醇、酯產量非常低，經品評冷貯酒麥汁味明顯；TTNA-03酵母酯產量較高，經品評冷貯酒酯香過于突出，酒體不協調；TTNA-01、TTNA-05 酵母醇產量較高；低醇酵母：TTNA-06 酵母醇、酯產量均較高，TTNA-07醇產量較高。綜合發酵性能、風味指標及品評結果，TTNA-01、TTNA-05 較為適合生產無醇啤酒，TTNA-06酵母生產低醇啤酒較有優勢。

表4 冷貯酒醇酯檢測

2.4 無醇酵母DOE試驗

使用Minitab 軟件進行5 因子2 水平分辨度為V的試驗設計，試驗設計見表5。

表5 DOE試驗設計

表6 為DOE 試驗發酵結果，由表6 數據可以看出，所有發酵試驗的冷貯酒發酵度均在11%左右，當麥汁濃度7°P 時酒精度均≤0.5%，冷貯酒的成熟度指標可以接受。

表6 DOE試驗發酵數據

因發酵后酒精產量均能滿足無醇啤酒的要求，因此進行DOE 發酵試驗優化時不考慮酒精產量。當不考慮酒精產量時，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進行優化，優化結果見圖1，由圖1結果可以看出，采用TTNA-01 酵母，滿罐酵母數10×106個/mL，充氧10 min，20 ℃發酵5 d，該結果最優。

圖1 DOE試驗優化圖（包含TTNA-01、TTNA-05數據）

提取TTNA-01 酵母的發酵數據，針對TTNA-01 酵母不考慮酒精產量，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進行優化，得到優化結果見圖2，結果為滿罐酵母數10×106個/mL，充氧量10 min，20 ℃發酵5 d，與無醇酵母優化結果一致。

圖2 DOE試驗優化圖（僅TTNA-01數據）

提取TTNA-05 酵母的發酵數據，針對TTNA-05 酵母不考慮酒精產量，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進行優化得到優化結果見圖3，結果為滿罐酵母數7.5×106個/mL，充氧量10 min，20 ℃發酵5 d。

圖3 DOE試驗優化圖（僅TTNA-05數據）

通過進行菌種、酵母數、充氧量、發酵溫度、發酵時間5因子兩水平DOE試驗，分析數據優化得到工藝為：采用TTNA-01 酵母，滿罐酵母數10×106個/mL，充氧10 min，20 ℃發酵5 d。

針對TTNA-05 酵母數據進行分析，優化得到工藝為：滿罐酵母數7.5×106個/mL，充氧量10 min，20 ℃發酵5 d。

2.5 驗證試驗

酵母：TTNA-01、TTNA-05，實驗室擴培；麥汁：工廠麥汁；滿罐酵母數：TTNA-01 酵母10×106個/mL；TTNA-05 酵母7.5×106個/mL；工藝：充氧180 r/min，10 min，20 ℃發酵5 d。

規模：2 L。

驗證試驗結果如表7、表8 所示，由表7、表8 數據可以看出，當麥汁濃度7 °P 時，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有輕微4-VG 味，酒精度≤0.5%vol，符合無醇啤酒的要求。

表7 驗證試驗冷貯酒發酵度、酒精度及成熟度

表8 驗證試驗冷貯酒醇酯 (mg/L)

3 結論

綜合生理生化試驗結果、酒精度、成熟度、總醇、總酯等指標，TTNA-01、TTNA-05 酵母適合生產無醇啤酒。經過發酵工藝研究充分了解菌株性能，TTNA-01、TTNA-05 酵母在滿罐酵母數3×106個/mL～10×106個/m，發酵溫度12～20 ℃，發酵時間3～5 d 時，發酵生產麥汁，酒精度均符合無醇啤酒的要求。

通過DOE試驗，優化得到結果：采用TTNA-01酵母，滿罐酵母數10×106個/mL，充氧量10 min，20 ℃發酵5 d，最佳。經過發酵試驗驗證，當麥汁濃度7°P 時，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有輕微4-VG 味，酒精度≤0.5 %vol，符合無醇啤酒的要求。因此采用TTNA-01、TTNA-05 兩株酵母進行無醇啤酒的生產是可行的。