白酒攝入對小鼠腸道Akkermansia muciniphila數量的影響

成津燕,方程,徐巖*

1(江南大學 生物工程學院,釀造微生物與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

發酵酒精飲料在世界范圍內被廣泛消費,并被認為是最具經濟價值與文化價值的發酵食品之一[1]。酒文化作為中國傳統文化的重要組成部分,貫穿在中國人的日常生活中,近代科技的發展促進了釀酒科技的進步,使得人們對于白酒的認識不僅止步于嗜好品,飲酒與健康成為現代人最關注的話題之一[2]。雖然長期酒精暴露會導致肝損傷,但是白酒獨特而復雜的多菌種固態發酵與固態蒸餾過程導致其中含有上千種微量組分[3],其中許多成分具有重要的生物活性,例如有機酸、酚類、吡嗪類、萜烯類及不揮發脂肽類等物質,并已被證明對健康有積極影響[4];一些物質還被認為可以通過調節腸道微生物改善酒精造成的損傷[5-7]。

Akkermansiamuciniphila是一種專性厭氧的革蘭氏陰性菌,隸屬疣微菌門疣微菌科中的Akkermansia屬[8],由荷蘭學者DERRIEN于2004年在人類糞便中首次發現并命名[9]。它通過將黏蛋白作為唯一的氮和碳源來定植于腸道,為哺乳動物腸道中最豐富的微生物之一[10]。近年來的研究發現,A.muciniphila具有調節免疫、保護腸屏障功能、維持黏液層厚度及抗炎等多種有益生理功能,因而被認為是“下一代益生菌”[11]。A.muciniphila在發現至今不到20年時間里,研究已從小鼠模型觀察發展到代謝綜合征患者干預,是其他“下一代益生菌”無法比擬的,因而在食品工業領域和學術界獲得了極大關注[12]。

近年來的研究發現,A.muciniphila是改善酒精相關疾病的關鍵腸道微生物[13],直接灌胃補充A.muciniphila能夠通過保護腸屏障完整性改善酒精攝入引起的肝損傷[14]以及酒精相關的抑郁癥[15];大黃提取物與硬脂酸干預可通過增加腸道A.muciniphila豐度從而改善酒精誘導的肝損傷[16-17];另外,在我們的前期研究中也發現,與純酒精喂養相比,白酒喂養可以通過減緩腸道A.muciniphila相對豐度的降低,從而減輕腸道屏障破壞和肝損傷程度[18]。然而,以上研究都是基于高通量測序觀察A.muciniphila的相對豐度,A.muciniphila在腸道中的準確數量并不清楚,A.muciniphila隨白酒干預時間的變化規律也尚無文獻報道。

本研究通過純培養手段從小鼠糞便中篩選到一株A.muciniphila模式菌株ATCC BAA-835,并建立了基于實時熒光定量PCR測定腸道A.muciniphila數量的方法;同時通過建立白酒干預的小鼠動物模型,探究了腸道A.muciniphila隨白酒干預的變化規律,并比較了與酒精干預之間的差異。本研究對開發A.muciniphila作為新一代益生菌防治酒精性肝損傷具有理論意義和應用前景,同時對挖掘白酒中有益活性物質以及闡明活性物質的作用機制提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

實驗菌株:大腸桿菌(JM109)為實驗室保存;A.muciniphila(ATCC BAA-835)從小鼠糞便樣本中分離得到。

實驗動物:SPF級雄性C57BL/6 J小鼠(8周,20～22 g),斯萊克實驗動物(上海)有限公司。

1.1.2 試劑和儀器

實驗所用白酒和食用級乙醇均來自本實驗室貯存;BHI培養基,海博生物技術(青島)有限公司;豬胃黏蛋白,Sigma-Aldrich(德國)公司;N-乙酰-D-氨基葡萄糖,麥克林生物科技(上海)有限公司;蘇氨酸、瓊脂、L-半胱氨酸鹽酸鹽、吐溫80、LB培養基,國藥集團化學試劑有限公司;TOPO-Blunt Cloning Kit,天霖生物科技(上海)有限公司;PrimeStar Max DNA Polymerase,寶日醫生物技術(北京)有限公司;DNA Gel Extractuon Kit、PCR Product Purification Kit、Plasmid Mini-PREPS Kit、0.1 mL 8 Strip Real-time PCR Tubes,生工生物工程(上海)股份有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit、TIANamp Stool DNA Kit,天根生化科技(北京)有限公司;2×Rapid Taq Master Mix、ChamQ SYBR qPCR Master Mix,諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司;MGC 7 L厭氧盒、MGC 3.5 L厭氧產氣袋、MGC氧氣指示劑,三菱化學(日本)株式會社;Bugbox厭氧工作站,貝克(英國)公司;NanoDrop 8000超微量分光光度計,賽默飛世爾科技(美國)公司;StepOne熒光定量PCR儀,應用生物系統(美國)公司。

篩菌所用培養基:富集培養基參考翟齊嘯等[19]研究設置;液體初篩培養基參考朱永亮等[20]研究設置,成分為BHI培養基30 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g、蘇氨酸5.0 g、N-乙酰-D-氨基葡萄糖5.0 g、吐溫80 0.5 mL、加水定容至1 L;固體分離培養基在液體初篩培養基基礎上加入瓊脂18 g。

1.1.3 引物

16S通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;參考文獻[21]合成特異性引物,正向引物AM1:5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′;反向引物AM2:5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′,安升達(天津)生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選

1.2.1.1 樣品均質與富集

選取8只正常小鼠的糞便。每日上午灌胃前將每只小鼠單獨放置于空籠,按照編號對小鼠糞便進行單獨采集,每管3～5顆小鼠糞便。取3～5顆小鼠糞便加入10 mL PBS中進行均質,記作10-1,梯度稀釋均質液至10-5,吸取各梯度均質液500 μL加入4.5 mL富集培養基中,將富集管放置于37 ℃厭氧恒溫培養箱中培養72 h。選取較為均一、懸濁、無沉淀與絲狀物的較高稀釋度的富集管,吸取1 mL培養液12 000 r/min離心5 min后棄上清液,使用50～200 μL無菌水重懸,沸水浴煮沸10～15 min,12 000 r/min離心1 min,取上清液為模板使用AM1與AM2為引物進行PCR檢測有無陽性條帶,目標片段長度為329 bp,反應采用10 μL體系,擴增條件為2×Rapid Taq Master Mix 5 μL,AM1與AM2各0.2 μL,模板0.1 μL,ddH2O 4.5 μL;反應條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環;72 ℃終延伸10 min。

1.2.1.2 分離培養

將得到陽性條帶的富集管菌液使用PBS緩沖液進行梯度稀釋,吸取10-5～10-8各稀釋度200 μL分別涂布至固體分離培養基,每個稀釋度涂布3個平板;將涂布完成的平板放置于厭氧盒,放入2個三菱瓦斯化學株式會社(Mitsubishi Gas Chemical Company,MGC)3.5 L厭氧產氣袋與1個氧氣指示劑,迅速將盒子密封,置于37 ℃恒溫培養箱中培養2周。

1.2.1.3 初篩鑒定

選擇培養完成的固體平板上直徑在1 mm以內、乳白色、黏稠狀單菌落,挑取菌落接種于5 mL液體初篩培養基中,于37 ℃厭氧恒溫培養箱中培養24 h。選擇渾濁初篩管,使用AM1與AM2引物擴增特異性片段,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性條帶。選取有陽性條帶的初篩管菌液使用16S通用引物27F與1492R進行擴增,目標片段長度為1 500～1 600 bp,反應采用10 μL體系,擴增條件為2×Rapid Taq Master Mix 5 μL,27F與1492R各0.2 μL,模板0.1 μL,ddH20 4.5 μL;反應條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環;72 ℃終延伸10 min。對所得PCR產物進行測序,對序列結果進行BLAST搜索比對并保存菌種。

1.2.2 菌種活化與培養

A.muciniphila:在超凈工作臺中,使用接種環蘸取保存管中的菌液,在BHI固體培養基上進行平板劃線后,在厭氧工作站中37 ℃靜置培養36 h。挑取平板上的單菌落接種于BHI液體培養基過夜活化18 h,取2%(體積分數)接種量進行培養24 h。

1.2.3 T-Akk標準質粒構建

采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取A.muciniphila細菌基因組DNA,嚴格按照說明書操作,提取的DNA模板于-20 ℃保存備用。參考前人研究進行質粒構建[22],使用PrimeStar Max DNA Polymerase擴增出A.muciniphila特異DNA序列,反應采用50 μL體系,擴增條件為1×PrimeStar Max Mix 25 μL,引物AM1與AM2各1 μL,模板200 ng,ddH2O補充至總體系50 μL,反應條件為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環;72 ℃終延伸10 min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目標條帶,純化后使用NanoDrop 8000超微量分光光度計測定DNA濃度,使用TOPO-Blunt Cloning Kit將擴增目的基因插入TOPO載體,克隆反應體系為10 μL,按照載體、目的片段摩爾比1∶3,室溫孵育5 min。將反應產物轉化至大腸桿菌(JM109)感受態細胞,細菌恢復至正常生長狀態吸取菌液涂布抗生素平板。使用抗生素平板篩選陽性克隆菌落,挑取單一菌落至抗生素LB液體培養基中培養8 h,提取標準質粒進行測序。利用NCBI中BLAST與SnapGene軟件比對測序結果與A.muciniphila基因組,并保存目標菌種T-Akk大腸桿菌。

1.2.4 動物實驗造模

所有小鼠自由進食,水與飼料充足。適應1周后,將小鼠隨機分為3組:對照組(8只)、白酒組(8只)、酒精組(8只)分別給予無菌水、白酒以及食用酒精。為保證白酒組和乙醇組之間小鼠攝入的酒精劑量一致,使用酒精計測定白酒酒精含量后,按照設定的酒精含量計算稀釋倍數,灌胃前使用無菌水將每種白酒和乙醇稀釋至相同酒精濃度。灌胃酒精劑量采用梯度增加的方式進行:初始酒精劑量為每天3.2 g/kg,此后每5 d梯度增加0.6 g/kg,直至第20天達到5.6 g/kg,保持此劑量至實驗結束(圖1)。造模方法參考課題組前期研究[18,23]。

圖1 動物造模方案

1.2.5 實時熒光PCR

參考文獻[24]使用SYBR Green I作為熒光指示劑,PCR反應體系采用20 μL,擴增條件為ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,AM1與AM2各0.4 μL,模板1 μL,ddH2O補充體系至20 μL;反應條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,40個循環;72 ℃終延伸5 min。在72 ℃設置熒光信號采集。反應結束設置65～95 ℃溶解曲線,溫度以0.5 ℃/5 s遞增。

1.2.6 標準曲線建立

參考前人研究建立標準曲線[25-26]。培養T-Akk大腸桿菌12 h,按照說明書使用Plasmid Mini-PREPS Kit提取T-Akk質粒并測定DNA濃度,根據公式(1)計算拷貝數,將拷貝數稀釋為101～109九個濃度梯度作為標準品進行實時熒光PCR實驗,各設3個平行樣,建立標準曲線。

(1)

式中:DNA質量濃度,ng/μL;載體長度,bp;靶DNA長度,bp。

1.2.7 樣本收集與基因組提取

收集第1、3、5、8、12周白酒、酒精及對照組的小鼠糞便于凍存管,不立即使用則貯存于-20 ℃。精確稱取小鼠糞便質量,使用TIANamp Stool DNA Kit提取基因組DNA。空白對照以ddH2O代替模板DNA。每組設置3個生物學平行,每1個生物學平行設置3個技術平行。

1.2.8 數據分析

圖形制作均采用Origin 2023進行繪制。數據分析采用SPSS軟件進行統計學分析,所有實驗結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 A.muciniphila模式菌株篩選

經富集、分離、初篩培養,選擇渾濁初篩管,使用AM1與AM2引物擴增特異性片段,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性條帶(圖2)。結果發現,除泳道3外,其余泳道均有陽性條帶,進一步對陽性條帶進行測序比對發現,所有陽性條帶與A.muciniphilaATCC BAA-835的相似度均為100%,表明本研究所使用的C57BL/6 J小鼠腸道中的A.muciniphila為模式菌株ATCC BAA-835。

圖2 初篩菌液特異性片段擴增

2.2 標準質粒構建

以A.muciniphila基因組DNA為模板,使用引物對AM1/AM2進行PCR擴增,獲得一條與目的基因片段長度(329 bp)相符的特異性擴增條帶(圖3),對目的片段進行膠回收和純化,并測定DNA濃度,加入40 ng目的片段至10 μL克隆反應體系中孵育。

圖3 目的基因片段擴增

吸取菌液提取質粒進行PCR與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,重組質粒鑒定結果均為陽性(圖4-a)。4個陽性菌落測序結果均與A.muciniphila特異性片段一致(圖4-b),表明目標片段成功插入TOPO載體中,T-Akk質粒構建完成。

a-陽性菌落鑒定結果;b-菌落測序結果(部分序列)

2.3 標準曲線建立

以數量級為101～109的T-Akk質粒DNA拷貝數作為標準品進行實時熒光定量PCR測定對應Ct值。以DNA拷貝數的對數值為橫坐標,Ct值為縱坐標建立標準曲線,線性關系為Ct=-3.361x+38.89,相關系數R2=0.999 1(圖5),線性關系良好,表明可進一步用于腸道A.muciniphila定量分析。

圖5 標準曲線

2.4 腸道A.muciniphila隨白酒和酒精干預的變化規律

通過以上方法對造模第1、3、5、8和12周小鼠糞便中的A.muciniphila進行定量分析,結果發現對照組小鼠糞便中A.muciniphila豐度趨于平穩,酒精組與白酒組小鼠糞便中A.muciniphila豐度隨造模時間呈現下降趨勢;且與酒精組相比,白酒組小鼠糞便中A.muciniphila數量下降趨勢較緩(圖6)。

圖6 小鼠糞便中A.muciniphila豐度隨時間變化規律

適應期結束后(第1周),酒精組小鼠A.muciniphila的數量為[(5.56±0.30) lg(copies/mg)],白酒組小鼠A.muciniphila數量為[(5.40±0.22) lg(copies/mg)],略低于酒精組;造模結束后,酒精組與白酒組小鼠糞便中A.muciniphila數量均低于對照組,說明白酒和酒精攝入均會導致腸道A.muciniphila數量降低。酒精組小鼠A.muciniphila數量為[(4.41±0.06) lg(copies/mg)],白酒組小鼠A.muciniphila數量為[(4.61±0.17) lg(copies/mg)],略高于酒精組(圖6);酒精組下降比率高于白酒組(表1)。

表1 干預前后小鼠糞便中A.muciniphila豐度下降比率

綜上所述,在相同酒精攝入劑量條件下,白酒喂養與純酒精喂養相比能夠減緩A.muciniphila的損失程度,這與FANG等[18]研究結果相似,表明白酒中活性成分可能是通過保護酒精誘導的A.muciniphila豐度的降低,從而減輕腸道屏障功能的破壞和肝損傷。

3 結論

本研究通過純培養的方法篩選到了一株A.muciniphila模式菌株ATCC BAA-835,采用實時熒光定量PCR方法并使用重組質粒T-Akk作為標準品構建了標準曲線,并建立了腸道A.muciniphila的絕對定量方法,同時通過建立為期12周慢性白酒灌胃干預小鼠模型,測定了小鼠糞便中A.muciniphila的數量,探究了白酒干預對小鼠腸道中A.muciniphila數量的影響以及與酒精干預之間的差異。

本研究使用重組質粒作為標準品進行標準曲線構建,相比于傳統方式中使用A.muciniphila基因組為標準品制備標準曲線更為簡便、快速。結果發現,白酒與酒精攝入均會導致小鼠腸道A.muciniphila數量的降低;相同酒精攝入劑量條件下,白酒喂養與純酒精喂養相比能夠減緩A.muciniphila的損失程度,說明白酒中含有可以增加A.muciniphila數量的活性物質。然而白酒中何種生物活性物質保護了A.muciniphila數量的下降及其保護機制仍需進一步探索。本研究體現了挖掘白酒中生物活性物質的價值與必要性,并為A.muciniphila作為下一代益生菌改善酒精引起的各種損傷提供了科學依據。