乳糖膽鹽體系大腸菌群測試片的研制及性能驗證

王杰偉,孫萬東,吳艷輝,何艷玲,2*

1(北京陸橋技術股份有限公司,北京,100123)

2(中國檢驗檢疫科學研究院,北京,100176)

隨著國家經濟的快速發展與人們健康意識的不斷提高,食品安全問題越來越受到人們的重視,在眾多食品微生物污染相關報道中,大腸菌群超標占比較高[1]。大腸菌群作為一類衛生指標菌,是食品安全微生物檢測中的主要檢測項目之一[2]。食品中大腸菌群的檢測方法主要依據為GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》,其中平板計數法 (以下簡稱國標方法),是在結晶紫中性紅膽鹽培養基(violet red bile agar,VRBA)培養基初篩后挑取典型與可疑菌落進行確證,檢測周期長,可疑菌落的選擇較難把握[3],另外對于產氣能力較弱的大腸菌群,檢出率略低。隨著GB 4789.3—2016標準修訂,大腸菌群測試片也將獲得更高的接受度和更廣的實際應用。當前大腸菌群測試片相關研究報導主要集中在測試片方法與國標方法的性能比對上[4-5],對于如何增強測試片對弱產氣型大腸菌群的檢出能力尚無明確報道。本文針對此問題進行了重點研究,以期進一步完善大腸菌群測試片技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

結晶紫中性紅膽鹽培養基(violet red bile agar,VRBA)、結晶紫中性紅肉湯、腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth,BHI)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(tryptic soy agar,TSA),北京陸橋技術股份有限公司;瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠、乳糖、膽鹽、乳酰基-N脂酰基鞘氨醇、正丙基-?乳糖苷、正辛基-β-D-乳糖苷,均為分析純,阿拉丁試劑有限公司;聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)膜,上海晶華膠粘新材料股份有限公司;紙基膠板,上海金標生物科技有限公司。

1.1.2 菌株

目標菌:弗氏檸檬酸桿菌ATCC43864、大腸埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌ATCC13882、產氣克雷伯菌ATCC13048;革蘭氏陽性菌非目標菌:糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC6538;革蘭氏陰性菌非目標菌:鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、銅綠假單胞菌ATCC10104;均購自美國菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

ME104電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;SG604-INT生物安全柜,美國Baker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

分別挑取上述試驗菌株的單菌落接種于BHI中,36 ℃培養24 h。取1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水中混合均勻,即為10-1稀釋液,重復上述操作將菌液稀釋至適宜稀釋度,其中目標菌、革蘭氏陰性非目標菌得到菌落總數處于102CFU/mL的菌懸液;革蘭氏陽性菌非目標菌得到菌落總數處于106CFU/mL的菌懸液;將4株目標菌的菌懸液各取2 mL混合,得到混合菌液。

1.3.2 測試片的制備

大腸菌群測試片的基材選用菌落總數測試片研究[6]時所使用的基材,即上層覆膜為厚度為0.22 mm PET塑料膜,底板為200 g防水型背膠相紙,將培養基組分混合均勻后添加于測試片底板培養區域。

1.3.3 測試片載體的篩選

參照REN等[7]研究的相關信息,選擇瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠進行試驗,篩選可應用于大腸菌群測試片的載體。分別將15 g/L瓜爾膠、海藻酸鈉、黃原膠、卡拉膠,與15 g/L結晶紫中性紅肉湯培養基、10 g/L乳糖和1.2 g/L三號膽鹽混合均勻后,添加至測試片培養區域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標菌混合菌液,于37 ℃培養24 h觀察菌落狀態,同時接種TSA培養基作為對照,計算回收率。本研究中各試驗均設置3組平行。

1.3.4 單因素-正交試驗確定培養基關鍵組分添加量

1.3.4.1 冷水可溶凝膠添加量

分別將9、12、15、18、21 g/L卡拉膠,與15 g/L結晶紫中性紅肉湯培養基、10 g/L乳糖和1.2 g/L三號膽鹽混合均勻后,添加至測試片培養區域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標菌混合菌液,于37 ℃培養24 h觀察菌落狀態,同時接種TSA培養基作為對照。

1.3.4.2 乳糖添加量

分別將4、6、8、10、12 g/L乳糖,與15 g/L結晶紫中性紅肉湯培養基、1.2 g/L三號膽鹽和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養區域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標菌混合菌液,于37 ℃培養24 h觀察菌落狀態,同時接種TSA培養基作為對照。

1.3.4.3 膽鹽添加量

分別將膽鹽按0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 g/L,與15 g/L結晶紫中性紅肉湯培養基、10 g/L乳糖和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養區域制備為測試片,每種測試片分別接種1 mL目標菌混合菌液與非目標菌液,于37 ℃培養24 h觀察菌落狀態,同時接種TSA培養基作為對照。

1.3.4.4 最優組合的確定

根據上述實驗中確定的各關鍵組分的添加水平范圍,將卡拉膠(12、15、18 g/L)、乳糖(6、8、10 g/L)與膽鹽(1.2、1.4、1.6 g/L)進行三因素三水平正交試驗,確定關鍵組分最優組合。

1.3.5 針對特殊大腸菌群的優化-誘導劑的篩選

將乳酰基-N脂酰基鞘氨醇、正丙基-?乳糖苷、正辛基-?-D-乳糖苷3種結構類似物,按50～350 mg/L添加量分別設置試驗組,與15 g/L結晶紫中性紅肉湯培養基、10 g/L乳糖、1.2 g/L三號膽鹽和15 g/L卡拉膠混合均勻后,添加至測試片培養區域制備為測試片,接種1 mL目標菌混合菌液后于37 ℃培養24 h觀察菌落形態。同時設置陰性對照組,將每個試驗組均做去除乳糖組分的處理,混合均勻后添加至測試片培養區域制備為測試片,接種1 mL弱產氣型菌株產氣克雷伯菌菌液后于37 ℃培養24 h觀察菌落形態。

1.3.6 大腸菌群測試片性能驗證

1.3.6.1 標準菌株驗證

參照GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》中VRBA培養基質控方法,使用標準菌株對本文研制的大腸菌群測試片進行性能驗證,將菌液接種至大腸菌群測試片上,于37 ℃ 培養24 h。其中目標菌驗證回收率,統計測試片上四周有氣泡菌落的數量,同時接種TSA培養基作為對照,計算回收率;非目標菌驗證抑制性,觀察測試片上是否有菌落生長;特異性驗證,觀察測試片上鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌的菌落形態。

1.3.6.2 實際樣品驗證

選取50份不同基質類型的市售食品樣品,梯度稀釋后分別使用測試片方法與國標方法進行大腸菌群計數。建立測試片法-國標方法檢測結果的標準曲線,采用線性回歸分析以檢驗不同方法檢測結果的一致性。

1.4 數據統計與分析

試驗數據使用SPSS 20.0軟件進行統計分析,顯著水平設定P<0.05,各組試驗重復3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 測試片載體的確定

大腸菌群測試片中載體除固化粘合,為培養體系提供一個與固體培養基較近的生長環境外,還需有利于微生物發酵乳糖產生氣泡并將其有效截留。常規培養基載體瓊脂在冷水中不可溶,脆性易收縮[8],瓊脂顆粒間空隙較多,無法有效截留微生物發酵產生的氣泡;測試片研究涉及到的載體包括無紡布,紙基與冷水可溶凝膠,其中無紡布與紙基載體均無此特性[9],唯有冷水可溶凝膠遇冷水即水化形成黏稠半流體狀態,分子間阻力更小,有利于氣泡的產生與保留,符合大腸菌群測試片對載體的要求[10-11]。

不同結構的冷水可溶凝膠物理與化學特性也有不同[12-13],如黏稠度、擴散阻力等,會對微生物生長、色素阻隔、氣泡截留等測試片關鍵指標產生影響。海藻酸鈉為一種天然線性多糖[14],生物相容性好[15-16],作為載體培養后有較多區域被微生物液化,此狀態下的測試片載體阻力小,氣泡整體直徑較大,但可能對氣泡有一定的吸收能力,測試片上氣泡數偏少且幾乎沒有較小氣泡,同時載體已經失去了對色素的阻隔性,無法準確計數;黃原膠化學結構穩定[17-18],作為載體培養后基本無液化情況,但阻力過大,氣泡直徑均偏小,菌落數量偏少,實際檢測時可能導致漏檢;瓜爾膠遇水后形成膠狀物[19],作為載體無明顯液化現象,但由于其阻力小且結構松散,氣泡均較大,多個氣泡會擴散融合為一個大氣泡,無法準確進行計數;卡拉膠是一種提取自藻類的多糖,親水無毒[20],作為載體制備的測試片在上述各項指標中均有良好的表現,氣泡截留率略低原因為混菌中產氣克雷伯菌產氣能力較差,過小氣泡未統計,此問題可通過組分優化進行改進。

4種冷水可溶凝膠特性歸納見表1,制備的測試片在接種目標菌培養后狀態見圖1。

a-卡拉膠;b-海藻酸鈉;c-黃原膠;d-瓜爾膠

表1 四種冷水可溶性凝膠性能比對

2.2 培養基關鍵組分添加量

2.2.1 冷水可溶凝膠添加量范圍

不同卡拉膠添加量對測試片回收率的影響相對較小,氣泡截留率以及測試片強度則有明顯差異,添加量低于9 g/L時培養基強度弱,接種時易被菌液沖散,培養后不同菌落產生的氣泡有擴散融合的情況;增加到12 g/L時強度明顯改善,繼續增加至21 g/L后,體系凝膠強度過大,氣泡形態整體變弱,部分菌株產生的氣泡過小易被漏檢。卡拉膠添加量在12～18 g/L測試片氣泡形態易于觀察,氣泡截留率較高。

不同卡拉膠添加量制備的測試片培養后統計結果見表2。

表2 卡拉膠添加量對測試片性能影響

2.2.2 乳糖添加量范圍

大腸菌群國標方法中以乳糖發酵產氣對菌株是否為大腸菌群進行確認,需在大腸菌群測試片體系中添加適宜含量的乳糖以實現菌株確認功能。乳糖添加量4 g/L時含量偏低,微生物之間競爭作用導致部分微生物無法有效發酵乳糖產氣,氣泡整體偏小;隨著乳糖添加量增加此問題得到明顯改善,但當乳糖添加量達到12 g/L時,由于其發酵產物乳酸對微生物的抑制作用[21],活性較弱或存在損傷的微生物被抑制,回收率下降明顯,僅活性較高的微生物生長并發酵產氣,導致整體氣泡偏大,氣泡截留率異常升高。乳糖添加量在6～10 g/L較為適宜。不同乳糖添加量制備的測試片培養后統計結果見表3。

表3 乳糖添加量對測試片性能影響

2.2.3 膽鹽添加量

膽鹽對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用,可降低其細胞膜表面張力,使細胞膜破壞或菌體裂解,對革蘭氏陰性菌可能有誘導細胞膜多聚糖重塑等作用[22-24],抑制作用較輕微,但添加量過多時弱產氣型目標菌產氣性能受影響較為明顯;另一方面膽鹽內內既含親水性的羥基和羧基,又含疏水性的甲基及烴核,主要構型具有親水和疏水兩個側面,使分子具有界面活性分子的特征,能降低親水和疏水兩相之間的表面張力[25],即具備表面活性劑功能。由于測試片培養基中凝膠雖為冷水可溶且親水,但在無表面活性劑的情況下稀釋液并不能在培養基表面分散完全,一定添加量的膽鹽對于保證稀釋液在測試片培養區域的水擴散性能有著重要影響,在測試片體系下需對膽鹽的添加量進行優化。不同膽鹽添加量制備的測試片性能見表4。

表4 膽鹽添加量對測試片性能影響

膽鹽添加量過低時,無法有效抑制革蘭氏陽性菌的生長,測試片培養基表面水擴散性能差,稀釋液無法自由擴散滿整個培養區域,見圖2,此種情況增加測試片局部稀釋液溢出的風險;添加量達到1.2 g/L時,水擴散性能已較理想,繼續增加膽鹽添加量,水擴散速度雖繼續增加,但幅度已不大,雖不影響回收率,但添加量達到1.8 g/L時氣泡截留率明顯降低,說明隨著膽鹽添加量的增加,弱產氣型目標菌的產氣性能開始被抑制,綜合抑制性、水擴散性能與對目標菌產氣性能的影響,膽鹽添加量確定為1.2～1.6 g/L。

圖2 試驗組誘導劑誘導效果

2.2.4 最優組合的確定

根據1.3.4節中確定的3種關鍵組分添加量范圍進行了三因素三水平正交試驗,結果見表5。

表5 關鍵組分正交試驗結果

3種關鍵組分對測試片氣體截留性能的影響程度主次順序為膽鹽>乳糖>卡拉膠,最優配比為卡拉膠15 g/L,乳糖10 g/L,膽鹽1.2 g/L,經過驗證在此配比下,氣泡截留率為78.7%。

2.3 誘導劑的篩選

微生物菌株在測試片上產生氣泡的大小取決于菌株乳糖利用能力,自然界中存在一定比例的弱產氣型大腸菌群菌株,即使在營養充足,菌株未受損傷時產氣量仍很少甚至不產氣[26],另外產氣能力較強的菌株在活性不佳時產氣性能也會受到影響,在實際檢測過程中易被漏檢。相關研究中尚無對此問題改進的報道,為提高測試片對此類菌株的檢出能力,本文參考本單位多年微生物快檢產品研發經驗,嘗試添加少量無抑菌性的乳糖結構類似物作為發酵誘導劑,在不產生假陽性氣泡的前提下增加弱產氣型目標菌的產氣量,本研究中選擇乳酰基-N脂酰基鞘氨醇、正丙基-?乳糖苷、正辛基-?-D-乳糖苷3種組分作為誘導劑進行試驗。

培養基中分別加入乳酰基-N脂酰基鞘氨醇(添加量達到250 mg/L)或正丙基-?乳糖苷(添加量達到200 mg/L)后,氣泡截留率可得到提升;添加正丙基-β乳糖苷的對照試驗中,在100 mg/L添加量時陰性對照已有明顯產氣情況,此結構類似物在誘導菌株發酵乳糖的過程中自身也被分解產生氣泡,在檢測過程中可能導致非目標菌被誤判為大腸菌群;乳酰基-N脂酰基鞘氨醇在添加量為250 mg/L時有良好的誘導效果,且對照組添加量為350 mg/L時陰性對照仍未發現產氣菌落,此結構類似物在誘導微生物發酵乳糖的過程中應發揮了類似催化劑的作用,或即使在誘導過程中被消耗也不會發生產氣效應。

使用含有250 mg/L乳酰基-N脂酰基鞘氨醇組分的測試片,與未添加該組分的測試片對混合菌液進行比對驗證,共進行10次檢測,使用SPSS軟件進行配對t檢驗,P<0.05,添加誘導劑測試片產氣菌落數平均為94.6 CFU/片,未添加誘導劑測試片產氣菌落平均數為81.1 CFU/片,說明在測試片中添加250 mg/L乳酰基-N脂酰基鞘氨醇作為誘導劑,對測試片產氣泡菌的檢出率能有顯著提升。

3種結構類似物誘導效果見圖2,對照試驗結果見圖3,驗證數據統計分析見表6。

a-100 mg/L正丙基-?乳糖苷對照;b-350 mg/L乳酰基-N脂酰基鞘氨醇對照

表6 標準菌株驗證結果

2.4 標準菌株驗證

4株大腸菌群標準菌株在測試片形成四周有明顯氣泡的菌落,回收率均達到75%以上,滿足現行國標方法GB 4789.28—2013中VRBA培養基生長率(回收率)達到70%即滿足要求的評判標準,革蘭氏陽性非目標菌均被完全抑制,沙門氏菌等在國標方法檢測時易與目標菌混淆的干擾菌,在測試片上形成四周無氣泡的菌落,可直接與目標菌進行區分,顯示出測試片在特異性與便捷性上的優勢,測試片標準菌株驗證結果見表6與圖4。

a-弗氏檸檬酸桿菌;b-銅綠假單胞菌

2.5 實際樣品驗證

使用大腸菌群測試片與國標方法對50份市售食品樣本進行檢測,2種檢測方法的線性相關曲線見圖5(未檢出大腸菌群的樣品,結果記為1 CFU/g),2種方法R2達到0.98。對于少部分的樣品,2種方法計數結果存在少許偏差,原因為國標方法在挑取典型菌落進行確證的步驟中操作人員主觀因素對結果有影響,同時測試片方法補充了誘導劑成分,加強了對樣本中弱產氣目標菌的檢測能力,部分樣品計數結果較國標方法略高。本次驗證國標方法檢測為陰性的11份樣品中,有1份使用測試片法檢測出少量產氣量較少的菌落,經國標方法驗證確定為大腸菌群,另有5份測試片檢驗結果較國標方法偏高的樣品,于每張測試片上挑取10個氣泡偏小的菌落用國標方法確證后均判定為大腸菌群。去除掉上述6個樣品后,使用SPSS將2種方法檢測結果進行配對t檢驗,P>0.05,無明顯差異。說明對于常規樣品,測試片與國標方法檢測結果無明顯差異,對于少量含有弱產氣目標菌的樣品,使用測試片法可提升檢出率。

圖5 大腸菌群測試片法與國標法檢測結果相關曲線

3 結論與討論

本文以大腸菌群國標檢測方法檢測流程為參照,將VRBA體系與發酵驗證體系相結合研制出大腸菌群測試片,可在一張測試片上同時實現選擇性分離與產氣驗證。測試片關鍵環節為培養基組分研制,VRBA培養基中的瓊脂在冷水中不可溶,在測試片形式下無法作為載體,本研究引入冷水可溶凝膠作為培養體系載體,為微生物提供與固體培養基類似的生長環境,同時利用其成膠性收集截留大腸菌群在培養過程中產生的氣體,實現于測試片上同時進行菌落形態與發酵產氣2種性狀的觀察。在實際研究過程中通過理化性能篩選出卡拉膠作為測試片載體,并通過正交試驗確定卡拉膠15 g/L、乳糖10 g/L、膽鹽1.2 g/L的最優添加量組合;最后本研究篩選出乳酰基-N脂酰基鞘氨醇作為乳糖發酵誘導劑,添加量為250 mg/L時,可顯著提升特殊弱產氣型目標菌產氣率,最大程度避免對此類微生物的漏檢。標準菌株進行性能驗證中,測試片回收率及革蘭氏陽性菌抑制性均滿足GB 4789.3—2013中對VRBA培養基的評判標準,同時沙門氏菌等革蘭氏陰性非目標菌無氣泡生成,特異性良好;實際樣品檢測中,測試片與國標中平板計數法計數結果一致性良好,說明本文研制的大腸菌群測試片在應用于實際食品微生物檢測時結果與國標方法結果無明顯差異,并且在一定程度上解決了當前國標方法在實際檢測過程中對部分弱產氣型大腸菌群檢出能力略低的問題。

大腸菌群測試片在進行樣本檢測時相對于國標方法具有明顯的優勢,使用便捷,結果讀取環節相比于國標方法需依靠經驗挑取典型菌與可疑菌,進行產氣驗證的判讀方式,測試片只需對四周有氣泡的菌落進行計數即可,結果獲取更為客觀便捷,同時測試片最大優勢分離確認同時進行,將檢測時間由48 h縮短為24 h,對于食品行業意義重大。在菌落總數測試片已經進入國家標準的背景下,大腸菌群測試片產品作為食品行業快速檢測的解決方案,將有更大的發揮空間。一款成熟的產品包括技術性能與批量化的生產工藝2個環節,本文僅在技術可行性上進行了嘗試,如何實現測試片批量化生產是后續研究重點,本研究所做工作可為從事大腸菌群測試片研究的行業人員提供思路,為測試片產品的商品化積累經驗。