枸杞籽油對中波紫外線誘導人永生化角質形成細胞光損傷的防護作用

王學紅,尹星星,陸杰,張靖鵬,2,楊永晶*

1(青海大學 生態環境工程學院,青海 西寧,810016)

2(青海康普生物科技股份有限公司,青海 西寧,810003)

紫外線輻射是引起皮膚外源性老化的重要因素之一,中波紫外線(ultraviolet B,UVB)的穿透力較淺,對表皮細胞的毒性更強、損傷程度更大[1]。過度暴露于UVB會引起皮膚粗糙、色素沉著和炎癥反應,甚至導致皮膚惡性腫瘤的發生[2]。皮膚長期遭受UVB輻射會造成細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累。一方面,ROS的過量積累可上調皮膚細胞內促凋亡因子Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表達,下調抗凋亡因子B淋巴細胞瘤/白血病-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達,并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cystein-asparate protease-9,Caspase-9)和p53,進而誘導細胞凋亡,加速皮膚衰老[3-4]。另一方面,ROS的過量積累促使核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活,導致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性細胞因子的分泌,誘發皮膚炎癥反應進而引起皮膚光損傷[5]。可見,細胞凋亡與炎癥反應是UVB誘導皮膚光損傷的重要因素。

皮膚長期暴露于紫外線照射產生過多ROS,引起細胞凋亡與炎癥反應,加快皮膚衰老的速度。人們可通過減少與紫外線的接觸或涂抹防曬劑來防止皮膚光損傷的發生[6]。防曬劑分為傳統的物理防曬劑、化學防曬劑和新型天然植物防曬劑。物理防曬劑一般停留在皮膚表面,沉積形成白色層,會影響皮脂腺及汗腺分泌而給皮膚造成負擔,化學防曬劑易破壞皮膚屏障、引起皮膚過敏等,且使用時要充分考慮與皮膚的結合度[7]。天然植物活性成分對皮膚作用溫和、安全性高且藥效持久穩定,已成為抗光損傷物質開發領域的研究熱點[8]。研究表明,植物油脂具有抗炎、抗氧化等多種活性,加之其綠色環保、使用安全和易被皮膚吸收等優勢,可作為天然防曬劑的理想原料進一步開發和利用。例如,山茶油、牡丹籽油、橄欖油等植物油脂已被作為防曬劑原料應用于化妝品中[9-10]。

枸杞(LyciumbarbarumL.)為茄科、枸杞屬植物,卵狀菱形,有“紅寶”之稱,作為我國傳統的藥食同源植物,主要分布在我國寧夏、青海等西北地區[11-12]。隨著枸杞汁、枸杞酒等產品產量的增長,大量枸杞廢渣(含有大量枸杞籽)帶來的環境污染和資源浪費問題日益突出。枸杞籽油是從枸杞籽中提取獲得的一種功能性油脂,含有不飽和脂肪酸、維生素E、類胡蘿卜素和磷脂等天然活性成分,具有抗氧化、延緩衰老、緩解抑郁和增強免疫功能的藥理作用[13-16]。研究和開發枸杞籽油不僅能解決廢渣污染問題,而且具有較大的經濟效益和社會效益。LI等[13]證明枸杞籽油具有自由基清除能力,因此,它具有一定抗皮膚光損傷的潛力。然而,關于枸杞籽油對人角質形成細胞的抗光損傷作用研究尚未見報道。

因此,本研究在測定枸杞籽油中主要活性成分含量的基礎上,以UVB誘導的人永生化角質形成細胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)為光損傷模型,通過檢測細胞存活率、ROS含量、細胞凋亡率、細胞凋亡相關因子和炎癥因子來探討枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞的防護作用,以期為天然抗光損傷物質的開發提供科學依據,為枸杞籽油的有效利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

HaCaT細胞,武漢普諾賽生命科技有限公司;枸杞籽油,青海康普生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

HaCaT專用培養基[含體積分數為15%的胎牛血清(fetal calf serum,FBS)]、胰蛋白酶、磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、MEM培養基、青霉素-鏈霉素混合液,武漢普諾賽生命科技有限公司;增強型細胞活力檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、ROS熒光法試劑盒、一步法TUNEL流式凋亡檢測試劑盒、TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯免疫吸附測定(enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑、SuperReal彩色熒光定量預混試劑,天根生化科技(北京)有限公司;Tween-80,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HF100細胞培養箱,上海力申科學儀器有限公司;Happy-TL21臺式高速冷凍離心機,長沙東旺實驗儀器有限公司;Ti2熒光倒置顯微鏡,伯泰科技有限公司;L125紫外輻射儀,深圳市林上科技有限公司;1510酶標儀,賽默飛世爾科技(中國)科技有限公司;KH-600E超聲波清洗儀,昆山禾創儀器有限公司;B90883流式細胞儀,貝克曼庫爾特生物科技(蘇州)有限公司;SYNERGY LX多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞籽油主要活性成分的測定

分別按照GB 5009.168—2016、GB 5009.83—2016、DB64/T 1514—2017、《保健食品中功效成分檢測方法》和GB 5009.82—2016(第一法)提供的方法測定枸杞籽油中脂肪酸、β-胡蘿卜素、玉米黃質、葉黃素、谷甾醇以及維生素E的含量。

1.3.2 HaCaT細胞培養

HaCaT細胞采用含15% FBS的HaCaT細胞專用培養基于37 ℃、5%(體積分數)CO2的三氣培養箱中培養,待細胞融合度至80%進行傳代,取對數生長期的細胞進行后續實驗[17]。

1.3.3 HaCaT細胞UVB光損傷模型的構建

參考KUNCHANA等[18]的方法并略有改動。HaCaT細胞以1.5×104個/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養24 h,將原有的HaCaT細胞專用培養基更換為無血清MEM培養基繼續培養4 h后棄去,用少量PBS覆蓋HaCaT細胞,進行UVB照射,照射劑量分別為0、20、40、60、80、100 mJ/cm2,每個劑量設置6個復孔。照射結束后將PBS更換為無血清MEM培養基繼續培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8,于37 ℃,5% CO2孵育1 h,450 nm處測定HaCaT細胞存活率,將細胞存活率為正常細胞存活率50%的UVB劑量作為后續實驗照射劑量[17]。

1.3.4 HaCaT細胞存活率的測定

1.3.4.1 枸杞籽油對HaCaT細胞存活率的影響

HaCaT細胞以1.5×104個/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。將原有的HaCaT細胞專用培養基更換為含有質量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL枸杞籽油的無血清MEM培養基(0.01% Tween-80助溶)和0.01%Tween-80(溶于無血清MEM培養基)于37 ℃、5% CO2培養4 h,將上清更換為無血清MEM培養基繼續培養24 h,每個濃度設置6個重復。采用CCK-8法檢測HaCaT細胞存活率,方法同1.3.3節。

1.3.4.2 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞存活率的影響

HaCaT細胞以1.5×104個/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養24 h。對照組:HaCaT細胞既不進行UVB照射,也不加入枸杞籽油;模型組:HaCaT細胞只進行UVB照射,不加入枸杞籽油;枸杞籽油組:HaCaT用含有不同質量濃度枸杞籽油(75、150、300、600 μg/mL,0.01% Tween-80助溶)的無血清MEM培養基于37 ℃、5% CO2孵育4 h。模型組和枸杞籽油組HaCaT細胞棄去上清液后加入少量PBS,以40 mJ/cm2的UVB劑量進行照射。照射結束后,將各組HaCaT細胞培養液更換為無血清MEM培養基,繼續于37 ℃、5% CO2培養24 h,每組分別設置6個復孔[17]。CCK-8法檢測HaCaT細胞存活率,方法同1.3.3節。

1.3.5 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中ROS水平的影響

HaCaT細胞培養、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節,用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofuorescin diacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測細胞內的ROS水平[19]。用緩沖液按1∶750(體積比)稀釋DCFH-DA,棄去無血清MEM培養基,用緩沖液(試劑三)洗滌3次,加入適當體積的DCFH-DA(試劑一),于37 ℃避光孵育40 min,采用熒光酶標儀于500 nm/525 nm處測定熒光強度。

1.3.6 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞凋亡率的影響

HaCaT細胞以5×105個/孔接種于6孔板,于37 ℃、5% CO2培養24 h,不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節。棄去無血清MEM培養基,收集HaCaT細胞,按照一步法TUNEL流式凋亡檢測試劑盒說明書操作,采用流式細胞儀檢測HaCaT細胞凋亡情況[20]。

1.3.7 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞炎癥因子含量的影響

HaCaT細胞培養、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節,按ELISA檢測試劑盒操作說明書分別測定對照組、模型組和枸杞籽油組HaCaT細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,于450 nm處測定吸光值。

1.3.8 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞凋亡和炎癥相關因子mRNA相對表達的影響

HaCaT細胞培養同1.3.6節,不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節。棄去無血清MEM培養基,每孔加入適量PBS沖洗2～3次,棄去PBS后加入1 mL裂解液RZ裂解細胞,抽打若干次至溶液透明。按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA,依據cDNA逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。RT-PCR反應檢測HaCaT細胞凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、p53和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達。RT-PCR反應體系為正向和反向引物各0.6 μL,ddH2O 6.3 μL,cDNA 2.5 μL,2×SuperReal Color Premix(SYBR Green)10 μL進行反應,反應條件:95 ℃ 15 min(預變性),95 ℃ 10 s(變性),60 ℃ 20 s(退火/延伸),40個循環。在擴增程序中讀取Ct值,按照2-ΔΔCt分析法,計算各組mRNA的相對表達[21]。計算如公式(1)所示:

ΔΔCt=處理組(Ct目的基因-Ct內參基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內參基因)

(1)

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 枸杞籽油主要活性成分含量

枸杞籽油中含有大量不飽和脂肪酸,其中亞油酸和油酸含量最高,分別達到67.4%和19.2%;此外,谷甾醇和維生素E分別含有42%和27.4 mg/100 g;還含有少量的β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導的皮膚光損傷提供良好的物質基礎,結果見表2。

表2 枸杞籽油活性成分含量

2.2 不同UVB照射劑量對HaCaT細胞存活率的影響

如圖1所示,與對照組(0 mJ/cm2)相比,不同UVB照射后HaCaT細胞存活率極顯著降低(P<0.01),且UVB照射劑量越強,細胞存活率越低。經40 mJ/cm2UVB照射后,細胞存活率為對照組的50%左右,因此,本實驗采用UVB照射強度為40 mJ/cm2作為后續實驗照射劑量。

圖1 不同UVB照射劑量對HaCaT細胞存活率的影響

2.3 枸杞籽油對HaCaT細胞存活率的影響

2.3.1 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對HaCaT細胞存活率的影響

由圖2可知,相比于對照組,質量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL的枸杞籽油(0.01% Tween-80助溶)和0.01% Tween-80對HaCaT細胞存活率均無明顯影響。選擇0.01% Tween-80助溶的75、150、300、600 μg/mL的枸杞籽油進行后續實驗。

圖2 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對HaCaT細胞存活率的影響

2.3.2 不同濃度枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞存活率的影響

如圖3所示,與對照組相比,經UVB(40 mJ/cm2)照射后,模型組HaCaT細胞存活率極顯著下降(P<0.01),為正常細胞的50%左右。與模型組相比,75 μg/mL枸杞籽油處理后的細胞存活率顯著升高(P<0.05),150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細胞存活率極顯著升高(P<0.01),且細胞存活率隨著枸杞籽油濃度的增加而升高。可見,枸杞籽油可明顯提高UVB誘導的光損傷HaCaT細胞存活率。

圖3 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞存活率的影響

2.4 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞內ROS水平的影響

圖4顯示,與對照組相比,模型組HaCaT細胞內ROS水平極顯著升高(P<0.01)。而相比模型組,經75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細胞內ROS水平顯著降低(P<0.05)。說明枸杞籽油可明顯降低UVB誘導的光損傷HaCaT細胞內的ROS水平。

圖4 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞內ROS水平的影響

2.5 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞凋亡率的影響

由圖5可知,模型組HaCaT細胞凋亡率與對照組相比極顯著升高(P<0.01),而與模型組相比,經75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。說明40 mJ/cm2UVB照射能增加HaCaT細胞凋亡率,而枸杞籽油可有效抑制UVB誘導的細胞凋亡。

a-對照組;b-模型組;c-75 μg/mL;d-150 μg/mL;e-300 μg/mL;f-600 μg/mL;g-枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞凋亡率的影響

2.6 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中凋亡相關因子mRNA相對表達的影響

與對照組相比,模型組細胞中Bcl-2 mRNA相對表達水平極顯著降低(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,經枸杞籽油處理的各組細胞中Bcl-2 mRNA相對表達水平極顯著升高(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA相對表達極顯著降低(P<0.01)(圖6)。該結果表明,枸杞籽油可通過增加UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達,減少促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達抑制UVB照射引起的細胞凋亡。

a-Bcl-2;b-Bax;c-Caspase-3;d-Caspase-9;e-p53

2.7 枸杞籽油對UVB誘導的光損傷HaCaT細胞炎癥因子的影響

圖7-a～圖7-c顯示,與對照組相比,經UVB照射后,HaCaT細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著升高(P<0.01);而與模型組相比,75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著下降(P<0.01)。圖7-d～圖7-f結果表明,與對照組相比,模型組HaCaT細胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,枸杞籽油則極顯著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相對表達(P<0.01)。說明枸杞籽油能降低HaCaT細胞中炎癥因子的含量和mRNA相對表達減輕UVB引起的炎癥反應。

a-TNF-α含量;b-IL-1β含量;c-IL-6含量;d-TNF-α mRNA相對表達;e-IL-1β mRNA相對表達;f-IL-6 mRNA相對表達

3 結論與討論

枸杞籽油具有不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素E和植物甾醇等活性成分[22-23],這些活性成分可通過不同途徑緩解皮膚損傷。研究表明,油酸和亞油酸都具有良好的抗衰老作用,油酸與人體脂肪酸結構相似,可改變皮膚角質層脂質結構,增加脂質流動性,促進有效物質的滲透;亞油酸則在阻止脂質過氧化損傷方面起關鍵作用[24]。葉黃素可通過降低IL-6、TNF-α和環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)這些促炎介質發揮對紫外線輻射的HaCaT細胞的防護作用[25]。植物甾醇也能緩解皮膚炎癥反應并保護其免受紫外線傷害[26]。維生素E可顯著減少紫外線輻射導致的紅斑、水腫和皮膚過敏,并抑制紫外線輻射引起的皮膚癌的發生[27]。本研究中,枸杞籽油中的油酸和亞油酸含量最高,分別為19.2%和67.4%,葉黃素、谷甾醇、維生素E含量分別為58.5 μg/100 g、42%、27.4 mg/100 g。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導的HaCaT細胞光損傷提供一定物質基礎。

UVB輻射后使細胞產生過量ROS,進而誘導凋亡相關蛋白的表達,加速細胞凋亡[28]。Bcl-2基因家族在細胞凋亡調控中起關鍵作用。其中,Bcl-2與Bax功能相互拮抗,Bcl-2抑制細胞凋亡,Bax加速細胞凋亡[29]。此外,過量的ROS會激活位于線粒體膜上的Bcl-2家族,使線粒體內細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,Cyto-C)釋放到細胞質內并激活Caspase蛋白家族,啟動Caspase級聯反應,進而影響特定凋亡信號分子誘導細胞凋亡發生[30]。Caspase家族中Caspase-9作為凋亡始動子起到關鍵作用,它在Cyto-C的參與下可激活Caspase-3,活化的Caspase-3可酶解凋亡抑制蛋白,最終導致細胞凋亡[31]。p53在細胞凋亡過程中主要通過對線粒體膜上Bcl-2家族蛋白的轉錄調控,改變線粒體膜電位,最終激活Caspase-3并啟動細胞凋亡級聯反應[32]。本研究結果顯示,枸杞籽油可通過顯著降低UVB誘導的HaCaT細胞凋亡率及相關因子Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達,促進抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達來抑制UVB誘導的HaCaT細胞凋亡的發生,進而發揮抗UVB光損傷作用。MUZAFFER等[33]研究發現胡桃可下調UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達,上調Bcl-2 mRNA的表達,該研究結果與本研究一致。

角質細胞占據人皮膚表皮細胞的90%,具有分泌細胞因子的功能[34]。UVB作用于HaCaT細胞,導致多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產生[35]。機體發生炎癥反應時,TNF-α是出現最早的起關鍵作用的炎癥因子,它能促進其他炎癥細胞因子的合成和釋放;IL-1β是具有免疫調節和執行宿主防御功能的炎癥因子;IL-6具有與IL-1β相似的生物學效應[36]。本研究證實了枸杞籽油可顯著降低UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達和蛋白含量。蘇牧楠等[37]研究發現納豆提取物可明顯降低UVB照射后HaCaT細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量,張艷晴[38]發現鐵皮石斛超濾組分可抑制UVB誘導的光損傷HaCaT細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達。本研究結果與上述文獻報道相似。

綜上所述,枸杞籽油可通過調控細胞凋亡和減輕炎癥反應緩解UVB誘導的HaCaT細胞光損傷。主要通過提高HaCaT細胞存活率,抑制ROS過量生成,降低HaCaT細胞凋亡率,促進抗凋亡因子Bcl-2、降低促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達,減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量和mRNA的表達,而枸杞籽油所含的不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、谷甾醇和維生素E為其抗UVB所致的光損傷提供了物質基礎。這為枸杞籽油的進一步開發利用提供新的思路,為天然植物油脂抗光損傷提供了一定的科學理論依據。