霉魚源清酒乳桿菌的分離篩選及其在霉魚發酵中的應用

曾金秀,尹紅梅,張權,尹紫冉,寧舒嫻,張露,3,溫慶輝,涂宗財

1(江西師范大學 健康學院,江西 南昌,330022)

2(江西師范大學 生命科學學院,江西 南昌,330022)

3(江西師范大學,國家淡水魚加工技術研發專業中心,江西 南昌,330022)

4(南昌大學,食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌,330047)

參考文獻

霉魚起源于江西,在永豐、吉安縣等地區流行,形成了吉水霉魚、樂安霉魚、峽江霉魚等品種[1]。其歷史悠久,口味獨特,香、辣、咸、鮮,是極具代表的地方特色下酒菜。傳統自然發酵的霉魚色澤紅亮,香辣咸鮮,口感緊實,回味悠長,具獨特風味[2]。然而,傳統自然發酵霉魚的生產過程多依賴人工經驗,導致產品質量參差不齊,口感與風味不穩定,食用安全性存在潛在風險,因而亟需對該工藝過程進行標準化關鍵技術調控,改善其產品品質與風味[3]。

微生物接種發酵是提高發酵魚制品品質的一種有效手段[4-5]。傳統自然發酵制品是微生物發酵菌種如乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等的主要來源[6-7]。目前已有對于酸魚、臭鱖魚等發酵魚制品的風味研究的報道,但對其他發酵魚制品的研究還不夠充分。霉魚作為江西吉安地區傳統特色的發酵魚制品[8],對其發酵過程中微生物菌群組成和風味的研究鮮有報道,對其乳酸菌資源的研究和應用亦尚未見報道。因此,本研究以傳統的自然發酵霉魚作為分離基質,從中分離并鑒定了清酒乳桿菌,并對其生物學特性進行研究,同時,結合吉安霉魚制作工藝,采用清酒乳桿菌接種發酵霉魚,研究菌株對霉魚發酵過程中質構、色澤和揮發性風味物質的影響,以期為霉魚發酵基礎研究和工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

霉魚,江西省吉安市永豐縣菜市場。

鳙魚(Aristichthysnobilis),南昌市南昌縣菜市場,規格為2.5～3.0 kg/尾。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基(1 L)、營養瓊脂培養基(1 L),Solarbio公司。

MRS-溴甲酚紫鑒別培養基(1 L):溴甲酚紫0.1 g、MRS瓊脂培養基(1 L),Solarbio公司。

水瓊脂培養基(1 L):瓊脂粉15 g。

以上培養基均用蒸餾水配制和定容,在備用前需要30 min的115 ℃高壓滅菌處理。

1.1.3 試劑

食用鹽、辣椒面等調料,南昌市天虹超市;氯化鈉、無水乙醇,西隴科學股份有限公司;DNA提取試劑盒,TIANGEN公司。

1.2 儀器與設備

恒溫振蕩培養箱,上海智城分析儀器制造有限公司;PCR儀,Bio-Rad公司;電泳儀,北京六一生物科技有限公司;高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;TA-TXplus質構分析儀,英國Stable Micro System公司;CR-10色差儀,日本柯尼卡公司;電子鼻,德國Airsense公司;DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司;7890A/5975氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 清酒乳桿菌的分離鑒定

參照文獻[9]方法從霉魚中分離鑒定清酒乳桿菌。

1.3.2 清酒乳桿菌的生物學特性

1.3.2.1 菌株的最適培養pH和溫度

以培養至24 h的菌液OD600為評價指標,探索菌株在MRS液體培養基的最適初始pH以及最適培養溫度。

1.3.2.2 菌株耐鹽、抑菌能力

參照文獻[9]的方法測定菌株耐鹽能力。參照文獻[10]的方法檢測菌株對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)以及從傳統發酵霉魚中分離的嗜麥芽窄食單孢菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)的抑制效果。

1.3.3 清酒乳桿菌對霉魚食用品質及揮發性物質形成的影響

1.3.3.1 發酵工藝流程

自然發酵霉魚制作流程:

a)取新鮮鳙魚,除去魚鱗,剖腹宰殺,去除內臟、魚頭和魚尾,用流水清洗干凈;

b)切成寬二寸長四寸塊狀,晾干,放入盆中,加食用鹽(5%,質量分數)拌勻;

本文首先總結了瀝青路面坑槽病害的成因與一般修補技術，然后在某高速公路中使用冷補瀝青修補料進行坑槽病害修補，并對其養護維修效果進行檢測分析，結果表明：冷補瀝青修補料能有效修復路面坑槽病害，修補路面的抗滑性能可滿足行車安全要求，同時具有較好的抗滲性能，能有效減緩路面水損害現象，對提高道路的使用壽命具有積極意義。

c)待2 h后再拌辣椒面(按照質量分數10%加辣椒面),并逐塊放入干凈的罐中,發酵48 h。

接種發酵霉魚制作流程:

將1.3.3.1節b)中魚塊晾干后,改為按1.00 kg魚塊添加1.25 g清酒乳桿菌濕菌體的量,將清酒乳桿菌均勻涂抹在魚塊的表面,在盆中加食用鹽拌勻。

1.3.3.2 色澤、質構測定

參照LUO等[11]和周迎芹等[12]的方法測定魚肉的色澤、質構,每個樣品平行測定6次。

把樣品切成1 cm厚的塊狀,采用手持色差儀測定魚肉的亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*),以平均值作為各參數測定值。樣品白度的計算如公式(1)所示:

(1)

參照文獻[12]的方法測定質構各參數。

1.3.3.3 電子鼻檢測

表1 PEN3型電子鼻的標準傳感器信息

1.3.3.4 揮發性風味物質測定與鑒定

參照文獻[13]的方法對霉魚揮發性風味物質進行測定與鑒定。

1.3.3.5 關鍵風味物質分析

采用劉登勇等[14]提出的相對氣味活度值法(relative odor activity value,ROAV)對自然發酵和接種發酵的霉魚中關鍵風味化合物進行分析。

1.4 數據處理

所有試驗結果以平均值±標準差表示,采用Origin 2018繪圖,Mega 6.0構建細菌系統發育樹,顯著性差異分析采用SPSS 16.0中Duncan檢驗,P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 清酒乳桿菌的分離與鑒定

利用傳統分離培養手段,從自然發酵霉魚中分離到一株符合清酒乳桿菌形態學特征的菌株,并命名為1-3。菌株1-3的菌落特征(圖1-a)為黃色,邊緣整齊,中央凸起,表面光滑;革蘭氏染色呈陽性,短桿狀排列,無鞭毛,無芽孢,單個或成對,成鏈狀排列(圖1-b和圖1-c)。對菌株1-3的16S rDNA基因進行測序,測序后,利用NCBI網站上進行BLAST分析,篩選出同源性較高的16S rDNA的基因序列作為參比對象,采用領接法構建進化樹。由圖2可確定菌株1-3為清酒乳桿菌。

a-菌落形態;b-革蘭氏染色結果;c-掃描電鏡圖

圖2 清酒乳桿菌1-3的系統發育樹

2.2 清酒乳桿菌的生物學特性

2.2.1 清酒乳桿菌的最適培養pH和溫度

對菌株1-3培養pH和溫度進行優化,結果如圖3所示。在pH為4.0～8.0時,菌液OD600值不斷升高,pH值為8時OD600值最大,為1.58±0.04。當pH進一步升高后,可能由于不再適合菌株生長,菌液OD600驟降。在培養溫度為4～25 ℃時,隨著溫度升高菌液OD600升高,在25～42 ℃則隨著溫度升高而下降。因此可知菌株1-3的最適培養條件為pH 8,溫度25 ℃。

a-pH;b-培養溫度

2.2.2 清酒乳桿菌耐鹽、抑菌能力

對菌株1-3耐鹽能力進行測定,結果如圖4所示。在0.00～0.04 g/mL的NaCl添加量下,菌液OD600顯著下降,從2.02±0.01降低至1.90±0.00。當NaCl添加量為0.08～0.10 g/mL時,菌液OD600有所下降,但不明顯,且菌液OD600仍可維持在1.80以上,表明菌株1-3具有一定的耐鹽能力,在較高鹽濃度的環境中仍能生長和繁殖得較好。

圖4 清酒乳桿菌1-3對NaCl的耐受結果

以金黃色葡萄球菌以及本實驗室在霉魚中分離到的沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單孢菌作為指示菌,研究清酒乳桿菌1-3的抑菌能力,結果如圖5所示。由圖5 可以看出,菌株1-3培養上清液對所有指示菌均有不同程度的抑制作用。對霉魚源沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單孢菌抑菌圈直徑分別為(11.55±0.36) mm,(12.27±0.33) mm,對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到(11.62±0.42) mm。

a-沙雷氏菌;b-嗜麥芽窄食單孢菌;c-金黃色葡萄球菌

2.3 清酒乳桿菌對霉魚食用品質及揮發性物質形成的影響

2.3.1 清酒乳桿菌對魚肉色澤、質構的影響

自然發酵和接種發酵霉魚無明顯色差,通過清酒乳桿菌接種發酵后,霉魚的白度和亮度均降低(圖6),魚肉質構無明顯變化,具體表現為硬度、彈性、內聚性和咀嚼性均無顯著性變化(圖7),表明清酒乳桿菌接種發酵對霉魚的色澤和質構無明顯影響,可用來接種發酵霉魚。

圖6 清酒乳桿菌1-3對霉魚色澤的影響

a-硬度;b-彈性;c-內聚性;d-咀嚼性

2.3.2 基于電子鼻技術分析清酒乳桿菌對魚肉氣味的影響

自然發酵和接種發酵霉魚電子鼻結果如圖8所示,2組樣品的響應值差異主要在W1S(對甲基類敏感)、W1W(對硫化物敏感)。接種發酵的霉魚比自然發酵霉魚對硫化物響應度高,對甲基類的響應度低。但2組樣品對甲基類、對硫化物的響應度均較大。

圖8 電子鼻傳感器的響應雷達圖

2.3.3 清酒乳桿菌對魚肉揮發性風味物質形成的影響

2.3.3.1 霉魚揮發性風味成分分析

對自然發酵和接種發酵霉魚揮發性風味成分進行對比分析,結果見圖9和附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)。霉魚共檢測出66種揮發性風味物質,包括烴類8種,醇類14種,醛類5種,酮類10種,酯類13種,酸類2種,芳香類6種和其他類8種。自然發酵霉魚中檢出41種揮發性風味物質,接種發酵霉魚中檢出54種揮發性風味物質,比自然發酵霉魚多13種風味物質,說明相比于自然發酵,利用清酒乳桿菌發酵可以有效豐富霉魚的風味。不同發酵方式下霉魚揮發性風味物質組成和占比存在著差異,自然發酵霉魚中相對占比最高的是醇類物質為(37.87±3.57)%,而接種發酵霉魚中醇類物質只占(25.43±0.53)%;接種發酵霉魚中揮發性物質以芳香類為主,相對占比為(35.23±0.98)%。此外,接種發酵霉魚中還檢測出酸類物質,且比自然發酵多4種酯類物質。

a-風味成分類別;b-風味成分占比

烴類物質感官閾值高,對霉魚整體風味影響小,但烯烴類化合物可形成醛酮類物質[15-16]。2種發酵方式下霉魚中烴類物質含量均較高,主要為十七烷,分別為(8.64±3.54)%和(14.53±2.37)%。此外,接種發酵霉魚中檢測出的烯烴化合物較多,如衣蘭烯、雅欖藍烯和(E)-14-十六碳烯等。醇類物質閾值一般較高,對風味貢獻較小,但不飽和醇類閾值較低,對霉魚整體風味貢獻較大,如1-辛烯-3-醇,閾值為1 μg/kg,具蘑菇香、油脂味和土腥味[17];芳樟醇感官閾值為6 μg/kg,具柑橘味、花香、木香等特征風味,可能來自于霉魚制作過程中添加的辣椒面,其在自然發酵和接種發酵霉魚中均被檢出。

醛類物質主要來源于不飽和脂肪酸的氧化降解,閾值低,對霉魚的整體風味影響大,通常具甜味、清香、果香、脂香等良好風味[18]。自然發酵霉魚中醛類物質僅為(0.02±0.00)%,而接種發酵霉魚醛類含量相對較高為(3.24±0.03)%,且種類較多,說明接種發酵可較好改善霉魚風味。自然發酵和接種發酵霉魚中酮類物質種數較多,均為9種,酮類物質主要是脂質氧化和氨基酸降解的產物,感官閾值較醛類高,但具有獨特的清香和果香[19],如β-紫羅蘭酮和2-壬酮[20],在自然發酵和接種發酵霉魚中均有檢出,可能對霉魚的風味有一定增強作用。

酯類物質由醇和羧酸的酯化反應形成,呈淡淡的果香和清香[21]。接種發酵霉魚中酯類物質11種,含量為(6.89±0.70)%,均明顯高于自然發酵,表明接種發酵霉魚風味較好。酸類物質通常具刺鼻的不愉快的氣味,閾值較極高[16],對霉魚整體風味影響小。接種發酵霉魚中酸類物質含量僅為(0.09±0.00)%,而自然發酵未檢出,這可能是在自然發酵霉魚中含量過低而未能檢測出。接種發酵和自然發酵霉魚均檢出含量較高的芳香類物質,其可能來自于類脂、烴類等化合物高溫下裂解,或來源于香辛料[22]。其中愈創木酚(10 μg/kg)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3 μg/kg)的閾值低,對霉魚熏肉香、煙熏味等氣味貢獻較大。此外,霉魚中還檢測出少量吡嗪、吡啶、呋喃等雜環類化合物,是一類重要的風味化合物,感官閾值相對較低,可由脂質氧化、美拉德反應形成,具很強的烤肉味、堅果香、火腿香味等[23]。

2.3.3.2 霉魚關鍵風味成分

風味貢獻取決于揮發性化合物占比及其閾值[24]。對霉魚揮發性風味物質進行ROAV分析,該方法認為ROAV越大對整體風味貢獻越大。由附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)可知,自然發酵和接種發酵霉魚關鍵風味成分相似,但也存在一定差異,自然發酵和接種發酵霉魚中分別得到3種和2種關鍵風味成分。

在自然發酵和接種發酵霉魚中的均有檢出茴香腦、桉樹醇,苯乙酮等,賦予了霉魚辛香、木香味,其可能主要來自于制作過程中添加的辣椒面[25]。2種霉魚中醇類物質ROAV最大的均為1-辛烯-3-醇,在接種發酵和自然發酵霉魚中分別為4.86和4.95,其對霉魚蘑菇香、油脂味和土腥味等氣味具有較大貢獻。貢獻甜香、木香的芳樟醇為臭鱖魚重要的風味物質[12],在霉魚中也有檢測出,其對霉魚獨特風味的形成起到重要的修飾作用。β-環檸檬醛僅在接種發酵霉魚中檢出,ROAV>0.1,對霉魚風味有修飾作用,貢獻清香、花香。在自然發酵和接種發酵霉魚中β-紫羅蘭酮ROAV均為100,對霉魚的整體風味貢獻最大,貢獻了花香、果香、木香。2-十一酮僅在接種發酵霉魚中檢出,對霉魚風味有重要的修飾作用,具蠟香、奶油香、油脂味。在接種發酵霉魚中還發現異戊醇(酸臭味)和一些常見的腥味物質[26]如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然發酵霉魚中的ROAV值小,說明清酒乳桿菌的接入,可以降低腥味和酸臭味,增加香氣,提升霉魚的風味。酯類物質通常閾值較高,其ROAV較小,對霉魚的整體風味貢獻不大,但在接種發酵霉魚中的酯類物質較自然發酵霉魚要豐富,共同賦予霉魚酯香、蠟香、甜香等。

綜上可知,清酒乳桿菌的接入,可以在一定程度上降低腥味和酸臭味,改善發酵制品的風味,使得霉魚中各種類風味物質含量較為均衡,共同造就霉魚酯香、甜香等多層次風味特征。

3 結論

從傳統自然發酵霉魚中分離出一株清酒乳桿菌,命名為1-3,其在MRS液體培養基中最佳培養條件為pH 8,溫度25 ℃。該菌對沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌和嗜麥芽窄食單孢菌具有抑制作用,可耐受10%的NaCl濃度;菌株1-3接種發酵霉魚與自然發酵霉魚相比,色差、質構均無顯著性差異。電子鼻結果表明,接種發酵的霉魚比自然發酵霉魚對硫化物響應度高,對甲基類的響應度低,但2組樣品對甲基類、對硫化物的響應度均較大。自然發酵和接種發酵霉魚中分別檢出41種和54種揮發性風味物質,自然發酵霉魚中相對含量最高的是醇類物質為(37.87±3.57)%,而接種發酵霉魚中醇類物質只占(25.43±0.53)%;接種發酵霉魚中揮發性物質以芳香類為主,相對含量為(35.23±0.98)%。自然發酵和接種發酵霉魚中分別得到3種和2種關鍵風味成分,其中接種發酵霉魚中異戊醇(酸臭味)和一些常見的腥味物質如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然發酵霉魚中的ROAV值小。綜上,利用清酒乳桿菌株純種發酵霉魚工業化生產可行,比自然發酵霉魚揮發性成分種類多,在一定程度上降低腥味和酸臭味,并產更多樣化的酯類化合物,賦予霉魚更濃郁的酯香、甜香。后續可進一步通過分子感官科學手段,研究接種發酵霉魚發酵過程中主體風味物質形成途徑,為霉魚特殊風味的形成機理提供參考依據,進一步指導霉魚的風味品質優化。