利用竹基纖維素為碳源生物轉化L-乳酸的潛力研究

楊春柳,管秀瓊*,劉春,何明雄,劉林培

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 自貢,643000)

2(農業農村部沼氣科學研究所,農業農村部可再生能源開發與利用重點實驗室,生物質能技術研究中心,四川 成都,610041)

L-乳酸廣泛應用于食品、醫藥、日化工業和其他領域[1]。由于其酸性柔和、性質穩定且酸度可調,L-乳酸常被用作食品添加劑,并且,L-乳酸還能有效抑制病原微生物的生長,防止食品變質[2]。利用L-乳酸作為前體物聚合形成的聚乳酸(polylactic acid,PLA),可生產生物降解塑料、食品綠色包裝材料等,對改善日益嚴重的“白色污染”問題具有重大意義[3]。目前,國內外均采用微生物發酵法生產L-乳酸,但發酵基質多采用糖類、淀粉類為原料,這與“不與人爭糧,不與糧爭地”明顯相悖,不符合可持續發展的戰略要求[4]。因此,生產L-乳酸的主要瓶頸是找到一種適宜的底物發酵基質,既價格低廉又分布廣泛,且不與糧食產業形成競爭。相比之下,利用農業、工業副產物資源作為生產L-乳酸的碳源,可以避免資源的浪費,并減弱廢棄物燃燒帶來的溫室效應,例如,陳曉佩等[5]利用玉米芯生產低聚木糖廢渣酶解碳源,在初始葡萄糖59.6 g/L,產L-乳酸7 g/L,糖酸轉化率僅為28.9%;楊雪欣等[6]利用大豆秸稈酶水解液中的可溶性糖,添加乳酸菌發酵L-乳酸,其糖酸轉化率為71.05%;WANG等[7]以蘆葦制漿廠產生的蘆葦鋸末為原料,預處理后采用分步水解發酵工藝,在以酶解液為碳源的情況下所產生的L-乳酸含量小于5 g/L。造紙工業中,竹材因表現出較好的制漿性能而成為非木漿的主要原料[8],梁川等[9]認為竹漿紙發展空間巨大,在良好的政策背景下具有廣闊的前景,但竹材在制漿備料過程中,會產生3%～5%的竹屑,通常作為燃料使用,經濟價值低,也是生物質資源的浪費。竹屑廢棄物中碳水化合物(纖維素、半纖維素)含量較高,且竹屑中的半纖維素可用于制備木糖[10],而利用竹屑中的纖維素作為一種新的碳源發酵產L-乳酸的研究較少。因此,本課題以竹屑為原料,利用蒸汽爆破預處理打破木質纖維素的細胞壁結構,將提取半纖維素后的竹屑采用分步糖化發酵工藝,對工藝關鍵參數生物轉化所得L-乳酸的影響進行研究,為竹基纖維素的利用提供了高值化途徑參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹屑,某紙業公司原料場;纖維素酶(≥700 units/g,最佳作用條件:pH 4.8、50 ℃),Sigma公司;凝結芽孢桿菌,農業農村部沼氣科學研究所;3,5-二硝基水楊酸、無水葡萄糖、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉均為分析純,國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200 series高效液相色譜,安捷倫科技有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩培養箱,一恒科學儀器有限公司;FE28pH計,梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1800紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;TESCAN VEGA3SBU掃描電子顯微鏡,捷克TESCAN公司;XFlash Detector 410-M能譜儀,德國布魯克公司;MS3000E激光粒度分析儀,英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將在-80 ℃下保藏的凝結芽孢桿菌室溫下解凍后,在超凈工作臺中用接種環蘸取甘油菌,劃線于MRS固體培養基上,放到50 ℃恒溫培養箱培養24 h;挑取MRS固體培養基上的單菌落接種于15 mL MRS液體培養基中,在50 ℃、150 r/min下培養10～12 h,為一級種子液;再吸取上述種子液10%(體積分數)接種到新鮮MRS液體培養基中,在50 ℃、150 r/min下培養12 h,得到菌懸液。

1.3.2 竹屑預處理

收集過1 mm篩孔的竹屑在烘箱溫度105 ℃下烘干備用,取一定質量的竹屑廢棄物調節水分至55%(質量分數)并放入密封袋中平衡水分,利用圖1中的QBS-80型蒸汽爆破分析試驗臺[11],在爆破壓力2.5 MPa、維壓時間3 min條件下對竹屑進行蒸汽爆破預處理,收集爆破渣備用。

圖1 竹基纖維素的制備及實驗工藝流程

1.3.3 竹基纖維素的制備及實驗工藝流程

將蒸汽爆破預處理后的竹屑在苯-乙醇混合液[2體積的苯及1體積的95%(體積分數)乙醇溶液]中利用索氏抽提器抽提6 h,烘干后用質量分數為8%的NaOH溶液按照料液比1∶35(g∶mL)在70 ℃、80 r/min恒溫水浴振蕩浸提5 h(包括超聲15 min)。剩余的竹基纖維素廢渣(簡稱“竹渣”)作為碳源用于L-乳酸的發酵試驗。

1.3.4 分步水解發酵

1.3.4.1 酶解工藝的優化

固定酶解體系100 mL,稱取一定質量“竹渣”于250 mL三角瓶中,添加纖維素酶(30、45、60、75、90 FPU/g),加入去離子水使總固體(total solids,TS)質量濃度為(20、50、80、110、140 g/L),再利用H2SO4或NaOH調整pH值為4.8,置于50 ℃、150 r/min搖床培養箱進行酶解反應(0、2、4、15、17…72 h)。反應結束后用高速冷凍離心機(13 500 r/min,5 min)離心酶解液,經0.22 μm濾膜過濾,適當稀釋后用高效液相色譜分析可發酵糖含量。

1.3.4.2 發酵工藝的優化

“竹渣”首先按上述酶解方法進行酶解,然后將酶解液混合均勻(不過濾)用于發酵。發酵采用250 mL三角瓶,固定發酵體系150 mL,調節發酵初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0),加入酵母粉(20 g/L)為氮源,用高壓蒸汽滅菌115 ℃下滅菌15 min,待冷卻后在無菌條件下接種菌株,初始接種量分別為5%、10%、15%、20%(體積分數),于50 ℃、150 r/min恒溫搖床培養(0、2、4、15、17…72 h),發酵結束后在無菌條件下取樣并用高速離心機(13 500 r/min,5 min)離心發酵液,經0.22 μm濾膜過濾,適當稀釋后用高效液相色譜測定L-乳酸濃度。

1.3.5 纖維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定采用GHOSE[12]所述方法。測得濾紙酶活為193 FPU/mL。

1.3.6 預處理后樣品酶水解

將蒸汽爆破預處理得到的爆破渣放入三角瓶用于酶解試驗,實驗條件:TS質量濃度20 g/L、酶添加量20 FPU/g、調節酶解液pH值為4.8,在50 ℃、120 r/min條件下于恒溫振蕩培養箱中反應24 h,過濾,測定還原糖濃度。

1.3.7 “竹渣”成分的測定

“竹渣”粉碎過篩,截取能通過0.38 mm篩孔而不能通過0.25 mm篩孔的細末備用。水分含量的測定:根據GB/T 2677.2—2011《造紙原料水分的測定》;纖維素含量的測定:參照硝酸-乙醇法[13];半纖維素含量的測定:參照范式洗滌法[14]。灰分含量測定:根據GB/T 742—2018《造紙原料、紙漿、紙和紙板 灼燒殘余物(灰分)的測定(575 ℃和900 ℃)》;苯-醇抽出物測定:根據GB/T 2677.6—1994《造紙原料有機溶劑抽出物含量的測定》;酸不溶木素含量測定:根據GB/T 2677.8—1994《造紙原料酸不溶木素含量的測定》。

1.3.8 掃描電子顯微鏡-能譜分析

取適量蒸汽爆破預處理前后的干燥樣品(0.075 mm),用離子濺射儀對竹屑纖維表面鍍金制作樣品。在加速電壓為20 kV下對纖維的表面形態結構進行觀察。利用電鏡配套能譜儀進一步分析C元素分布情況。

1.3.9 粒度分布檢測

取適量蒸汽爆破預處理前后的干燥樣品(0.075 mm),以去離子水為分散劑,攪拌轉速為13 000 r/min,測定溫度為25 ℃。其d(90)表示一個樣品的累次粒度分布數達到90%時所對應的粒徑。

1.3.10 高效液相色譜檢測

利用高效液相色譜儀測量酶解液中的可發酵糖濃度和發酵液L-乳酸濃度。色譜測定條件:HPX-87H色譜柱,柱溫35 ℃,示差折光檢測器檢測器(differential refractive index detector,RID)40 ℃,流動相5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,進樣量20 μL,進樣檢測時間30 min。糖酸生物轉化率[5]計算方法如公式(1)所示:

糖酸生物轉化率/%=

(1)

1.4 數據處理

每個實驗重復3次,結果表示為平均值±標準差,數據結果采用Origin 2021、PowerPoint 2016和 SPSS 22.0 軟件進行作圖及數據分析。

2 結果與分析

2.1 預處理對酶解還原糖釋放量的影響

將蒸汽爆破預處理前后的竹屑原料按照1.3.6節方法進行酶解反應,結果表明,未經蒸汽爆破預處理的竹屑原料酶解還原糖釋放量為(0.13±0.01) g/L,經過蒸汽爆破預處理后的竹屑原料酶解還原糖釋放量為(2.07±0.10) g/L,比未經蒸汽爆破預處理的酶解還原糖釋放量提高了15.9倍,兩者的酶解還原糖釋放量具有顯著性差異。由圖2-a、圖2-b看出,蒸汽爆破預處理后的竹屑纖維表面由于泄壓過程產生的機械剪切力而被撕裂,使纖維表面區域擴張,增大了纖維的反應表面積,利于纖維素酶酶液的滲透。從圖2-c、圖2-d可以看出,C元素在經過蒸汽爆破預處理之后明顯分布更密集,說明預處理使更多的纖維素暴露出來,為提高酶解還原糖的釋放量創造了條件。姜曉云[15]在實驗過程中發現原料還原糖產量隨著粒徑的減小而增大,本實驗也對蒸汽爆破預處理前后的竹屑進行粒徑分析。如圖3-a所示,蒸汽爆破預處理前后原料d(90)分別是126.209、108.999 μm;結合圖3-b和圖3-c可以看出蒸汽爆破預處理后的竹屑更加膨松,造成粒徑d(90)差異大的原因可能是結構松散,內部空隙增加,機械強度降低[16]。以上說明蒸汽爆破預處理可以顯著提高竹屑原料的酶解還原糖釋放量。

a-未經預處理竹屑原料微觀形貌;b-經蒸汽爆破預處理后竹屑原料微觀形貌;c-未經預處理竹屑原料C元素分布圖;d-蒸汽爆破預處理后竹屑原料C元素分布圖

a-蒸汽爆破預處理前后竹屑粒徑分析;b-未處理竹屑原料宏觀形貌;c-蒸汽爆破預處理后竹屑原料宏觀形貌

2.2 “竹渣”的成分分析

將“竹渣”按照1.3.7節方法進行成分分析,結果表明,“竹渣”水分占比“竹渣”試樣原質量的7.84%。“竹渣”的主要化學成分是纖維素,其質量分數為73.3%,可以作為發酵產L-乳酸的底物基質,為菌株的生長代謝提供營養物質—碳源。灰分的質量分數為1.18%、苯醇抽出物的質量分數為0.59%,兩者成分較低的原因可能是在超聲波輔助堿液提取半纖維素后清洗“竹渣”的過程中被水帶走。“竹渣”中酸不溶木素成分的質量分數為14.96%,較未經任何處理竹屑原料的酸不溶木素的質量分數降低了2.14%,何娟[17]在研究中發現木素的脫除有利于降低物料表面的疏水性和提高其纖維可及度,從而提高酶水解效率。本實驗將其作為發酵產L-乳酸的底物基質。

2.3 酶解實驗

2.3.1 酶解時間對酶解還原糖釋放量的影響

如圖4所示,隨著酶解時間的延長,由大量葡萄糖基構成的鏈狀高分子化合物纖維素糖苷鍵逐步斷裂成小分子葡萄糖,總糖(葡萄糖+木糖)含量逐漸提高;在反應初始階段還原糖濃度上升趨勢增長快速,反應到14 h后,上升速率逐漸變緩;在酶水解前期,產率(以總糖計)快速下降后趨于平緩,其主要原因是隨著酶解體系中糖濃度的增加,纖維素酶受到反饋抑制作用[18]。酶解54 h后總糖含量已無顯著性變化(P>0.05)。因此,可以確定酶解糖化時間為54 h。

圖4 酶解時間對酶解還原糖釋放量的影響

2.3.2 酶添加量對酶解還原糖釋放量的影響

酶液添加量對酶解還原糖釋放量的影響如圖5-a所示,隨著酶添加量的提高,還原糖濃度呈現先上升后下降的趨勢,在酶添加量60 FPU/g達到峰值。當酶添加量小于60 FPU/g,此時底物足夠多,酶分子愈多,則底物轉化為產物也更多,意味著底物的有效轉化率隨著酶添加量的增加而成直線地增加[19]。因此,在酶添加量15～60 FPU/g出現線性擬合趨勢,如圖5-b所示。其擬合曲線公式為:y=0.131 8x+2.970 8,R2=0.988 6。當酶量過高時,由于酶與底物結合達到飽和狀態,再增加酶量會造成反饋抑制作用使酶解還原糖釋放量降低。因此,可以確定酶添加量為60 FPU/g。

a-酶添加量對酶解還原糖釋放量的影響;b-酶添加量15～60 FPU/g的總糖濃度線性擬合圖

2.3.3 總固體濃度對酶解還原糖釋放量的影響

如圖6所示,隨著總固體濃度的上升,釋放的還原糖濃度總體呈現上升趨勢。當總固體濃度增加至14%,釋放還原糖的速率低于總固體濃度11%。由于反應是非均相反應,反應器中傳質阻力加大,還原糖濃度增加,而產物的抑制和酶的擴散受阻更加明顯。因此,底物濃度在一個適宜的范圍內即可。

圖6 總固體濃度對酶解還原糖釋放量的影響

2.4 糖化液的L-乳酸發酵

2.4.1 初始接種量對產L-乳酸的影響

菌株的初始接種量對發酵影響較顯著,接種量低會導致菌體生長緩慢,產酸速率低,發酵周期長;接種量過高會使菌體生長過快,造成營養物質缺乏而不利于發酵。如圖7所示,在初始接種量為5%時,與其他初始接種量條件下發酵液中L-乳酸的濃度具有顯著性差異(P<0.05)。因此,選擇菌株的初始接種量為5%較適宜。

圖7 初始接種量對產L-乳酸的影響

2.4.2 初始pH對產L-乳酸的影響

不同初始pH發酵環境條件下,其對發酵產L-乳酸的影響如圖8所示。隨著發酵初始pH的增加,L-乳酸的濃度逐漸上升;在pH 6.5時,L-乳酸濃度顯著高于pH 5.0、5.5、6.0(P<0.05),而調節pH值為7.0時,與pH 6.5時發酵液中L-乳酸濃度不具有顯著性差異(P>0.05),且糖酸轉化率在pH 6.5時最高。由于菌體在生長代謝過程中不斷產生的L-乳酸使發酵環境pH改變,進而改變生長環境中營養物質的可及性及有害物質的毒性[20]。因此,通過酸堿溶液調節發酵初始pH值為6.5較適宜。

圖8 初始pH對產L-乳酸的影響

2.4.3 發酵時間對產L-乳酸的影響

發酵時間對產L-乳酸的影響如圖9所示。殘存的糖濃度隨著發酵時間的延長而下降,菌體代謝產物L-乳酸及糖酸轉化率隨發酵時間延長呈現先上升后下降的趨勢,與張竇[21]研究結果一致。當發酵17 h時達到L-乳酸濃度峰值,其糖酸轉化率也達到最大值。發酵時間超過17 h后,發酵體系中的L-乳酸濃度與糖酸轉化率都開始下降。其原因是L-乳酸發酵是葡萄糖經糖酵解生成丙酮酸后還原的結果,所得產物L-乳酸還能進一步被降解[22]。因此,選擇發酵時間17 h較適宜。

圖9 發酵時間對產L-乳酸的影響

3 結論

a)蒸汽爆破法作為預處理手段可提高竹屑原料酶水解效率,通過SEM&EDS和粒度分析得出蒸汽爆破過程中纖維表面被機械撕裂和C元素的增加以及d(90)粒度分布的顆粒較小是纖維素酶酶解效率提高的主要原因。

b)竹渣主要成分是纖維素,以此為碳源研究了分步糖化發酵關鍵參數對酶解發酵的影響。在TS質量濃度140 g/L、酶添加量60 FPU/g、酶解54 h條件下糖化,總糖質量濃度可達31.19 g/L。將糖化液用于發酵試驗,在起始糖質量濃度19.43 g/L,發酵初始pH 6.5、菌株的初始接種量5%、發酵17 h條件下,L-乳酸質量濃度可達6.28 g/L,其糖酸轉化率高達80.87%。本研究結果為竹基纖維素生物轉化L-乳酸提供了一定的參考依據。