桃葉珊瑚苷調節RhoA/ROCK 信號通路對膠質母細胞瘤細胞活力和上皮間質轉化的影響*

李娟，石海平，李維民

（1 遂寧市中心醫院藥學部，遂寧 629000；2 遂寧市中心醫院神經中心一病區，遂寧 629000）

膠質母細胞瘤（GBM）是中樞神經系統最常見惡性腫瘤，是膠質瘤中侵襲性最強的類型，預后較差，治療方案較少[1]。上皮間質轉化（EMT）使細胞獲得高遷移和侵襲能力，是腫瘤惡性進展的關鍵步驟，由此參與GBM 的發生發展，還會導致GBM 耐藥性的產生[2]。目前，GBM 的主要治療方法包括手術、化療、放療和聯合治療，然而由于其強侵襲性和耐藥性，相當大比例的GBM 腫瘤會復發，總生存率仍然很低。因此，發現新的治療藥物和探索新的干預靶點可能對接受GBM 治療的患者具有重要意義。桃葉珊瑚苷（AU）是一種環烯醚萜化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗纖維化、抗癌、神經保護等多種生物活性，其結構式見圖1[3]。已有研究發現，AU 發揮對乳腺癌[4]、肝細胞癌[5]等多種腫瘤細胞的抑制作用。Ras 同源基因家族成員A（RhoA）是Rho 家族中研究最多的三磷酸鳥苷（GTP）酶成員之一，以激活GTP 的形式激活下游效應分子，影響細胞骨架。Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）是RhoA 活性的主要介導者，ROCK 的激活可通過調節肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化，導致肌動蛋白骨架重排并伴隨細胞遷移，最終導致EMT 的發生[6]。RhoA/ROCK 信號通路與多種腫瘤發生發展有關，其中抑制GBM 中RhoA/ROCK 信號傳導可抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲以及肌動蛋白重排[7]。但AU 對GBM 細胞活力和EMT 的影響，以及其對RhoA/ROCK 信號通路的調控作用尚不清楚，本研究對此進行探討。

圖1 AU 結構式Fig.1 AU structural formula

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、動物來源 人GBM 細胞系：T98、U251、LN299、U87 購自美國菌種保藏中心細胞庫。24 只雌性裸鼠BALB/c 小鼠，4 周齡，體質量為15～18 g，購自武漢貝賽模式生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（鄂）2022-0029。

1.1.2 主要試劑與儀器 AU（純度>95%，成都曼思特生物科技有限公司）；Y-27632（美國MedChemExpress公司）；Dulbecco 改良的Eagle’s 培養基（DEME）高糖培養基（北京伊塔生物科技有限公司）；細胞計數器試劑盒（CCK-8）試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）；膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒、二抗（武漢伊萊瑞特生物科技公司）；Transwell 小室（康寧生命科學有限公司）；Matrigel 膠（北京索萊寶科技有限公司）；一抗基質金屬蛋白酶（MMP）2、MMP9、波形蛋白（Vimentin）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經鈣黏蛋白（N-cadherin）、RhoA、ROCK1、ROCK2 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Abcam 公司）。酶標儀（瑞士Tecan 公司）；流式細胞儀（德國Miltenyi Biotec 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）；電泳儀（美國Bio-rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將T98、U251、LN299、U87 細胞置于含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-鏈霉素的DEME高糖培養基中，在37 ℃和5% CO2的培養箱中培養48 h，待細胞融合至70%以上時，胰蛋白酶消化。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞活力 將T98、U251、LN299、U87 細胞以4×103個/孔接種到96 孔板中，培養24 h后用0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L 濃度的AU 處理，每孔加入10 μL CCK-8 溶液37 ℃孵育1 h，用酶標儀在450 nm 波長處測量吸光度，計算細胞活力。

1.2.3 細胞分組 將U87 細胞隨機分為對照組、AU低濃度組、AU 中濃度組、AU 高濃度組、Y-27632（ROCK 抑制劑）組、AU 高濃度+Y-27632 組。其中AU低、中、高濃度組參照1.2.2 中的結果，選用10、25、50 μmol/L 濃度的AU 處理；Y-27632 組用5 mmol/L濃度的Y-27632 處理[8]；AU 高濃度+Y-27632 組用50 μmol/L 濃度的AU 和5 mmol/L 濃度的Y-27632共同處理。

1.2.4 各組細胞活力測定 將各組U87 細胞加入96 孔板中，每孔加入10 μL CCK-8 溶液37 ℃孵育1 h，于450 nm 波長處測量吸光度，計算細胞活力。

1.2.5 各組細胞凋亡情況 將各組U87 細胞重懸于100 μL 結合緩沖液中，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入5 μL Annexin VFITC 和5 μL PI，混勻，室溫染色15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 各組細胞遷移和侵襲 將各組U87 細胞1×105個/mL（100 μL）用含0.5% FBS 的DMEM 培養基接種于24 孔板中鋪有Matrigel 膠的Transwell 上室，下室加入含10% FBS 的DMEM 培養基，培養24 h后，用棉簽擦去上室的細胞。將貼壁細胞用2%多聚甲醛固定，然后用0.1%結晶紫溶液染色，遷移實驗與上述步驟相似，Transwell 小室未涂Matrigel 膠。每個小室隨機選取5 個視野，在顯微鏡下計數遷移、侵襲細胞數量并拍照。

1.2.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達 將各組U87 細胞在RIPA 緩沖液中裂解、離心，定量蛋白濃度，分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%無脂奶粉封閉，加入一抗MMP2、MMP9、Ncadherin、Vimentin、E-cadherin、RhoA、ROCK1、ROCK2和GAPDH（1∶1 000）進行檢測。用辣根過氧化物酶標記的二抗檢測結合的抗體，并使用增強的化學發光試劑盒進行可視化，采用Image J 軟件分析數據。

1.2.8 裸鼠移植瘤實驗 將BALB/c小鼠于恒溫23℃、濕度60%、12 h 光暗循環環境下適應性飼養1 周，自由進食和飲水。將5×106個U87 細胞注射于小鼠背部皮下，隨機分為裸鼠對照組、AU 組、Y-27632 組、AU+Y-27632 組，每組6 只。注射后第7 天，AU 組小鼠腹腔注射AU 10 mg/kg[5]，Y-27632 組小鼠腹腔注射Y-27632 10 mg/kg[9]，AU+Y-27632 組腹腔注射AU 10 mg/kg 和Y-27632 10 mg/kg，每日1 次，連續2 周。處死小鼠切除腫瘤組織，測量腫瘤質量與體積，免疫組化法檢測移植瘤組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達。

1.3 統計學方法 數據使用GraphPad 8.0 進行統計分析，所有數據均以均數±標準差（±s）表示。多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AU 對GBM 細胞活力的影響 CCK-8 結果顯示，與0 μmol/L 比較，T98、U251、LN299、U87 細胞活力隨著AU 濃度的升高而逐漸降低（P<0.05），見表1。半抑制濃度（IC50）分別為76.47、81.37、78.25、70.09 μmol/L。因此，選擇U87 作為后續實驗細胞，選擇濃度10、25、50 μmol/L 作為AU 后續實驗濃度。見表1。

表1 不同濃度AU 對GBM 細胞活力的影響（±s）Tab.1 The effect of different concentrations of AU on the viability of GBM cells（±s） %

表1 不同濃度AU 對GBM 細胞活力的影響（±s）Tab.1 The effect of different concentrations of AU on the viability of GBM cells（±s） %

注：與AU 0 μmol/L 比較，*P<0.05。

?AU（μmol/L） n T98 U251 LN299 U87 0.0 6 99.35±0.62 99.08±0.85 99.17±0.77 99.42±0.41 2.5 6 90.24±4.18* 94.21±1.86* 92.05±1.74* 88.15±1.29*5.0 6 86.35±4.27* 89.63±2.25* 86.95±2.56* 80.62±1.84*10.0 6 70.40±4.16* 76.38±1.92* 73.14±2.59* 68.29±2.05*25.0 6 65.84±3.68* 68.47±1.39* 66.84±1.93* 60.17±1.82*50.0 6 54.37±4.75* 57.26±1.58* 55.38±1.57* 51.09±1.73*100.0 6 37.94±3.42* 41.73±1.26* 38.42±1.71* 33.52±1.07*

2.2 AU 對U87 細胞活力、凋亡率的影響 與對照組比較，AU 低、中、高濃度組和Y-27632 組U87 細胞活力顯著下降，凋亡率顯著升高（P<0.05），其中高濃度AU 和Y-27632 組共同處理的U87 細胞活力和凋亡率變化更顯著（P<0.05）。見圖2 和表2。

表2 AU 對U87 細胞活力和凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of AU on the viability and apoptosis rate of U87 cel（l±s）

表2 AU 對U87 細胞活力和凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of AU on the viability and apoptosis rate of U87 cel（l±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與AU 高濃度組比較，#P<0.05；與Y-27632 組比較，△P<0.05。

組別 n 細胞活力（%） 凋亡率（%）對照組 6 99.25±0.73 5.09±0.76 AU 低濃度組 6 71.26±2.25* 17.36±1.48*AU 中濃度組 6 60.38±1.59* 25.91±2.74*AU 高濃度組 6 51.07±1.64* 38.67±4.13*Y-27632 組 6 50.37±2.93* 39.26±4.21*AU 高濃度+Y-27632 組 6 37.46±3.29*#△ 49.21±5.34*#△

2.3 AU 對U87 細胞遷移侵襲的影響 與對照組比較，AU 低、中、高濃度組和Y-27632 組遷移和侵襲細胞數顯著下降（P<0.05），其中高濃度AU 和Y-27632 組共同處理的細胞遷移和侵襲細胞數下降更顯著（P<0.05）。見圖3 和表3。

表3 AU 對U87 細胞遷移、侵襲的影響（±s）Tab.3 Effect of AU on migration and invasion of U87 cel（l±s） 個

表3 AU 對U87 細胞遷移、侵襲的影響（±s）Tab.3 Effect of AU on migration and invasion of U87 cel（l±s） 個

注：與對照組比較，*P<0.05；與AU 高濃度組比較，#P<0.05；與Y-27632 組比較，△P<0.05。

組別 n 遷移細胞數 侵襲細胞數對照組 6 218.53±17.51 168.41±15.26 AU 低濃度組 6 175.36±16.29* 125.37±14.86*AU 中濃度組 6 146.68±14.93* 107.47±10.24*AU 高濃度組 6 105.91±10.09* 89.57± 9.06*Y-27632 組 6 103.35±10.27* 90.14± 9.35*AU 高濃度+Y-27632 組 6 81.27± 8.35*#△ 72.86± 7.54*#△

圖3 AU 對U87 細胞遷移、侵襲的影響（×200）Fig.3 Effect of AU on migration and invasion of U87 cell (×200)

2.4 AU 對U87 細胞遷移侵襲和EMT 相關蛋白的影響 與對照組比較，AU 低、中、高濃度組和Y-27632 組MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin 表達顯著下降，E-cadherin 表達顯著上升（P<0.05），其中高濃度AU 和Y-27632 組共同處理的U87 細胞蛋白表達變化更顯著（P<0.05）。見圖4 和表4。

表4 AU 對U87 細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of AU on expression of MMP2，MMP9，Vimentin，E-cadherin，N-cadherin in U87 cell（±s）

表4 AU 對U87 細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of AU on expression of MMP2，MMP9，Vimentin，E-cadherin，N-cadherin in U87 cell（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與AU 高濃度組比較，#P<0.05；與Y-27632 組比較，△P<0.05。

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圖4 AU 對U87 細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、Ecadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響Fig.4 Effect of AU on expression of MMP2，MMP9，Vimentin，E-cadherin，N-cadherin in U87 cell

2.5 AU 對U87 細胞RhoA/ROCK 信號通路的影響 與對照組比較，AU 低、中、高濃度組和Y-27632組RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達顯著下降（P<0.05），其中高濃度AU 和Y-27632 組共同處理的U87 細胞RhoA/ROCK 信號通路蛋白下降更顯著（P<0.05）。見圖5 和表5。

表5 AU 對U87 細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of AU on expression of RhoA，ROCK1，ROCK2 in U87 cell（±s）

表5 AU 對U87 細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of AU on expression of RhoA，ROCK1，ROCK2 in U87 cell（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與AU 高濃度組比較，#P<0.05；與Y-27632 組比較，△P<0.05。

組別 n RhoA ROCK1 ROCK2對照組 6 1.13±0.13 1.04±0.11 0.95±0.10 AU 低濃度組 6 0.87±0.09* 0.81±0.09* 0.69±0.07*AU 中濃度組 6 0.64±0.07* 0.68±0.07* 0.55±0.06*AU 高濃度組 6 0.48±0.05* 0.50±0.05* 0.42±0.04*Y-27632 組 6 0.49±0.05* 0.53±0.06* 0.41±0.05*AU 高濃度+Y-27632 組 6 0.36±0.04*#△0.42±0.04*#△0.30±0.03*#△

圖5 AU 對U87 細胞中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達的影響Fig.5 Effect of AU on expression of RhoA，ROCK1，ROCK2 in U87 cell

2.6 AU 對裸鼠移植瘤生長及RhoA/ROCK 信號通路蛋白表達的影響 與裸鼠對照組比較，AU 組和Y-27632 組移植瘤質量、體積和RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達顯著降低（P<0.05），其中AU+Y-27632 組降低更顯著（P<0.05）。見圖6、圖7 和表6。

表6 AU 對裸鼠移植瘤生長及RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達的影響（±s）Tab.6 Effect of AU on the growth of transplanted tumors in nude mice and the expression of RhoA，ROCK1 and ROCK2（±s）

表6 AU 對裸鼠移植瘤生長及RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達的影響（±s）Tab.6 Effect of AU on the growth of transplanted tumors in nude mice and the expression of RhoA，ROCK1 and ROCK2（±s）

注：與裸鼠對照組比較，*P<0.05；與AU 組比較，#P<0.05；與Y-27632 組比較，△P<0.05。

組別 動物數 瘤體積（mm3） 移植瘤質量（g） RhoA ROCK1 ROCK2裸鼠對照組 6 2 035±189 2.62±0.32 35.17±4.29 42.75±4.31 30.26±3.18 AU 組 6 1 247±146* 1.58±0.29* 24.08±2.31* 26.06±2.47* 21.28±2.46*Y-27632 組 6 1 136±136* 1.47±0.27* 23.96±2.41* 25.83±2.56* 21.53±2.47*AU+Y-27632 組 6 579± 84*#△ 0.69±0.18*#△ 17.85±1.48*#△ 18.15±2.06*#△ 13.49±1.51*#△

圖6 AU 對裸鼠移植瘤生長情況的影響Fig.6 Effect of AU on the growth of transplanted tumor in nude mice

圖7 AU 對裸鼠腫瘤組織RhoA、ROCK1、ROCK2 表達的影響（×200）Fig.7 Effect of AU on RhoA，ROCK1 and ROCK2 expression in tumor tissue of nude mice(×200)

3 討論

GBM 是成人最常見的原發性腦腫瘤之一，約占中樞神經系統原發性腫瘤的50%～70%，由治療后易復發導致預后不良[10]。因此，深入了解GBM 的惡性行為及其分子機制是尋求膠質瘤有效治療的關鍵研究。

AU 作為從杜仲、車前草、地黃等植物中提取出的化合物，廣泛分布于多個器官，表現出抗腫瘤細胞增殖、侵襲和減少化學毒性的作用[11]。據報道，AU能夠抑制肺癌細胞增殖、侵襲[12]。AU 還能抑制乳腺癌腫瘤生長，緩解乳腺癌引起的腸道紊亂[4]，并通過抑制肝細胞癌中程序性死亡配體1 表達來增強順鉑的抗腫瘤活性[5]。因此，猜測AU 是作為治療GBM的潛在藥物。本研究發現，AU 處理后GBM 細胞活力、遷移、侵襲能力顯著下降，凋亡率上升，移植瘤質量、體積下降。提示AU 能夠抑制GBM 細胞增殖、遷移和侵襲，對GBM 有治療作用。增殖和轉移是腫瘤發展和進展的重要因素，EMT 是加速癌癥轉移的重要原因[13]。腫瘤細胞的EMT 樣過程包括E-cadherin等細胞黏附蛋白的減少，N-cadherin、Vimentin 等間質標志物的升高，導致細胞間黏附減少和極性喪失，促進腫瘤的侵襲和遷移[14-15]。因此，抑制GBM 細胞的EMT 過程與靶向膠質瘤的治療相結合可能是其成功治療的關鍵。

多項研究表明，間充質轉化、細胞運動和細胞外基質重塑會促進GBM 的侵襲和轉移，與GBM 的預后不良密切相關[16]。MMPs 能通過降解細胞外基質促進腫瘤轉移，MMPs 對多種惡性腫瘤的侵襲和轉移至關重要，MMP2、MMP9 已被證明可以促進GBM 的增殖和轉移[17-18]。因此，為了改善GBM 患者的預后，有效抑制GBM 的侵襲和轉移至關重要。本研究發現，AU 能夠抑制MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達，促進E-cadherin 表達，提示AU可能通過抑制GBM 細胞的遷移、侵襲和EMT，抑制GBM 進展。

細胞遷移伴隨著微絲細胞骨架的重塑，Rho GTPase 家族在調節與細胞遷移相關的細胞骨架重構方面起著至關重要的作用[19]。RhoA 激活ROCK（包括ROCK1、ROCK2），提高肌球蛋白輕鏈磷酸化，增加肌球蛋白活化，進而促進動作電位聚合和細胞運動，參與細胞骨架蛋白、細胞形態、遷移以及細胞中各種增殖和轉錄活性的調節[20-21]。RhoA/ROCK 信號通路參與調節癌癥的增殖和遷移，激活RhoA/ROCK1信號通路，能夠促進直腸癌細胞遷移[22]；激活RhoA/ROCK 途徑，能夠促進非小細胞肺癌的增殖和遷移能力[23]。此外，RhoA/ROCK 信號通路參與GBM 的發生發展，研究表明，GBM 細胞通過激活RhoA/ROCK途徑侵入周圍組織，能夠促進癌細胞轉移[24]。以上研究表明，RhoA/ROCK 信號通路的激活可能是腫瘤發病的關鍵機制。因此，抑制GBM 中RhoA/ROCK1 信號通路的激活可能是治療GBM 的關鍵機制。本研究結果顯示，Y-27632 組RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達下降，提示RhoA/ROCK 信號通路參與GBM細胞增殖、遷移、侵襲、EMT 及腫瘤生長。而不同濃度AU 處理后GBM 細胞及腫瘤組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達下降，猜測AU 可能通過抑制RhoA/ROCK 信號通路，抑制GBM 的發生發展。為進一步證明此結論，本研究在AU 的基礎上與ROCK 抑制劑Y-27632 聯合處理GBM 細胞及裸鼠移植瘤，發現兩者聯合處理GBM 細胞的增殖、遷移和侵襲進一步下降，凋亡進一步升高，對腫瘤的抑制更顯著。因此，AU 可能通過抑制RhoA/ROCK 信號通路抑制GBM 細胞的增殖、遷移、侵襲、EMT 及移植瘤生長。

綜上所述，AU 能抑制GBM 細胞活力、遷移侵襲和EMT，促進細胞凋亡，其作用機制可能與抑制RhoA/ROCK 信號通路有關。本研究為治療GBM 提供了新的方法和思路，但AU 對除本研究中的GBM細胞的影響及藥物與通路之間的具體關系還需進一步研究。