香芹酚乳液的穩定性和抑菌性研究

吳晨光,李兆豐,2,3,4,顧正彪,2,3,班宵逢,2,3,洪雁,2,3,程力,2,3,4,李才明,2,3*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

3(江南大學,江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心,江蘇 無錫,214122)

4(江南大學,白馬未來食品研究院,江蘇 無錫,214122)

植物精油是植物體內的次生代謝產物,主要來自于植物的花、根、葉、樹皮、果實、種子等,揮發性高,具有強烈的芳香氣味[1]。植物精油中的化學成分比較復雜,主要包括酚類、烯類、脂類、萜類、醛酮類等化合物及其衍生物。其中,酚類、萜類和醛酮類物質是主要的抑菌成分,正是由于這些生物活性物質的存在,使其具有良好的抑菌效果,并且,植物精油從天然產物中提取,與化學合成抑菌劑相比,具有廣泛的抑菌特性以及對人體較小的危害,是合成抑菌劑的優良替代品[2]。

但是植物精油對高溫、紫外等環境敏感,生物活性物質容易揮發,并且植物精油親水性較差,在水溶液中的溶解度較低,導致其在實際應用中受限[3]。

乳液遞送體系可將精油包埋,使精油分子得到有效的保護、提高植物精油的水溶解性和生物利用度[4]。SYED等[5]利用吐溫80和阿拉伯膠制備了香葉醇和香芹酚精油乳液,表明其對蠟狀芽胞桿菌和大腸桿菌均有良好的抑菌活性。MAURIELLO等[6]利用乳清分離蛋白和吐溫80分別作為乳化劑制備了香芹酚乳液,發現乳液中香芹酚含量越高,其最小抑菌濃度越低,抑菌活性越強。目前研究中,需在乳液體系中添加較多的乳化劑來穩定乳液,而乳化劑的增加會影響乳液的抑菌性,同時精油的負載量也受到限制[7]。因此,如果能夠以較少的乳化劑制備出精油負載量較高的乳液,將節省乳液的制備成本,精油的利用率也將大大提升。

在本研究中,使用吐溫80、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)作為乳化劑,使用無水乙醇作為助乳化劑,制備不同的香芹酚乳液,探究乳化劑的添加量對乳液粒徑、多分散指數(polydispersity index,PDI)以及Zeta電位的影響,同時,探究不同精油含量下香芹酚乳液的穩定性和抑菌性差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香芹酚(carvacrol,CA,>99%),廣州日化化工有限公司;大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌(ATCC 14028)、枯草芽孢桿菌(CMCC 63501),上海魯微科技有限公司;無水乙醇、吐溫80、SDS、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉以及其他常用分析純化學試劑,國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

C-MAG HS 10型加熱磁力攪拌器、T18型高速剪切機,德國IKA有限公司;SCIENTZ 150型高壓均質機,寧波新芝生物科技股份有限公司;SK-O180-E型圓周(線性)搖床,大龍興創實驗儀器有限公司;GI54T型高壓滅菌器,美國致微公司;BPH-9042型精密恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;ZetaSizer nano ZS型納米粒度及Zeta電位儀,英國馬爾文公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;UV-3600 plus型紫外可見近紅外分光光度計,日本島津公司;DHR-3型流變儀,美國沃特世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香芹酚精油乳液的制備

使用吐溫80和SDS作為乳化劑,并將CA和無水乙醇混合成香芹酚乙醇混合液(carvacrol ethanol solution,CES),其中CES中CA的含量分別為100%、75%、50%、25%(質量分數)。分別將CES和乳化劑添加到一定量去離子水中,在室溫下以300 r/min的轉速磁力攪拌20 min,然后使用高速剪切機在1.0×104r/min下高速剪切2 min,得到粗乳液,在300 Bar壓力下,使用高壓均質機循環均質3次,得到香芹酚精油納米乳液。其中吐溫80的添加量為10、30、50、70、90 g/L,SDS的添加量分別為1、3、5、7、9 g/L,CES的添加量分別為100、150、200、300、400 g/L。

1.3.2 乳液的平均粒徑、PDI、Zeta電位測定

使用納米粒度及Zeta電位儀測定香芹酚精油乳液的粒徑、PDI及Zeta電位。儀器參數設置為固定角度90°、散射角為173°、相對折射率為1.590、吸收率為0.001、平衡時間120 s、測量溫度為25 ℃,測量前用去離子水將樣品稀釋100倍[8]。

1.3.3 乳液流變行為測定

使用流變儀對香芹酚精油乳液的流變特性進行測定。實驗使用4 cm平板,間距為0.5 mm,在25 ℃下,測定不同剪切速率(0.01～100 s-1)下乳液的表觀黏度變化[9]。

1.3.4 貯藏穩定性測定

將乳液分別在4 ℃和25 ℃下貯藏,在0、15、30、45 d測定乳液的平均粒徑。

1.3.5 抑菌性測定

1.3.5.1 細菌菌懸液的制備

取100 μL細菌菌種接種于50 mL TSB培養基中,于37 ℃搖床中培養12 h,并使用平板計數法進行計數。

1.3.5.2 抑菌圈大小的測定

參考黃旭華等[10]的方法并作出修改進行抑菌圈大小的測定,操作均在無菌條件下進行。取直徑為35 mm的一次性塑料培養皿,傾注加入加熱融化的TSA培養基2 mL,均勻攤布,使其凝固,作為底層。將加熱融化的TSA培養基放冷至45～50 ℃,加入供試菌菌懸液,使菌濃度在105～106CFU/mL,并將牛津杯置于凝固的TSA培養基上方中心位置,在每個平板中分別加入3 mL含菌懸液的TSA培養基,使其環繞在牛津杯外側,均勻攤布,作為菌層。待菌層凝固后,取出牛津杯,在孔中加入100 μL相同精油濃度的抑菌溶液,將培養皿放入恒溫培養箱,培養24 h后,采用十字交叉法測量抑菌圈大小,重復3次,以無菌水作為空白對照。

1.3.5.3 最小抑菌濃度的測定

按照瓊脂稀釋法測定香芹酚精油和香芹酚乳液的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。分別將香芹酚和乳液稀釋到一定濃度,然后與等量的雙倍瓊脂培養基混合,制備香芹酚質量濃度為5～0.009 8 mg/mL的梯度平板,取菌濃度約為107CFU/mL的菌懸液2 μL接種于平板表面,最后將平板放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,觀察有無菌體生長[11]。

1.3.6 抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力測定參考梁尚云[12]的方法并稍作修改。配制200 μmol/L DPPH-乙醇溶液,取2 mL稀釋后的樣品,加入2 mL DPPH-乙醇溶液并混合均勻,避光反應30 min,在517 nm下測定吸光度值。DPPH自由基清除率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0,無水乙醇與DPPH-乙醇溶液混合后的吸光度值;A1,樣品與無水乙醇混合后的吸光度值;A2,樣品與DPPH-乙醇溶液混合后的吸光度值。

1.4 數據處理

采用Excel 2016軟件處理數據的平均值和標準誤差;采用SPSS 22.0軟件進行數據的顯著性分析,其中P<0.05視為顯著,程序選擇:Duncan;采用Origin Pro 2017進行圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 香芹酚乳液的粒徑、PDI和Zeta電位

2.1.1 吐溫80添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當CES的添加量為100 g/L時,不同吐溫80含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表1所示。香芹酚乳液的粒徑隨著吐溫80含量的增加,香芹酚乳液的粒徑和PDI變化均是先減小后增大,當吐溫80含量為50 g/L時,粒徑最小。其原因可能是當吐溫80含量較低時,精油未被完全包埋,無法形成小液滴,增加吐溫80的含量,使得乳液粒徑減小,而繼續增加吐溫80的含量,乳液中過多的乳化劑會形成膠束,從而導致粒徑和PDI的增大[13]。Zeta電位一般用來表示乳液分散體系的穩定性,由于乳液液滴間存在靜電斥力,Zeta電位絕對值越高表示乳液體系越穩定[14]。當吐溫80含量為10～50 g/L時,香芹酚乳液的Zeta電位絕對值會隨著吐溫80含量的增加增大,而吐溫80含量為50～90 g/L時,Zeta電位變化不明顯。因此,選擇50 g/L的吐溫80含量進行后續的研究。

表1 吐溫80添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.2 CES中CA含量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當吐溫80的含量為50 g/L、CES的添加量為100 g/L時,CES中不同CA含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表2所示。無水乙醇常作為助溶劑進行精油乳液的制備,不添加無水乙醇的香芹酚乳液粒徑和PDI較大,隨著CES中CA含量的降低,乳液的粒徑和PDI變化均為先減小后增大,而Zeta電位絕對值卻逐漸降低。其原因可能是適量無水乙醇的加入降低了乳液體系的界面張力,增強了香芹酚的水溶解性,使得乳液的粒徑和PDI降低,但當CES中無水乙醇含量較高時,阻礙了乳液界面膜的形成,使得乳液的粒徑增大、Zeta電位絕對值降低[15]。因此,選擇75%(質量分數)CA含量的CES[即m(香芹酚)∶m(無水乙醇)=3∶1)]進行后續研究。

表2 CES中CA的含量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.3 SDS添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

當吐溫80的含量為50 g/L、CES的添加量為100 g/L時,不同SDS含量下制備的香芹酚乳液的粒徑、PDI及Zeta電位如表3所示。從測定結果可以看出,SDS的加入使得香芹酚乳液的粒徑和PDI降低,Zeta電位絕對值增加。并且香芹酚乳液的平均粒徑和PDI會隨著SDS含量的增加而降低,而Zeta電位絕對值則隨著SDS含量的增加先增大后減小,當SDS含量為5 g/L時,Zeta電位絕對值最高。其原因可能是SDS的加入降低了界面張力,并能夠在液滴上形成保護層,增強液滴間的靜電斥力,使得乳液粒徑和PDI降低、Zeta電位絕對值增加,但過多的SDS會和吐溫80形成膠束,減弱了液滴間的靜電斥力,使得降乳液的Zeta電位絕對值降低[16]。因此,選擇5 g/L的SDS含量進行后續的研究。

表3 SDS添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

2.1.4 CES添加量對香芹酚乳液粒徑、PDI、Zeta電位的影響

以吐溫80作為乳化劑或以吐溫80和SDS作為復合乳化劑制備不同CES含量的香芹酚乳液,其平均粒徑、PDI和Zeta電位測量結果見表4。只使用50 g/L的吐溫80作為乳化劑,可以穩定香芹酚乳液,但當CES含量達到250 g/L時,會迅速出現破乳現象,乳液極不穩定。吐溫80體系中,香芹酚乳液粒徑會隨著CES含量的增加而不斷增大,PDI值為0.39～0.41,均在0.3以上,說明體系分散不均勻,乳液粒徑大小不均一[17]。其原因可能是在50 g/L的吐溫80含量下,隨著CES含量的增加,吐溫80不足以完全覆蓋乳液液滴,乳液由于聚結而不穩定,導致其粒徑增大[18]。而SDS的添加可顯著降低香芹酚乳液的平均粒徑和PDI,并且將CES含量提高到了400 g/L,而當CES含量提高到500 g/L時,乳液過于黏稠,無法進行均質過程。使用50 g/L的吐溫80和5 g/L的SDS共同穩定香芹酚乳液,平均粒徑和PDI都會隨著CES含量的增加而減小,當CES含量為400 g/L時,平均粒徑和PDI最小。其原因可能是SDS和吐溫80疏水鏈之間存在相互作用,形成了更加剛性的膠束,使得疏水性的香芹酚分子更穩定地包裹在膠束中,從而增加了香芹酚的溶解度,提高了香芹酚乳液的穩定性[19]。

表4 CES添加量對香芹酚乳液的平均粒徑、PDI和Zeta電位的影響

在吐溫80體系中,Zeta電位絕對值會隨著CES含量的增加而增大。其原因可能是香芹酚所含有的一些陰離子基團以及非離子表面活性劑吐溫80會在油水界面上產生負電荷,當香芹酚含量增加時,過多的陰離子基團暴露在油水界面導致電位絕對值的增加[20]。而吐溫80/SDS(T/S)穩定的香芹酚乳液,Zeta電位絕對值均處于較高的值,其原因可能是SDS為陰離子表面活性劑,帶負電荷,SDS的加入增強了乳液液滴之間產生的靜電斥力,使得吐溫80/SDS體系的乳液更加穩定[21]。但是,Zeta電位只能表示香芹酚乳液測試時的穩定性,并不能說明乳液的長期穩定性[22]。因此,有必要探究其貯藏穩定性。

2.2 貯藏穩定性

吐溫80體系和吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液在4 ℃和25 ℃下的貯藏45 d的粒徑變化如圖2所示。通過測定結果可以發現,吐溫80體系的香芹酚乳液貯藏在4 ℃下時,貯藏30 d后粒徑會有明顯的增加,而在25 ℃下貯藏15 d后粒徑迅速增加,由此可見,吐溫80體系的香芹酚乳液更適合在低溫下貯藏。粒徑增加的原因可能是乳液在高壓均質過程中吸收了過多的能量,形成了小液滴,維持了乳液的穩定性,但在貯藏過程中受到奧斯特瓦爾德熟化的作用,小液滴聚集成大液滴,導致粒徑的增大[23-24]。而吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液在4 ℃、25 ℃下貯藏45 d,其粒徑無明顯變化,表明吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液貯藏穩定性良好,可見SDS的加入增強了香芹酚乳液的貯藏穩定性。

a-4 ℃;b-25 ℃

2.3 乳液的流變特性

乳液的流變行為不僅影響乳液的適用性,還關系到乳液的穩定性[25]。因此,研究不同香芹酚乳液的流變性質至關重要。

以50 g/L吐溫80和5 g/L SDS穩定的香芹酚乳液的流變行為如圖3所示。通過測定結果可以發現,隨著剪切速率的增加,所有乳液的表觀黏度逐漸降低,表明所有體系的香芹酚乳液存在剪切變稀行為,在較高的剪切速率下,乳液內部結構被破壞,乳液的表觀黏度變化逐漸平穩。在吐溫80/SDS體系中,香芹酚乳液的表觀黏度也會隨著CES含量的增加而增大。尤其是當CES含量由300 g/L提高到400 g/L時,乳液表觀黏度急劇增加,其原因可能是香芹酚的含量較高時,發生了連續相的轉變,界面面積增加,界面之間的相互作用增強,從而導致乳液表觀黏度的增加[26]。因此,后續選擇表觀黏度適中、CES含量較高的香芹酚乳液T/S-300進行研究。

圖3 香芹酚乳液的流變行為

2.4 抑菌圈大小

吐溫80體系和吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小如表5所示。通過測量結果可以發現,所有的香芹酚乳液對4種供試菌均有良好的抑菌活性,并且香芹酚乳液的抑菌性都會隨著CES含量的增加而增強,其原因可能是在較低的精油含量下,精油被大量的乳化劑包裹,使得香芹酚的釋放受到了限制,導致香芹酚乳液抑菌性的減弱[27]。

表5 香芹酚乳液對供試菌的抑菌圈大小 單位:mm

雖然2種體系的抑菌性都會隨著精油含量的增加而增強,但是2種體系之間的抑菌性也存在一定的差異。通過比較相同CES含量下不同香芹酚乳液的抑菌圈大小,可以發現,SDS的加入使得乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性得以增強。其原因可能是SDS能夠滲透到微生物的細胞膜中,干擾與細胞膜相關的功能蛋白,導致微生物的細胞膜破裂和部分生物功能喪失[28]。

2.5 MIC

MIC是指抑菌劑能抑制微生物生長的最低濃度,可用來評價抑菌劑抑菌的強弱,數值越小,表示其抑菌性越強[29]。為了比較純精油和乳液的抑菌性差異,測定了香芹酚純精油和香芹酚乳液T/S-300對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的MIC,如表6所示。結果顯示,香芹酚純精油和香芹酚乳液對金黃色葡萄球菌的MIC相同,而香芹酚純精油對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的MIC分別是乳液的2、4、2倍,表明香芹酚制備成乳液后抑菌活性有了明顯的增強?？赡苁窍闱鄯又苽涑扇橐汉蟾纳屏司偷乃芙庑?使得乳液中的活性物質能夠更快地與微生物細胞膜結合,從而破壞細胞膜導致細胞死亡[30]。PILONG等[31]也得出了相同結論,與丁香油相比,丁香油納米乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性更強。

表6 香芹酚和香芹酚乳液對供試菌的MIC 單位:mg/mL

2.6 抗氧化活性

DPPH自由基清除能力可作為評價物質抗氧化活性的重要指標[32]。香芹酚純精油和香芹酚乳液的DPPH自由基清除率如圖4所示。通過測定結果可以看出,香芹酚乳液的DPPH自由基清除能力明顯強于香芹酚純精油,在1、2、3、4、5 mg/mL的香芹酚含量下,香芹酚乳液的DPPH自由基清除率分別增強了12.88%、12.18%、7.13%、6.56%、7.90%,香芹酚含量較低時,抗氧化活性提升更為明顯。這是由于香芹酚制備成乳液后克服了香芹酚水溶性差的缺點,有助于充分發揮其活性作用,從而提升了香芹酚清除自由基的能力[33]。

圖4 香芹酚和香芹酚乳液的DPPH自由基清除能力

3 結論

本文使用吐溫80和SDS作為復合乳化劑進行香芹酚乳液的制備,與單一乳化劑制備的香芹酚乳液相比,既增大了精油負載量,又減小了乳液的平均粒徑,貯藏穩定性更好。通過流變行為的測定,發現吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液當CES含量達到400 g/L時,會發生連續相的轉變,表觀黏度急劇增加。通過抑菌圈直徑測定了不同乳液的抑菌性,結果顯示,乳液的抑菌性會隨著CES含量的增大而增強,而吐溫80/SDS體系的香芹酚乳液抑菌性更強。通過比較香芹酚乳液和純精油的最小抑菌濃度和抗氧化活性,發現香芹酚乳液的抑菌性和抗氧化活性明顯強于香芹酚。本研究使用吐溫80和SDS復合乳化劑增大了精油負載量,并提高了香芹酚精油乳液的穩定性和抑菌性,但目前尚未進行抑菌機理的探究和食品保鮮的應用,下一步將進行抑菌機理的探究,并將乳液應用到果蔬、谷物類、肉類等食品保鮮中。