百香果提取液綠色制備銀納米粒子及其抗菌研究

曹興業,謝閏生,趙志遠,李培駿,2*,李海云*

1(桂林理工大學 化學與生物工程學院,廣西 桂林,541004)

2(韶關學院 廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室,廣東 韶關,512005)

納米技術是現代科學發展比較迅猛的一個重要領域,納米粒子的尺寸大約為1～100 nm,而納米技術涉及到納米粒子的合成、表征和應用等[1]。納米材料因具有獨特的物理化學性質而聞名,廣泛應用于抗菌[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤、抗真菌[4]、抗氧化和抗寄生蟲[5]等領域。

在眾多的金屬納米粒子中,由于納米銀(AgNPs)獨特的屬性而被用于不同的領域,如生物醫學(快速診斷、成像、組織再生和藥物輸送,以及新醫療產品的開發)[6]、紡織業[7]、食品包裝[8]、化妝品業、催化劑、傳感器、生物學、抗菌性、DNA測序、表面增強拉曼反射(surface-enhanced raman scattering,SERS)、能源生產和信息存儲等。各種物理和化學方法已被用來制備AgNPs,如微波合成[9]、納米粒子氣相合成[10]、光催化還原[11]、化學還原[12]等。化學方法具有成本高、而且會產生各種有毒和有害物質導致生物風險。因此,近年來提出了基于綠色化學原理的新合成路線。比如藻類、真菌、酵母、細菌、病毒和植物提取物等生物在特定目標的納米粒子合成中發揮了突出的作用[1]。MUTHUSAMY等[13]利用螺旋藻藻綠成功制備了AgNPs,并進行了抗菌研究,結果表明該方法制備的AgNPs具有良好的抗菌性。ABDELGAWAD等[14]使用大豆蛋白綠色合成AgNPs,通過室溫下的固態反應,進行銀納米粒子的高通量綠色合成。其結果對于制備更清潔、更大規模和更穩定的銀納米粒子提供了希望。GOVARTHANAN等[15]使用椰子油餅提取物綠色制備AgNPs,這是一種低成本且環保的制備AgNPs的方法。MYTHILI等[16]揭示了一種使用市場上的綠色蔬菜廢物合成高效抗微生物活性納米顆粒的有效方法,最大限度地減少了蔬菜市場上固體廢物的積累。使用植物提取物作為還原劑和穩定劑合成銀納米粒子是綠色生產納米粒子最常用的方法。它具有分布廣泛、易于獲得、處理更安全的特殊優點。因此,利用植物提取物合成銀納米粒子是傳統化學方法的最佳綠色替代方法。

百香果原產于美洲熱帶地區,目前在中國南方地區廣泛栽培,其中廣西已經成為中國最大的百香果生產基地。百香果中富含多種營養物質,其果皮中含有大量的生物活性物質,如多糖、果膠、多酚、黃酮等。多酚及黃酮等活性物質具有抗炎癥、抗癌、抗氧化及抗菌性。由于百香果果皮中的纖維含量較大,易成為環境負擔,因此,使用其果皮提取液制備AgNPs,不僅是對百香果廢棄物的充分利用,更是對環境的保護,是一種百香果高附加值產品的開發[17-18]。

利用植物提取物制備銀納米粒子的方法相對于其他方法具有一定的優勢,目前還沒有使用百香果果皮提取物制備AgNPs的先例。本實驗采用百香果果皮提取物作為還原劑和穩定劑來合成AgNPs,通過紅外光譜和拉曼散射光譜分析合成機理,并通過多種表征方法對合成的AgNPs進行研究。此外,還研究了不同提取液添加量對AgNPs生物合成的影響,并用綠色合成的AgNPs對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能進行了評估,以期為提升百香果的綜合利用度和附加值提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用百香果從廣西桂林市雁山區農貿市場獲得;氫氧化鈉,成都Kelong化學試劑廠(中國,成都);硝酸銀(AR,≥99.8%),西隴科學有限公司(中國,汕頭);抗菌、抗真菌活性試驗所用營養肉湯,青島Hope生物技術有限公司(中國,青島)。

1.2 儀器與設備

GBOF20CN2L-B8(R0)型微波爐,廣東格蘭仕微波電器制造有限公司;TU-1950型紫外可見分光光度計,北京譜析通用儀器有限責任公司;NICOLET型傅里葉紅外光譜分析儀,天津市能譜科技有限公司;Thermo Fisher Scientific DXR 型拉曼散射光譜,賽默飛世爾科技有限公司;ZS90型納米粒度分析儀,英國Malvern公司;XPeter3 Powder型X射線衍射分析儀,荷蘭帕納科公司;JEM-2100F型場發射透射電子顯微鏡、SU5000型掃描電子顯微鏡,北京歐波同光學技術有限公司;SDT Q600型同步TGA/DSC分析儀,海群弘儀器設備有限公司;UlVAC-PHI型X-射線光電子能譜,日本UlVACPHI公司;iMark型酶標儀,伯樂生命醫學產品有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物提取液的制備

取新鮮百香果果皮洗凈后晾干,準確稱取10 g,粉碎后放入100 mL燒杯中,加入50 mL蒸餾水,置于90 ℃的水浴鍋中加熱20 min,冷卻后過濾得到百香果果皮提取液,并加入蒸餾水將提取液定容至50 mL。將提取液置于冰箱中,在4 ℃條件下保存,并且在3 d之內用完。

1.3.2 納米銀粒子的合成

在室溫下,取10 mL果皮提取液,加入質量濃度為1 g/L的氫氧化鈉溶液至100 mL,充分溶解后加入2 mL濃度為0.5 mol/L硝酸銀溶液。將制備液置于微波爐中,微波輔助反應,功率為480 W,時間為2 min。微波后搖勻,靜置10 min。取反應后的液體在室溫下高速離心,轉速10 000 r/min,離心時間20 min。取其沉淀,加入適量蒸餾水,重復離心2次,去除上清液,后將沉淀置于50 ℃烘箱中烘干,獲得納米銀粒子。

1.3.3 納米銀表征

紫外可見(UV-Vis)吸收光譜,將未離心的AgNPs液體使用蒸餾水稀釋50倍,以蒸餾水為空白組,在300～600 nm 波長測其紫外可見吸收光譜。

傅里葉紅外光譜法(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR):將干燥的KBr粉末分別與納米銀粉末以200∶1的質量比研磨,移取適量粉末于壓片模具中,20 MPa壓力壓片成型,檢測波數為4 000～450 cm-1。

拉曼散射光譜:將適量粉末狀樣品均勻置于載玻片上,輕輕壓平后放于激光共聚焦顯微鏡光學臺上,待測。使用780激光發光源,光譜范圍為70～2 000 cm-1。

Zeta電位檢測,Zeta電位分析其穩定性。將待測的AgNPs溶液加入樣品池中,然后放入分析儀中進行檢測。檢測參數:AgNPs溶液折光率為1.330;分散劑為水;在25 ℃溫度下重復測試3次,每次12輪。

X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD):粉末樣品的顆粒度大小在320目左右,將樣品研磨成適合衍射實驗用的粉末,再把樣品粉末放入專用載玻片的槽位中,制成平整平面的試片進行檢測。

透射電子顯微鏡表征(transmission electron microscope,TEM):將AgNPs溶液超聲分散后,用移液槍吸取4～5滴AgNPs樣品溶液于銅網中,真空干燥1 h以上,干燥后進行TEM觀察。

掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM):將10 mg/mL液體樣品超聲20 min后,滴加數滴于硅片上烘干12 h。將導電膠固定于樣品臺上,導電膠面積不超過0.5 cm×1 cm,再將硅片覆蓋在導電膠上固定,即可進行SEM掃描。

能量色散光譜(energy dispersive spectrometer,EDS):將10 mg/mL液體樣品超聲20 min后,滴加數滴于硅片上烘干12 h。將導電膠固定于樣品臺上,導電膠面積不超過0.5 cm×1 cm,再將硅片覆蓋在導電膠上固定,即可進行EDS分析。

熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA):TGA是使用熱重分析儀TAINSTRUNT(SDT Q 600 V20.9 Build 20)測試,在氧化鋁坩堝中進行。每個樣品約含10 mg,溫度變化為25～800 ℃,在氮氣中加熱速度為10 ℃/min。

動態光散射(dynamic light scattering,DLS):將待檢測的AgNPs溶液加入樣品池中,然后放入分析儀中進行檢測。檢測參數:AgNPs溶液的折射率為1.330;分散劑為水;試驗在25 ℃下重復3次,每次12輪。

X-射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS):將約10 mg粉末樣品均勻鋪在黏有導電膠的鋁箔上,取另一片鋁箔覆蓋住樣品。將上述制好帶有樣品的鋁箔置于模具中,轉移到壓片機上,10 MPa壓力壓片成型。

1.3.4 抑菌實驗

菌懸液的制備:根據前人方法[19-20],大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液:稱取1.25 g LB肉湯液體培養基,溶于50 mL蒸餾水中。在121 ℃下滅菌20 min,滅菌結束后取出放入超凈工作臺中進行接種。用滅菌后的接種環挑取適量制備好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌放入冷卻后的LB肉湯培養基中,于37 ℃的振蕩培養箱中搖瓶培養18～24 h獲得活化菌液。

最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC):是指在特定環境下孵育24 h,可抑制某種微生物出現明顯增長的最低藥物濃度即最小抑菌濃度,用于定量測定體外抗菌活性測定方法:稱取所得銀納米粒子樣品3.2 mg,溶于1 mL的LB肉湯中,即質量濃度為3.2 mg/mL。依此為原液稀釋制備出一系列的質量濃度梯度:0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL。將0.2 mL肉湯、0.05 mL納米銀肉湯和0.05 mL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液,菌懸液濃度控制在107CFU/mL左右,充分混合加入到細胞板上,體系中納米銀質量濃度為0、16.7、33.3、66.7、133.3、266.7、533.3 μg/mL。培養時間0、3、6、9、12、15、24 h,用酶標儀檢測吸光值(600 nm)。

1.4 數據處理

每個實驗至少重復3次,數據采用“平均值±標準差”表示。用Origin 2021 進行作圖,SPSS 22.0 軟件進行顯著檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同提取液添加量對合成納米銀的影響

一般來講,不同的納米粒子在UV-Vis光譜中吸收峰的位置會不相同,例如,納米銅在600～650 nm處有較強的吸收峰,納米金的吸收峰處于500～600 nm處,而納米銀在410 nm左右表現出很強的吸收峰[21-22]。因此,可以通過UV-Vis光譜來確定所制備的納米粒子的種類。同時,對于同種溶膠可以通過峰的位置及形狀判斷溶膠中納米粒子的大小和形貌。

在本研究中,百香果果皮提取物被用作銀離子的還原劑及穩定劑。將百香果果皮提取物溶于氫氧化鈉溶液,加入硝酸銀溶液后,可以通過樣品顏色變成深棕色來證明納米銀顆粒的形成。這一現象可以用紫外光譜儀顯示出來。通過加入5、10、15、20 mL的提取液制備納米銀,UV-Vis在波長為300～600 nm進行光譜掃描。由圖1可以看出,所有樣品均在410 nm附近出現比較強的吸收峰,表明溶液中出現納米銀粒子。如圖1所示,在使用10 mL提取液所制得的納米銀吸光值最高且出現明顯藍移,表明在該條件下,所制備的納米銀析出率最高,粒徑最小[23]。

2.2 SEM、TEM及粒徑分析

通過SEM和TEM觀察銀納米粒子的表面形貌和尺寸。如圖2-a和圖2-b所示,納米銀粒子規則且均勻的結構,直徑為10～15 nm的球形是銀納米粒子的特征,平均粒徑為12.1 nm。BALCIUNAITIENE等[24]通過苦艾提取物合成的AgNPs主要為球形,平均粒徑為50 nm;KHAN等[25]通過秈藻及其自然生長形式的細胞培養物的提取物合成的AgNPs的平均粒徑為15 nm、19 nm。本實驗結果比前人的研究結果具有更小的粒徑。研究表明AgNPs的抑菌性能與其粒徑呈反比,粒徑越小,比表面積越大,越有利于更多的AgNPs與膜的結合,改變膜的通透性,通過使細胞內容物的泄漏發揮抑菌作用[24]。因此,百香果果皮提取物是合成形貌均勻、粒徑小的銀納米粒子的高效載體。采用DLS進行粒徑分布分析。如圖2-d顯示,AgNPs的平均粒徑為43.25 nm,這證實了產物是納米顆粒。多分散性指數(polymer dispersity index,PDI)是顆粒均勻性的度量指標,接近0.3的值表明已經形成了穩定的聚集體溶液。

a-SEM;b-TEM圖像;c-粒徑分布;d-DLS

2.3 Zeta電位和熱重TGA

電位分析是預測懸浮在膠體溶液中的顆粒穩定性的工具。以水為分散劑,測定了合成的銀納米粒子的Zeta電位,電位為-19.4 mV。如圖3-a所示,結果表明銀納米粒子具有負電荷,說明提取物中的活性物質可能以帶負電荷的形式吸附在AgNPs粒子的表面[26]。通過TGA直接測定納米粒子和載體的穩定比。如圖3-b所示,在160～500 ℃內,百香果提取物從AgNPs的表面分解和脫落,而在530～660 ℃的失重是由于果膠的燃燒所引起[27]。在整個燃燒過程中,AgNPs的質量損失很小,可表明AgNPs的熱穩定性較好。

A-Zeta電位;b-熱重TGA

2.4 FTIR和拉曼散射光譜

紅外光譜有助于探測銀納米粒子表面的化學成分和納米粒子上封端劑的局部分子環境。銀納米粒子的紅外光譜如圖4-a所示,記錄了400～4 000 cm-1的范圍。出現在3 420 cm-1的寬帶被指定為O—H振動,表明還原劑中存在羥基[28],在該處觀察到了分子間氫鍵結合的酚羥基的存在。在銀納米粒子形成過程中,其強度降低并轉移到3 460 cm-1,證明類黃酮(多酚)主要起還原劑作用。在2 930 cm-1處的吸收峰,是—OCH3基團的不對稱C—H拉伸,百香果果皮提取液在納米銀形成時,強度降低并移動到2 910 cm-1,該處峰強度的降低,表示Ag+取代了—CH3基團[29]。1 380 cm-1和1 640 cm-1處的強烈峰值對應于C—N拉伸振動以及百香果果皮提取物中蛋白質的酰胺I帶。1 070 cm-1處的吸收峰代表的是C—OH的伸縮振動。使用拉曼散射技術來表征可被這些納米粒子表面吸收的成分。銀納米粒子的拉曼光譜如圖4-b所示,譜圖記錄了70～2 000 cm-1的范圍。出現在750 cm-1處的N—H的平面彎曲振動。1 380 cm-1處的峰帶歸因于C—N以及百香果果皮提取物中蛋白質的酰胺I帶,在形成納米銀時峰帶向左偏移并且峰值明顯增強,表明提取液中的蛋白質成分參與了納米銀的合成并吸附在納米銀表面。1 570 cm-1處的峰帶是甲基的傘狀拉伸[30]。FTIR和拉曼散射光譜研究的結果證實,百香果果皮提取物具有還原和穩定銀納米粒子的雙重功能,納米銀粒子被百香果果皮提取物包覆。

a-FTIR;b-拉曼散射光譜

2.5 XRD、EDS和XPS分析

如圖5-a所示的XRD圖譜分析,證實了銀納米粒子的結晶性質。銀納米粒子的X光衍射圖顯示在整個XRD光譜上存在不同強度的各種峰,這些衍射峰分別與金屬銀晶態的[111]、[200]、[220]、[311]、[222]對應。同時表征了金屬銀的面心立方結構,與JCPDS數據庫87-0717號相關聯,這證實了合成了自然分散的銀納米粒子。這些衍射峰可能是由于封端劑穩定了納米粒子而產生的。通常,固體的XRD圖譜中峰的加寬歸因于粒度效應。更寬的峰表示更小的顆粒尺寸,反映了實驗條件對晶核成核和生長的影響[31]。在本研究結果中,更寬的峰表明百香果果皮提取物參與了晶核生長和顆粒形成[32]。

a-XRD;b-EDS;c-XPS

利用硅片盛載納米銀樣品進行能譜分析,譜圖充分顯示了樣品中的金屬銀為主要成分,歸一化質量銀占比為91.15%。其他物質歸因于百香果皮提取物附著在納米銀表面。由于表面等離子體共振,金屬銀納米晶體在3 000 eV時表現出典型的光學吸收峰[33]。譜圖顯示有氮元素存在,結合紅外和拉曼的結果分析,其來源為百香果果皮提取液中的蛋白質,驗證了提取液成分包覆在納米銀表面。

為了揭示金屬銀的存在并獲得其化學組成和氧化態的信息,對銀納米粒子進行了XPS研究。主導元素銀在370 eV的強信號證實了銀的三維狀態的存在[34]。為了確定納米銀的價態,研究了Ag 3d的高分辨率單個XPS峰,其可以分為如圖5-c所示的2個成分。由分離良好的雙自旋軌道成分Ag 3d5/2和Ag 3d3/2在367.61 eV和373.61 eV的結合能表示的不對稱XPS峰證實了金屬Ag0的豐度[35]。XPS結果證明了Ag+還原為Ag0。

2.6 抑菌實驗MIC

為定量研究抗菌作用,測定了AgNPs的最低抑菌濃度。如圖6所示,對大腸桿菌的最低抑菌濃度為33.3 μg/mL,金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為66.7 μg/mL。結果顯示,金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度要高于大腸桿菌,因為它們的細胞相對較厚,肽聚糖較多。與之前報道的AgNPs[19]相比,百香果果皮提取物制備的銀納米粒子顯示出更好的抗菌活性,這可能是由于百香果果皮提取物中多種活性物質的共同作用。銀納米粒子的抗菌能力還與其大小、形狀和封端劑有關,大的納米顆粒允許大的表面積接觸細菌細胞,這意味著小的顆粒可能比大的顆粒有更高的相互作用[36-37]。本研究所制備的納米銀顆粒較小,可能是其抑菌性好的原因之一。此外,本研究所制備的AgNPs的抑菌效果要好于大多數使用植物提取物制備的AgNPs,這一原因可能是百香果果皮提取物中的活性物質與AgNPs協同抗菌作用。CHINNAPPAN等[38]利用紫荊花提取物制備了AgNPs,并對克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌進行了抑菌研究,其MIC約為432 μg/mL。MUTHUSAMY等[13]利用螺旋藻微藻綠色合成了AgNPs,并對克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌進行了抑菌研究,其MIC約為324 μg/mL。因此,利用百香果果皮提取物合成的銀納米粒子在臨床和醫學領域具有潛在的應用價值。

a-大腸桿菌;b-金黃色葡萄球菌

3 結論

本研究開發了一種新的簡便的方法,利用百香果果皮提取物合成銀納米粒子。該方法快速、廉價且環保,在合成過程中不使用任何有害試劑。果皮提取物中的黃酮、多酚、果膠和蛋白質等生物活性成分作為還原劑和穩定劑。銀納米粒子對大腸桿菌(MIC為33.3 μg/mL)、金黃色葡萄球菌(MIC為66.7 μg/mL)具有有效的抗菌活性。通過多種表征方法對綠色合成的納米銀粒子進行分析。結果表明,合成的納米銀粒子被百香果果皮提取液包覆,具有均勻的球形形貌,粒徑較小。本方法由于使用的是百香果果皮提取液制備納米銀,具有低成本和高效的優點,因而具有商業放大的前景。這些銀納米粒子有可能應用于制藥和工業領域。