S-8大孔樹脂-C18柱聯用分離牡丹籽殼中短葉松素及抗氧化研究

張迎陽,鄒林玲,陳文濤,孫承駿,鄒平,徐瑩,滿在偉

(常州大學 藥學院/生物與食品工程學院,江蘇 常州,213164)

牡丹籽為毛茛科、芍藥屬多年生落葉灌木牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr)的成熟種子,分為牡丹籽仁和牡丹籽殼兩部分[1]。牡丹籽仁中可提取牡丹籽油,剩余物牡丹籽粕中還能夠提取出蛋白質、黃酮等活性物質[2]。牡丹籽殼中也含有許多活性物質,如黃酮、茋類化合物、黑色素[3-5]等,李婉儀等[6]利用超聲輔助提取出了黃酮化合物,發現其抗氧化活性與維生素C相當。短葉松素是黃酮類化合物的一種,具有抗氧化、抑菌等能力,BANG等[7]從蜂膠中分離出短葉松素并明確其抗血栓能力;JIA等[8]從新鮮楊桃檢測出短葉松素。

大孔樹脂是一種有機高聚吸附劑,具有吸附量大、選擇性強、操作簡便和成本低等特點,因此常常用于黃酮類化合物的分離純化研究[9-10]。讓鳳菊等[11]利用AB-8大孔樹脂分離純化伊犁野核桃葉總黃酮,工藝優化后總黃酮回收率可達71.37%,純度為79.58%。C18球形硅膠作為基質具有較高的機械強度、良好的物化性質,并且不受有機溶劑的影響,穩定性好[12]。利用其反相鍵合的特點,針對目標物的極性調整流動相的極性[13],這比傳統的硅膠柱操作更簡便,分離效果更好。

該研究將以牡丹籽殼粗黃酮(Mu Dan Ke Flavonoids,MDKF)的吸附和解析效果為指標,考察大孔樹脂對牡丹籽殼黃酮的吸附和解析性能,篩選出最佳純化工藝條件。用C18柱進行二次分離出短葉松素,并以清除DPPH自由基、羥自由基的能力為指標,借助分子對接實驗短葉松素與超氧化物歧化酶(super oxide dimutese,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的結合能力預測短葉松素抗氧化機制,為牡丹籽殼資源開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽殼,江蘇國色天香油用牡丹科技發展有限公司;1,10-菲啰啉、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鉀(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(維生素C)、DPPH、氯化硝基四氮唑藍、還原性輔酶(分析純),阿拉丁試劑(上海)有限公司;S-8大孔樹脂,東鴻化工有限公司;C18球形硅膠柱,常州三泰科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHB-ⅢA環水式真空泵,上海聚昆儀器設備有限公司;UV-3600紫外可見近紅外分光光度計,島津企業管理(中國)有限公司;Tissuelyser-48高通量組織破碎儀,上海凈信實業發展有限公司;Q Exactive質譜儀、Reacti-thermo氮氣吹掃儀,美國Thermo公司;Acquity高效液相色譜儀,美國Waters公司;XH-T漩渦混合器,新寶儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗流程

實驗流程如圖1所示。

圖1 實驗流程圖

1.3.2 牡丹籽殼黃酮粗提物的制備與黃酮濃度的測定

稱取牡丹籽殼粉末200 g,在70 ℃水浴中用70%(體積分數)乙醇回流提取2次,第一次料液比為1∶25(g∶mL),第二次料液比為1∶10(g∶mL),抽濾得到MDKF提取液,旋蒸濃縮,冷凍干燥后得到MDKF粗提物粉末。標準曲線的建立及黃酮濃度的測定方法參照文獻[14]。

1.3.3 大孔樹脂和C18柱預處理

根據文獻[15]所述的方法將AB-8、S-8、DM301、HPD600、HPD100和D101大孔樹脂用95%(體積分數)乙醇浸泡24 h,過濾后反復用去離子水沖洗至無乙醇味;接著用5%(質量分數)NaOH浸泡24 h,去離子水沖洗至中性后用5%(體積分數)HCl浸泡24 h,去離子水沖洗至中性后60 ℃烘干備用。采用乙醇濕法裝柱后繼續用95%乙醇淋洗至流出液與水1∶5(體積比)混合無白色渾濁,用大量去離子水淋洗至無乙醇味后即可上樣。C18柱上樣前用60 mL起始流動相潤洗激活柱體。

表1 六種不同大孔樹脂的性質比較

1.3.4 大孔樹脂的篩選

稱取經過預處理的AB-8、S-8、DM301、HPD600、HPD100和D101大孔樹脂5.0 g置于250 mL錐形瓶中,加入50 mL質量濃度為1.067 mg/mL MDKF粗提液,放入恒溫搖床中在25 ℃、150 r/min條件下靜態吸附12 h,過濾出樣液,計算樣液黃酮含量以及每種大孔樹脂吸附率(E);將樹脂轉移至錐形瓶,加入50 mL 60%乙醇,置于恒溫搖床中相同條件下解析7 h,計算黃酮含量及解析率(D),篩選出吸附和解析效果最好的大孔樹脂進行MDKF的初步分離。吸附率E、吸附量Q和解析率D的計算如公式(1)～公式(3)所示:

(1)

(2)

(3)

式中:c0為吸附前樣液黃酮質量濃度,mg/mL;c1為吸附平衡時黃酮質量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;m為樹脂質量,g;c2為解析平衡時黃酮質量濃度,mg/mL。

1.3.5 大孔樹脂動態吸附、解析條件的確定

根據文獻所述的方法稍作修改如下:稱取MDKF粗提物用95%乙醇溶解配制成質量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的樣液,進行濕法上樣,設置上樣流速為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min,分別計算E和Q,考察樣液質量濃度和上樣液流速對大孔樹脂吸附率的影響;然后分別用50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液進行洗脫,設置洗脫液流速為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min,洗脫體積為40、60、80、100、120 mL,分別計算D,考察洗脫液濃度、流速和體積對大孔樹脂解析率的影響。確定大孔樹脂分離實驗的最佳工藝條件[16-17]。

1.3.6 C18反相鍵合硅膠柱層析分離

將經過大孔樹脂分離后的樣液冷凍干燥后95%(體積分數)甲醇溶液1 mL溶解,上C18硅膠層析柱(SW-5223-012-SP,40～60 mm,120 ?,20 g),用50 mL 55%(體積分數)乙腈-水溶液進行梯度洗脫,收集各流出部分,經旋蒸濃縮、冷凍干燥得到MDKF純化物粉末。

1.3.7 抗氧化能力分析

DPPH自由基清除能力參照文獻[18]所述方法測定;

羥自由基清除能力參照文獻[19]所述方法測定。

1.3.8 牡丹籽殼黃酮化合物組分分析

1.3.8.1 色譜條件

儀器采用Thermo Vanquish,使用ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 mm(2.1 mm×100 mm)色譜柱,自動進樣器溫度設為8 ℃,以0.25 mL/min的流速,40 ℃的柱溫,進樣2 mL進行梯度洗脫,流動相為0.1%甲酸水(A2)-0.1%甲酸乙腈(B2)。梯度洗脫程序為0～1 min,20% B2;1～9 min,20%～50% B2;9～12 min,50%～98% B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～20% B2;14～17 min,20% B2。紫外檢測波長掃描范圍為200～400 nm。

1.3.8.2 質譜條件

儀器使用Thermo Q Exactive,電噴霧離子源,正負離子電離模式,正離子噴霧電壓為3.50 kV,負離子噴霧電壓為2.50 kV,鞘氣30,輔助氣10。毛細管溫度325 ℃,以分辨率70 000進行全掃描,掃描范圍150～1 000,并采用HCD進行二級裂解,碰撞電壓為10、50、60 eV,同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息。

1.3.9 分子對接

PDB數據庫下載SOD(PDB ID:1E9O)、CAT(PDB ID;3QJ4)、POD(PDB ID;1M9Q)、GPX(PDB ID;6ELW)。使用Pymol 2.3.0去除蛋白結晶水、原始配體等,將蛋白結構導入AutoDocktools(v1.5.6)進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。使用POCASA 1.1預測蛋白結合位點,采用AutoDock Vina1.1.2進行對接,SOD相關參數[20]設置為:center_x=16.3,center_y=28.4,center_z=74.9;搜索空間:size_x:50,size_y:50,size_z:50(每個格點的間距為0.375?),exhaustiveness:10,其余參數為默認設置。

1.4 數據處理

試驗重復3次,數據采用Origin 9.0進行分析處理,分子對接部分采用Pymol 2.3.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

根據所述的方法獲得線性回歸方程為y=0.027 9x+0.016 6,R2=0.995 97,黃酮溶液在0～50 mg/mL具有良好的線性關系。此時的MDKF得率最高,為(10.54±0.13)%。

如圖2所示,吸附效果最好的為S-8,吸附率達到83.47%,最差的HPD100吸附率為52.8%;解析效果最好的為S-8,解析率為84.46%,最差的HPD600解析率為69.89%。綜合吸附和解析情況選擇S-8大孔樹脂作為初步分離柱層析填料。

圖2 不同大孔樹脂對MDKF靜態吸附和解析效果比較

2.2 大孔樹脂動態吸附、解析條件的確定

2.2.1 樣液質量濃度對大孔樹脂吸附能力的影響

如圖3所示,當MDKF樣液質量濃度從0.4 mg/mL上升到2.4 mg/mL時,吸附量逐漸增大,而吸附率呈下降趨勢。當樣液質量濃度為0.4 mg/mL時,S-8大孔樹脂吸附率最打為83.65%,但吸附量只有5.12 mg/g,樹脂的吸附能力并沒有得到充分利用;當樣液質量濃度為2.4 mg/mL時,此時S-8大孔樹脂吸附量最大為13.19 mg/g,但吸附率卻只有51.98%最低,這說明大量的黃酮化合物沒有被吸附,會造成大量的浪費。只有當樣液質量濃度為1.6 mg/mL時大孔樹脂的吸附率和吸附量均在中等適宜的水平,因此固定上樣液質量濃度為1.6 mg/mL。

圖3 樣液質量濃度對大孔樹脂吸附能力的影響

2.2.2 上樣液流速對大孔樹脂吸附能力的影響

如圖4-a所示為不同上樣液流速對S-8大孔樹脂吸附率的影響,可見隨著樣液流速的增加,大孔樹脂的吸附率整體呈下降趨勢,當樣液流速為0.5～2.0 mL/min時,S-8大孔樹脂的吸率變化不大,均在80%左右;當樣液流速大于2.0 mL/min時,大孔樹脂吸附率驟然降低,可能由于樣液在大孔樹脂中快速通過,導致大孔樹脂沒有足夠的時間進行吸附[21]。綜合考慮S-8大孔樹脂的性能和實驗效率,固定上樣液的流速為2.0 mL/min。

a-上樣液流速;b-洗脫劑體積分數;c-洗脫液流速;d-洗脫液體積

2.2.3 洗脫劑濃度對大孔樹脂解析能力的影響

如圖4-b所示,洗脫劑乙醇的濃度對S-8大孔樹脂解析能力的影響,總的來看解析率隨著乙醇體積分數的增加呈現上升趨勢。而當乙醇體積分數大于60%以后,S-8大孔樹脂的解析率的變化趨勢變得平緩,說明此時S-8大孔樹脂的解析能力已經得到充分發揮[22]。為了節省試劑和提高實驗效率,固定洗脫劑乙醇的體積分數為60%。

2.2.4 洗脫液流速對大孔樹脂解析能力的影響

如圖4-c所示,隨著洗脫液流速增大,S-8大孔樹脂的解析率逐漸減小。當洗脫液流速為0.5～1.5 mL/min時,解析率的下降趨勢較平緩,說明在此區間內S-8大孔樹脂的解析率受流速影響不大;當洗脫液流速大于1.5 mL/min時,解析率驟然減小,這可能由于洗脫劑與被洗脫成份沒有充分接觸,導致部分黃酮化合物無法洗脫下來,這將大大降低分離效率[23]。綜上固定1.5 mL/min為洗脫液流速最佳條件。

2.2.5 洗脫液體積對大孔樹脂解析能力的影響

為了提高分離效率,考察洗脫液乙醇的體積對S-8大孔樹脂動態解析的影響。如圖4-d所示,隨著洗脫液體積的增加,S-8大孔樹脂的解析率也逐漸增加,當洗脫體積大于100 mL時解析率為82.46%,并趨于平衡。因此固定洗脫液體積為100 mL為最佳條件。

2.2.6 S-8大孔樹脂分離

按照篩選的S-8大孔樹脂最佳條件進行上樣分離;上樣液質量濃度1.6 mg/mL,上樣液流速2.0 mL/min,洗脫劑乙醇體積分數60%,洗脫液流速1.5 mL/min,洗脫液體積100 mL。由圖5可知,經過S-8大孔樹脂初步分離后的組分相較于MDKF分離度得到改善。

a-MDKF液相;b-S-8大孔樹脂分離液相

2.3 C18硅膠柱分離

將經S-8大孔樹脂分離過的MDKF利用C18硅膠柱進行二次分離。如圖6所示為分離后F55的液相圖,F55組分可見一個峰強高于225的強峰,且峰形單一,可能為某種或某一類黃酮化合物,經質譜檢測且與標品對比(圖6-b)分析后確定為短葉松素。短葉松素為黃酮化合物的一種(圖6-c),其分子式為C15H12O5,分子質量為272.25 Da,保留時間為6.82 min。通過分析3個不同階段的短葉松素含量,發現經S-8大孔樹脂-C18柱聯用的短葉松素含量為(98.33±0.64)%,較MDKF中的(25.42±2.51)%有較明顯提升,說明分離效果顯著。

表2 短葉松素的得率對比

a-F55組分液相圖;b-短葉松素質譜對比圖;c-短葉松素分子結構

2.4 牡丹籽殼黃酮化合物抗氧化能力分析

如圖7所示為MDKF對DPPH自由基(圖7-a)和羥自由基(圖7-b)清除率曲線圖,分別測定了MDKF粗提物、S-8大孔樹脂純化物、C18純化物的抗氧化能力。由圖7可得出,4個組分的抗氧化能力均隨著濃度的升高而提高,最后趨于平衡;綜合抗氧化能力:C18純化物>S-8大孔樹脂純化物>MDKF粗提物,短葉松素純度越高,抗氧化能力越強,這是因為黃酮化合物種類繁多且結構相似,各個酚羥基之間會形成作用力從而影響其抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除率;b-羥自由基清除率

2.5 分子對接

短葉松素是黃酮化合物的一種,經抗氧化能力測試后發現具有較強的抗氧化能力。生物體內的抗氧化能力多為具有抗氧化能力的小分子化合物與SOD、CAT、POD、GPX結合后發揮作用,為明確短葉松素的抗氧化能力,采用分子對接的方法,將短葉松素分別與SOD、CAT、POD、GPX進行分子對接。(黃色線表示氫鍵作用,灰色虛線表示疏水作用。)由圖8可知,短松葉素與SOD的HIS-163、ASN-30、LYS-29形成氫鍵,與LYS-29、ALA-33形成疏水作用;短松葉素與SOD的HIS-163、ASN-30、LYS-29形成氫鍵,與LYS-29、ALA-33形成疏水作用,結合能為-6.3 kcal/mol;短松葉素與CAT的THR-160、THR-12、MET-11、ARG-42、MET-43形成氫鍵,與ARG-42、MET-43形成疏水作用,結合能為-9.1 kcal/mol;短松葉素與POD的MET-358形成氫鍵,與PRO-334、VAL-336形成疏水作用,結合能為-8.5 kcal/mol;短松葉素與GPX的GLY-154、ILE-129形成氫鍵,與ILE-129、LYS-135形成疏水作用,結合能為-6.7 kcal/mol。由此可見,短葉松素與CAT的預測結合能力最強,猜測與CAT結合使其發揮抗氧化能力。

3 結論

該研究以牡丹籽殼為原料,利用大孔樹脂和C18硅膠柱聯合分離MDKF中的短葉松素,LC-MS對分離后的組分進行鑒定,同時測定分離前后黃酮化合物的抗氧化能力,并以清除DPPH自由基、羥自由基的能力為指標,借助分子對接實驗短葉松素與SOD、CAT、POD、GPX的結合能力預測短葉松素的抗氧化機制,為牡丹籽殼資源開發利用提供理論依據。