參芪補腎活血湯改善兔股骨骨折延遲愈合的機制初探*

付學(xué)敬，朱琳，朱明喜，韓崇濤

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨傷科，鄭州 450003；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨病科，鄭州 450003）

成人骨愈合一般指骨組織和功能完全恢復(fù)，沒有并發(fā)癥出現(xiàn)，然而，開放性骨折、合并疾病、創(chuàng)傷后大骨缺損、假體松動或腫瘤切除擴大，都可能妨礙組織的完全再生，最終導(dǎo)致骨延遲愈合、不愈合或畸形愈合[1]。此類患者常伴有疼痛、周圍關(guān)節(jié)僵硬、運動功能喪失，嚴重可能出現(xiàn)殘疾[2]。骨延遲愈合形成機制是多因素的，這導(dǎo)致治療手段困難、復(fù)雜且昂貴。目前治療骨延遲愈合的手段包括手術(shù)自體/異體骨移植，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）負載骨替代物填充和物理復(fù)位治療，所有這些干預(yù)措施都存在局限性，存在材料有限、成本高、治療效果問題和不良反應(yīng)問題[3-4]，因此迫切需要找到更合理有效的治療方法。

中醫(yī)將骨延遲愈合歸為 “骨萎癥”“骨痿”“骨痹”等范疇，具有豐富的治療經(jīng)驗，認為肝腎在骨愈合中占據(jù)重要地位，肝腎虧虛會造成骨愈合緩慢甚至不愈合，從而，經(jīng)絡(luò)受阻，產(chǎn)生骨痿[5]。參芪活血湯具有清熱定驚、平喘利尿、活血止痛、散瘀通經(jīng)的功效[6]，加用補腎中藥有利于骨組織愈合。因為BMP與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）在骨損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，參芪活血湯方中的黃芪等藥物對BMP 蛋白與TGF-β1 均有明顯的調(diào)節(jié)作用，對新生血管也有促進作用，但參芪補腎活血湯是否能通過調(diào)節(jié)骨組織中BMP 蛋白與TGF-β1含量促進骨愈合的效果尚未明確。因此本研究旨在初步探討參芪補腎活血湯對兔股骨骨折延遲愈合的調(diào)節(jié)效果，為臨床用藥提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，40 只，清潔級，雄性，體質(zhì)量2～3 kg，3～4 月齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030。由河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會審批通過（20230814001）。

1.2 主要試劑 參芪補腎活血湯：黃芪20 g，太子參20 g，熟地黃20 g，茯苓20 g，山藥20 g，丹參20 g，淫羊藿20 g，煅龍骨30 g，川牛膝15 g，龜板15 g，知母10 g，菟絲子10 g，五味子10 g，川芎10 g，鹿角片5 g，藥材由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科提供，藥材加水煎制2 遍，合并濾液后濃縮制成濃度為含生藥1 g/mL，冷藏備用。

BMP-2、BMP-7、TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和β-actin 抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；總核糖核酸（RNA）提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；所有引物均由生工生物工程（上海） 股份有限公司提供；DAB 試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 主要儀器 TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機（常州市中威電子儀器有限公司）；BA210 Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；Halo 101-WL-HALO-1 數(shù)據(jù)圖像分析系統(tǒng)（美國Indica labs 公司）。

1.4 模型構(gòu)建[9]與動物分組給藥 將30 只新西蘭大白兔以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）從耳緣靜脈注射麻醉，取俯臥位。在大腿中段外側(cè)處作一個長約4 cm的縱向切口，鈍性分離皮膚，盡可能暴露兔股骨干，顯露股骨，然后分別于股骨近端及遠端釘入兩枚1.5 mm 外固定架螺釘，安裝外固定架，保證4 枚螺釘在同一水平面上，同時外固定架牢固可靠。用線鋸離斷股骨，模型組與參芪補腎活血湯各組均截取10 mm 骨皮質(zhì)，去除內(nèi)外骨膜及骨髓；對照組僅離斷股骨，保留內(nèi)外骨膜及骨髓，不做其他處理。為避免截骨過程中產(chǎn)生的熱量灼傷軟組織，截骨過程中需反復(fù)大量生理鹽水沖洗截骨部位。截骨完成后，模型組與參芪補腎活血湯各組保持骨折斷端1 mm 的間隙，空白組保持骨折斷端接觸，不做其他處理。腿部傷口徹底止血后使用0.9%氯化鈉注射液及5%碘伏原液反復(fù)沖洗，最后進行閉合、縫合與包扎。術(shù)后將大白兔于清潔級環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由活動。術(shù)后1 周內(nèi)注射青霉素40×104U 預(yù)防感染，1 次/日，并用5%碘伏原液進行手術(shù)切口消毒并常規(guī)換藥預(yù)防感染，2 次/日。造模后8 周將骨延遲愈合動物進行分組，隨機分為模型組、參芪補腎活血湯高劑量組（10 mL/kg）與參芪補腎活血湯低劑量組（5 mL/kg），劑量參考臨床上成人用量進行計算確定，另取健康動物作為空白組，每組10 只，參芪補腎活血湯各組灌胃水煎液，空白組與模型組灌胃等量生理鹽水，每天1 次，于給藥4 周后處死動物進行后續(xù)指標檢測。

1.5 骨組織病理學(xué)檢測 收集各組動物愈傷處股骨組織（空白組取相同位置骨組織），固定24 h 后置于15%的乙二胺四乙酸（EDTA）中進行脫鈣，然后使用95%乙醇與二甲苯脫水，最后使用石蠟進行包埋，切片。使用蘇木精-伊紅（HE）染液對切片染色，在顯微鏡下拍照觀察，并參照文獻[10]根據(jù)骨愈合組織學(xué)分級標準進行評分。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 收集各組動物血清，使用總RNA 提取與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA 提取與逆轉(zhuǎn)錄（操作步驟見試劑盒說明書），以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 相對表達水平。引物序列BMP-2：上游5’-GAGAAAAGCGTCAAGCGAAAC-3’：下游5’-AGTAAAAGGCGTGATACCCCG-3’；BMP-7：上游5’-TCGGCACCCATGTTCATGC-3’，下游5’-GAG GAAATGGCTATCTTGCAGG-3’；TGF-β1：上游5’-CTGAGCCACGGAGAGGAAATAG-3’，下游5’-GAG CAGGAAGGGTCGGTTC；VEGF：上游5’-GCAGACC AAAGAAAGACAG-3’，下游5’-TTGCAGGAACATT TACACG-3’；β-actin：上游5’-TGGCTCTAACAGTC CGCCTAG-3’，下游5’-AGTGCGACGTGGACATC CG-3’。

1.7 免疫組織化學(xué) 將各組動物的股骨組織切片進行抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶等一系列操作后，進行DAB 顯色，最后使用中性樹膠封片，在顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集，每張切片先于100 倍下觀察全部組織，再分別采集200 倍及400 倍顯微圖像，共采集4 張。使用Halo 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計算每張圖像陽性面積占比。觀察股骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白的表達情況。

1.8 統(tǒng)計分析 使用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析。采用Shapiro-Wilk 法檢驗所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性。計量資料用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物新生股骨組織病理學(xué)觀察結(jié)果 各組新生骨組織病理結(jié)果見圖1。空白組：骨組織由致密的皮質(zhì)骨和其包圍的骨髓腔組成，結(jié)構(gòu)較完整；骨表面未見缺損，較平滑；骨板較完整，骨板內(nèi)橫向穿越的小管，稱為穿通管，見小血管和神經(jīng)通過，未見明顯骨小梁。模型組：骨組織之間可見明顯骨損傷區(qū)域，損傷區(qū)纖維組織增生少，纖維骨痂未見形成；損傷區(qū)深部骨小梁出現(xiàn)少量，骨髓腔內(nèi)纖維組織較少，少見軟骨細胞形成。參芪補腎活血湯高劑量組：骨組織結(jié)構(gòu)較完整；骨表面局部缺損，未見明顯纖維組織增生或炎性細胞浸潤；損傷區(qū)周圍可見骨小梁顯著增多，部分骨髓腔見少量纖維組織；其他未見明顯病理改變。參芪補腎活血湯低劑量組：骨組織之間可見骨損傷區(qū)域，損傷區(qū)見較多纖維組織增生；損傷區(qū)淺層較多成骨骨痂形成，骨小梁輕度增多，部分骨髓腔見少量纖維組織以及較多漿液性物質(zhì)滲出；其他未見明顯病理改變。與空白組比較，模型組病理評分降低（P<0.01）；與模型組比較，參芪補腎活血湯高、低劑量組病理評分升高（P<0.01）；與參芪補腎活血湯高劑量組相比，參芪補腎活血湯低劑量組病理評分降低（P<0.05），結(jié)果見表1。

圖1 各組動物股骨組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE 染色）Fig.1 Pathological observation of femur tissue in each group(HE staining)

表1 各組大鼠骨痂病理學(xué)組織評分比較（±s）Tab.1 Comparison of pathological scores of calluses in each group of rats（±s） 分

表1 各組大鼠骨痂病理學(xué)組織評分比較（±s）Tab.1 Comparison of pathological scores of calluses in each group of rats（±s） 分

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與參芪補腎活血湯高劑量組比較，△P<0.05。

動物數(shù)10 10 10 10組別空白組模型組參芪補腎活血湯高劑量組參芪補腎活血湯低劑量組病理評分8.0±0.0 1.8±0.7**6.5±0.8##5.3±0.8##△

2.2 參芪補腎活血湯對血清中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF mRNA 的影響 與空白組比較，模型組BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 表達水平下降（P<0.01）；與模型組比較，參芪補腎活血湯高劑量組BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 表達水平升高（P<0.05，P<0.01），低劑量組各項指標有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與參芪補腎活血湯高劑量組比較，參芪補腎活血湯低劑量組各項指標有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組動物血清中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF mRNA 表達情況比較（2-ΔΔCT 值，±s）Tab.2 Comparison of mRNA expression of BMP-2，BMP-7，TGF-β1 and VEGF in serum of animals in each group（2-ΔΔCT，±s）

表2 各組動物血清中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF mRNA 表達情況比較（2-ΔΔCT 值，±s）Tab.2 Comparison of mRNA expression of BMP-2，BMP-7，TGF-β1 and VEGF in serum of animals in each group（2-ΔΔCT，±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 BMP-7 TGF-β1 VEGF空白組 1.01±0.14 1.00±0.11 1.01±0.18模型組 0.55±0.04** 0.61±0.13** 0.56±0.18**參芪補腎活血湯高劑量組 0.78±0.11# 0.86±0.08## 0.82±0.04##參芪補腎活血湯低劑量組 0.66±0.14 0.67±0.08 0.63±0.06動物數(shù)10 10 10 10 BMP-2 1.02±0.25 0.52±0.05**0.87±0.16#0.71±0.10

2.3 參芪補腎活血湯對骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白的影響 與空白組比較，模型組骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白表達水平下降（P<0.01）；與模型組比較，參芪補腎活血湯高劑量組BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF蛋白表達水平升高（P<0.05），低劑量組各項指標有升高趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與參芪補腎活血湯高劑量組比較，參芪補腎活血湯低劑量組各項指標有降低趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）結(jié)果見表3，圖2。

圖2 各組動物股骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白表達情況（DAB，×400）Fit.2 Protein expression of BMP-2，BMP-7，TGF-β1 and VEGF in femoral tissue of animals in each group（DAB，×400）

表3 各組動物股骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白表達情況比較（OD 值，±s）Tab.3 Comparison of protein expression of BMP-2，BMP-7，TGF-β1 and VEGF in femoral tissue of animals in each group（OD，±s）

表3 各組動物股骨組織中BMP-2、BMP-7、TGF-β1 和VEGF 蛋白表達情況比較（OD 值，±s）Tab.3 Comparison of protein expression of BMP-2，BMP-7，TGF-β1 and VEGF in femoral tissue of animals in each group（OD，±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

?組別 BMP-7 TGF-β1 VEGF空白組 0.250±0.006 0.244±0.007 0.243±0.010模型組 0.215±0.008** 0.208±0.015** 0.194±0.013**參芪補腎活血湯高劑量組 0.234±0.012# 0.227±0.002# 0.221±0.010#參芪補腎活血湯低劑量組 0.230±0.006 0.210±0.008 0.200±0.019動物數(shù)10 10 10 10 BMP-2 0.236±0.024 0.187±0.008**0.228±0.010#0.207±0.011

3 討論

骨是一種動態(tài)組織，其發(fā)育和維持受到負重活動所產(chǎn)生的生物力學(xué)刺激的嚴重影響。骨折后，骨組織具有再生和恢復(fù)關(guān)鍵生物力學(xué)功能的內(nèi)在能力。大約5%的骨缺損患者在最初治療后未能有效愈合，且仍保持機械不穩(wěn)定[11]。骨延遲愈合的病理生理學(xué)仍然知之甚少，雖然如不適當?shù)臋C械固定等情況可以通過主動復(fù)位進行治療，但在其他大多數(shù)情況下難以開展針對治療，包括感染、血管化不良和其他疾病誘導(dǎo)等[12]。本實驗采用在嚙齒類動物中創(chuàng)建一個臨界大小的節(jié)段骨缺損來完成骨延遲愈合模型，在造模8 周發(fā)現(xiàn)兔股骨組織尚未完全愈合，符合骨延遲愈合的特征。由于參芪補腎活血湯具有益氣補血、補肝強腎、強壯筋骨的作用，灌胃給藥4 周后發(fā)現(xiàn)參芪補腎活血湯能有效促進兔股骨組織愈合，組織病理學(xué)檢測顯示參芪補腎活血湯刺激了骨延遲愈合區(qū)域的血管生成，誘導(dǎo)纖維組織生成并減少炎癥反應(yīng)，但其可能涉及的機制還需進行下一步研究。

TGF-β1 是TGF-β 超家族成員之一，通過增強細胞外基質(zhì)重構(gòu)、增加軟骨和愈傷組織的形成來促進骨組織愈合[13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在人骨折愈合過程中體內(nèi)TGF-β1 水平會升高，因此TGF-β1 水平降低可以用于預(yù)測與評估骨折延遲愈合和不愈合[14]。BMP 是TGF-β 超家族成員和強大的骨誘導(dǎo)分子，另一項研究表明，骨延遲愈合患者中出現(xiàn)BMP-2 表達缺失的情況[15]，因此體內(nèi)BMP 水平可以反映骨組織愈合周期是否正常進行。重組人BMP 的成骨誘導(dǎo)作用已在動物模型和臨床試驗中被證實可以用于骨折修復(fù)、危急骨缺損的愈合和脊柱融合[16]。其中，BMP-2 和BMP-7 已被臨床應(yīng)用于骨延遲愈合和骨折[17]，但直接移植BMP-2 在臨床應(yīng)用中面臨的最大挑戰(zhàn)是不良反應(yīng)，包括過度炎癥、異位骨化和不規(guī)則骨形成，這會導(dǎo)致疼痛和患者預(yù)后不理想[18]。近年來有研究表明，骨延遲愈合應(yīng)用BMP-7 治療效果更好[19]。本研究檢測了骨延遲愈合動物中的BMP-2、BMP-7、TGF-β1 基因與蛋白發(fā)現(xiàn)這些指標的表達水平下降，與上述研究的結(jié)果基本一致，使用參芪補腎活血湯后，BMP-2、BMP-7、TGF-β1 的基因與蛋白表達均出現(xiàn)明顯升高，而沒有出現(xiàn)異常上升的情況，這說明與直接移植重組BMP-2 和BMP-7 不同，參芪補腎活血湯不會造成過度成骨誘導(dǎo)，使異位與不規(guī)則骨化幾率下降。VEGF 是血管生成最重要的介質(zhì)，機體在骨折后2 周，血清中VEGF 水平會顯著增加，有研究發(fā)現(xiàn)，骨折處組織血管生成緩慢甚至不生成是導(dǎo)致延遲愈合或者失敗的重要原因[20]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)VEGF 和BMP-2 在骨愈合方面具有協(xié)同作用。BMP 家族蛋白能增加成骨細胞中VEGF 的表達，在體外研究中證實了通過BMP 信號通路刺激血管生成[21]。因此，本研究在發(fā)現(xiàn)參芪補腎活血湯對BMP 與TGF-β1 有調(diào)節(jié)作用后，同時對血清中VEGF 與組織中VEGF 蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)骨延遲愈合動物中VEGF 的基因與蛋白均呈現(xiàn)下降趨勢，而灌胃參芪補腎活血湯后能改善這一狀況，說明參芪補腎活血湯促進骨組織愈合機制可能是通過調(diào)節(jié)BMP 與TGF-β1 水平從而誘導(dǎo)骨缺損組織血管生成。

參芪補腎活血湯方中的黃芪、太子參作為君藥，具有補中益氣的功效，淫羊藿、牛膝、菟絲子等具有強壯筋骨之效，熟地黃補血、丹參健脾、五味子養(yǎng)陰固精，多藥合用，對骨延遲愈合具有積極的作用效果。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參多酚對血管內(nèi)皮細胞活動有刺激作用，可用于促進骨折愈合[22]；淫羊藿苷促進大鼠骨折創(chuàng)傷后骨重建[23]，對大鼠骨折處血管形成也有促進作用[24]。本研究表明參芪補腎活血湯不僅能增加BMP-2 與BMP-7 等骨誘導(dǎo)分子含量，誘導(dǎo)TGF-β1 生成促進骨組織修復(fù)，還能促進骨缺損處血管形成，為骨組織愈合提供基礎(chǔ)。在本研究中，中藥方劑高劑量與低劑量僅在病理層面上出現(xiàn)了療效不同，在BMP 與TGF-β1 相關(guān)指標中并沒有出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，有可能是因為中藥復(fù)方有多種藥用成分，在未確定是何種成分在骨延遲愈合中發(fā)揮主導(dǎo)作用的情況下，復(fù)方劑量的增減所呈現(xiàn)的療效差異是有局限性的，而且復(fù)方療效也與個體差異相關(guān)，只要復(fù)方劑量處于安全范圍內(nèi)，結(jié)果可信度都是可以保證的，因此，進一步明確參芪補腎活血湯何種成分在骨延遲愈合占主導(dǎo)地位就是今后研究的重點，同時促進股骨延遲愈合的相關(guān)機制仍需進一步探討。