金蕎麥總黃酮對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的影響

郝潔,林紅英,彭金菊,謝為天,陳志寶,2*

1(廣東海洋大學 濱海農業學院,廣東 湛江,524088)

2(廣東海洋大學 深圳研究院,廣東 深圳,518108)

金蕎麥,屬蓼科蕎麥屬,又名天蕎麥、野蕎麥、蕎麥三七、金鎖銀開,常以根入藥,主要成分為金蕎麥黃酮,其具有良好的自由基清除能力,有助于減少免疫細胞釋放促炎細胞因子,改善腸黏膜屏障的受損,刺激動物免疫器官的生長發育,提高巨噬細胞的吞噬功能,降低機體血糖和血脂水平,有效緩解關節炎癥[1-4]。隨著人類生活水平的日益提高以及亞健康狀態的長期維持,保健食品的重要性愈發突出,金蕎麥作為中國重要的傳統中草藥,其塊根中的活性提取物可作為綠色保健食品之一,其富含的多種營養成分及功效在未來的市場中具有巨大的潛力。

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由多種內源性和外源性刺激引起肺部出現以炎癥反應、肺水腫和肺泡毛細血管屏障損傷為病理特征,以呼吸衰竭綜合癥和進行性低氧血癥為臨床特征的綜合病征[5-6]。大量研究表明,氧化應激和過度炎癥是急性肺損傷發生發展的2個重要因素,是急性呼吸窘迫綜合征、肺炎、急性呼吸衰竭、膿毒癥等的輕度病理階段[7-8]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大多數食源性致病菌如大腸桿菌的主要毒性成分,廣泛用于誘導細菌感染引起的ALI[9]。當肺部識別到病原體入侵時,先天免疫系統啟動,RAW 264.7 細胞作為肺遠端最豐富的先天免疫細胞被激活,細胞膜受體識別病原體引發強烈的免疫應答,活性氧(reactive oxygen,ROS)產生,RAW 264.7 細胞向 M1 極化從而分泌促炎介質,調控機體免疫系統[10-11]。因此,本研究擬通過 LPS 建立 RAW 264.7 細胞損傷模型及小鼠急性肺損傷模型,探究天然金蕎麥總黃酮對食源性致病菌誘發 RAW 264.7 細胞損傷和小鼠急性肺損傷的作用,為開發其作為有效抑制肺部炎癥的保健食品提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性昆明小鼠[(20±2) g]購自珠海百試通生物科技有限公司,實驗動物許可證號為SCXK(粵)2020-0051,倫理審查批準文號為GDOU-LAE-2022-014;RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞株,上海信裕生物科技有限公司;金蕎麥藥材,產地貴州;DMEM基礎培養基,美國GIBCO公司;胎牛血清,Clark;青-鏈霉素,美國GIBCO公司;脂多糖,美國Sigma公司;CCK-8活細胞檢測試劑盒,Abmole公司;白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)和白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)、白細胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素18(IL-18) ELISA 試劑盒,北京奇松生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(dehydrogenase,LDH)活性檢測試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測試劑盒、過氧化氫(H2O2)測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;活性氧(reactive oxygen,ROS)、CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒、總谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;無水乙醇、NaNO2、AlNO3、NaOH,均為分析純,廣州科誠生物有限公司;甲醇(LC-MS級)、乙腈(LC-MS級),美國Honeywell公司;甲酸(LC-MS級),美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TU-1800紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵,上海亞榮生化儀器廠;DF-1集熱式攪拌器,金壇市虹盛儀器廠;多功能粉碎機,萊芙LFP-800T;電子天平,上海越平科學儀器有限公司;二氧化碳細胞培養箱,美國Thermo公司;超凈工作臺,蘇州安泰科技有限公司;OLYMPUSBX40光學顯微鏡,日本OLYMPUS公司;高速臺式離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;恒溫水浴箱CU600,上海一恒公司;超低溫冰箱,青島海爾股份有限公司;酶標儀,美國Bio-Tek公司;超高效液相色譜儀,AB Sciex公司;高靈敏度質譜,AB Sciex公司;純水儀,Merck Millipore;C18色譜柱,Waters公司。

1.3 研究方法

1.3.1 金蕎麥總黃酮的提取及鑒定

將塊狀的金蕎麥根莖粉碎,60 ℃熱風干燥至恒重,取金蕎麥藥材20 g浸泡17 h后,用75%乙醇浸泡提取3次,真空抽濾,棄去殘渣,合并3次提取液于同一燒瓶。將提取液分次加入到旋轉蒸發儀中進行濃縮,濃縮溫度為70 ℃,濃縮至藥液不再沸騰倒出濃縮液。利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜鑒定金蕎麥總黃酮的成分。

1.3.2 金蕎麥總黃酮對LPS誘導RAW 264.7細胞損傷的影響

1.3.2.1 供試樣品的制備與處理

金蕎麥總黃酮溶液:稱量干燥的金蕎麥總黃酮,在無菌條件下,以DMSO為溶劑,制備成5 mg/mL母液,并過0.22 μm微孔濾膜過濾,分裝后置于4 ℃保存。

LPS溶液:在無菌條件下,精確稱取脂多糖粉末用PBS制備成1 mg/mL母液,并用0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝后置于4 ℃保存。

1.3.2.2 細胞培養

細胞復蘇:37 ℃水浴融化凍存管,加入1 mL培養基離心,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入5 mL完全培養基轉移到細胞瓶。

細胞培養:RAW 264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞)用含10%胎牛血清和100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養基,在含有5% CO2的培養箱里37 ℃培養。

細胞傳代:待細胞密度達到90%左右棄上清,加入PBS清洗培養瓶內細胞1～2次,加入1 mL胰酶,37 ℃消化1～2 min后加入2 mL完全培養基終止消化,5 mL離心管收集細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加2 mL完全培養基,吹打均勻,各吸取1 mL到細胞培養瓶中,補加4 mL完全培養基,放入培養箱培養。

細胞凍存:待細胞貼壁生長到90%左右傳代,PBS洗2遍,然后加2 mL完全培養基輕輕吹打,轉移到離心管里,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入1 mL的細胞凍存液吹打均勻,將其程序降溫后移入液氮。

1.3.2.3 細胞分組和模型建立

將細胞分為5組:正常組(細胞不經處理)、LPS組(僅用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮低濃度組(用10 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮中濃度組(用20 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮高濃度組(用30 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)。

1.3.2.4 RAW 264.7細胞生存能力分析

將RAW 264.7細胞以1×105cell/mL接種于96孔板中,在含有5% CO2的培養箱里37 ℃繼續培養12 h后,依次加入不同濃度的藥物,采用CCK-8法檢測RAW 264.7的細胞活力。

LPS對RAW 264.7細胞活力檢測:將0、5、10、20、30、40 μg/mL LPS溶液取100 μL加入96孔培養板中,培養12 h,加入10 μL CCK-8溶液,在培養箱中孵育1 h,用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

金蕎麥總黃酮對RAW 264.7的細胞活力檢測:將0、12.5、25、50、100、150 μg/mL金蕎麥總黃酮取100 μL加入96孔板中培養12 h,加入10 μL CCK-8溶液,在培養箱中孵育1 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

金蕎麥總黃酮對炎癥狀態下RAW 264.7的細胞活力檢測:按照1.3.2.3節步驟進行,最后加入10 μL CCK-8溶液,在培養箱中孵育1 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

細胞活力計算如公式(1)所示:

(1)

注:A(加藥):含有細胞、CCK-8和不同濃度金蕎麥總黃酮溶液孔的吸光度;A(空白):含有培養基和CCK-8的細胞孔吸光度;A(0加藥):含有細胞、CCK-8溶液,不含藥物溶液孔的吸光度。

1.3.2.5 RAW 264.7細胞中LDH活力測定

RAW 264.7細胞按照1.3.2.3節步驟進行處理,收集細胞,按比例加入提取液,超聲波破碎細胞后8 000×g離心10 min,取上清后,按LDH活性檢測試劑盒說明書測定。

1.3.2.6 2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測RAW 264.7細胞內ROS水平

RAW 264.7細胞按照1.3.2.3節步驟在6孔板中分組處理。在黑暗環境中,棄去細胞培養液,加入1 mL 用無血清培養液稀釋的DCFH-DA,37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。用PBS洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。在熒光顯微鏡下觀察熒光強度,實驗每組設定3個平行孔,用Image J軟件分析熒光強度的平均值。

1.3.2.7 RAW 264.7細胞中MDA水平、GSH含量、SOD和CAT活性

收集各處理組的細胞于離心管中,加入相應的提取液,采用MDA、SOD、GSH、CAT商業試劑盒檢測RAW 264.7細胞中MDA水平、GSH含量以及SOD和CAT活性。

1.3.2.8 ELISA法檢測RAW 264.7細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18含量

收集各細胞處理組的上清培養基于離心管中,1 000 r/min離心5 min,將上清轉移至新的EP管中備用,從4 ℃冰箱取出ELISA試劑盒平衡至室溫,按試劑盒中說明書進行操作,每孔加入不同濃度的標準品或上清液,反應終止后,在30 min之內,使用酶標儀測定450 nm最大吸收波長,并計算出TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的含量。

1.3.2.9 Hoechst 33342/PI雙染色檢測RAW 264.7細胞凋亡水平

將RAW 264.7細胞接種于24孔細胞培養板中,分組處理,加入含有10 μL Hoechst 33342和5 μL PI染色液的新鮮培養基共計1 mL,混勻,37 ℃避光孵育30 min。染色后用PBS洗滌2～3次,使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡水平。

1.3.3 金蕎麥總黃酮對LPS誘導小鼠急性肺損傷的影響

1.3.3.1 小鼠急性肺損傷(acute lung injury,ALI)模型的建立及治療

選取5～6周齡的SPF級雄性昆明小鼠[(20±2) g],標準條件下飼養,溫度為(22±2) ℃。實驗小鼠安放在可自由進食和飲水的鼠籠,適應性生長7 d。將小鼠隨機分為5組,每組6只,分別為對照組、LPS組、金蕎麥總黃酮低濃度組、金蕎麥總黃酮中濃度組、金蕎麥總黃酮高濃度組。金蕎麥總黃酮低中高濃度組分別按照25、50、100 mg/kg的劑量灌胃金蕎麥總黃酮,對照組和LPS組灌胃等體積的生理鹽水。飼養12 d后,ALI組、金蕎麥總黃酮低中高濃度組小鼠用乙醚麻醉,鼻內給予1 mg/kg LPS處理12 h以建立急性肺損傷模型,對照組滴鼻同等體積的雙蒸水。

1.3.3.2 標本采集及肺干濕比重(W/D)檢測

LPS給藥12 h后,以乙醚氣體麻醉小鼠后處死,分別收集外周血、肺組織等標本。將收集的血液于常溫靜置1 h后,于4 ℃以3 500 r/min離心15 min,收集上層血清,保存在-80 ℃中備用。分離雙肺,左右肺剪開,取出左肺,用PBS沖洗,吸干表面水分并稱重,在80 ℃烘箱中烘烤36 h,稱其干重,計算W/D。

1.3.3.3 肺組織病理學變化

小鼠右肺組織置于4%的多聚甲醛中固定48 h后,進行以下步驟:

修塊→洗滌→脫水→透明→透蠟→包埋→切片→展片→烘片→脫蠟→脫苯→水洗→蘇木素染色→水洗→分化→水洗→返藍→水洗→伊紅染色→水洗→脫色→透明→封片

在光學顯微鏡下觀察,以HE染色評價各組小鼠肺部病理學變化。

1.3.3.4 小鼠血清中H2O2、MDA和CAT測定

使用活性試劑盒測定血清中MDA、H2O2含量和CAT活性,并使用96孔板讀數器測量對應波長處的吸光度變化。

1.3.3.5 ELISA測定炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β濃度測定

傳統CORDIC算法角度θ的收斂范圍是[-99.872。，99.872。]，而不是[-π，π]，這是傳統 CORDIC 算法的一個缺點，針對該缺點，文中所設計的全流水線三角函數加速核利用三角函數變換的方法來處理，即進行輸入值、輸出值調整來使CORDIC算法收斂域擴展到4個象限[-π，π]。與傳統做法一樣，為了在硬件上實現方便，我們每次選擇性地取正切恰為2次冪的角度做旋轉如式（10）所示，這樣xi、yi迭代時所做的乘法就可以轉化為移位操作[11]。

根據小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的濃度。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析,數據以“均數±標準差”表示,使用One-way ANOVA對結果進行分析,對照組和實驗組之間*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);LPS組與實驗組之間“#”表示差異顯著(P<0.05),“##”表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 金蕎麥總黃酮的提取及鑒定

金蕎麥提取得到的總黃酮含量為51.646 3 mg/g,提取率高達5.16%。經超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜鑒定得63種黃酮成分。超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜正離子模式共檢測出48種黃酮成分,分別是蘆丁、原花青素B2、表兒茶素、原兒茶醛、柚皮苷查爾酮、柚皮素、兒茶素、異甘草素、二氫槲皮素/紫杉葉素、草酚、木犀草素、異槲皮苷、葛根素、山奈酚、異鼠李素、川橙皮素、芒柄花苷、喬松素、桔皮素、芹菜素、甜橙黃酮、芹菜素-7-葡萄甙、紫云英苷、地奧司明、芫花素、異葒草素、染料木素、根皮素、野漆樹苷、黃豆黃素、羥基芫花素、穗花杉雙黃酮、葒草苷、大豆苷、淫羊藿苷、牡荊素、楊芽黃素、黃芩苷、白楊素、銀椴苷、異櫻花亭、夏佛塔苷、金松雙黃酮、射干苷元、表沒食子兒茶素、光甘草定、牡荊素鼠李糖苷、(+)-沒食子兒茶素。超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜負離子模式共檢測出15種黃酮成分,分別是表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、槲皮苷、落新婦苷、斯皮諾素、甘草苷、蕓香柚皮苷、黃杞苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、新橙皮苷、圣草次苷、扁蓄苷、沒食子兒茶素沒食子酸酯、枸橘苷。

2.2 金蕎麥總黃酮對LPS誘導RAW 264.7細胞損傷的影響

2.2.1 RAW 264.7細胞炎癥模型的建立

由于LPS暴露的RAW 264.7巨噬細胞表現出顯著的細胞活力下降是評估細胞氧化和炎癥損傷的常用模型[12]。為了篩選LPS建立RAW 264.7細胞炎癥及氧化應激模型的最適作用濃度,選擇0、5、10、20、40 μg/mL的LPS處理RAW 264.7細胞12 h。如圖1結果表明,LPS濃度低于10 μg/mL時,RAW 264.7的細胞活力與對照組相比沒有統計學差異,但在20、40 μg/mL LPS存在下,RAW 264.7的細胞活力顯著降低(P<0.01)。因此,選擇20 μg/mL LPS為建立RAW 264.7細胞炎癥模型的染毒濃度。

圖1 LPS誘導的細胞炎癥對RAW 264.7細胞活力的影響

2.2.2 金蕎麥總黃酮對RAW 264.7細胞活力的影響

將不同濃度0、25、50、100、200 μg/mL及不同時間9、12、24 h的金蕎麥總黃酮作用于RAW 264.7細胞。結果發現,隨著各處理組藥物濃度的增加,不同處理時間下RAW 264.7細胞的存活率逐漸降低。金蕎麥總黃酮濃度為0、25、50 μg/mL作用細胞9、12、24 h后,細胞活力與對照組均無統計學差異(P>0.05)。金蕎麥總黃酮處理RAW 264.7細胞9 h時,細胞存活率較12、24 h明顯升高,不同濃度下的細胞活力分別為108.66%、104.82%、88.15%、67.87%(圖2-a、圖2-b、圖2-c)。這表明,金蕎麥總黃酮處理24 h內的最大安全濃度為50 μg/mL,在此劑量內金蕎麥總黃酮的藥理活性不受細胞活力的影響(圖2-d)。

a-金蕎麥總黃酮處理9h對RAW 264.7細胞活力的影響;b-金蕎麥總黃酮處理12 h對RAW 264.7細胞活力的影響;c-金蕎麥總黃酮處理24 h對RAW 264.7細胞活力的影響;d-金蕎麥總黃酮對RAW 264.7細胞活力的劑量和時間依賴性影響

LPS干預使RAW 264.7的細胞存活率顯著降低,LDH含量明顯增加;而金蕎麥總黃酮有效逆轉LPS對RAW 264.7細胞活力的抑制以及LDH的釋放。這種趨勢在金蕎麥總黃酮濃度為0～30 μg/mL時呈現劑量依賴性升高,在40 μg/mL時顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,30 μg/mL金蕎麥總黃酮預保護后的細胞活力和LDH釋放量無統計學差異(P>0.05,圖3-a和圖3-b)。綜合以上考慮,最終確定金蕎麥總黃酮預保護LPS誘導的RAW 264.7細胞的時間為9 h,濃度梯度為10、20、30 μg/mL。

a-金蕎麥總黃酮對LPS誘導RAW 264.7細胞活力的影響;b-金蕎麥總黃酮對LPS誘導RAW 264.7細胞LDH含量的影響

2.2.4 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥因子表達的影響

如圖4所示,LPS刺激可顯著增加巨噬細胞M1極化分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18(P<0.01),而金蕎麥總黃酮可有效降低LPS給藥的RAW 264.7細胞中促炎M1介質TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表達,顯著逆轉了LPS刺激的作用(P<0.05)。以上結果表明,金蕎麥總黃酮可通過抑制巨噬細胞M1極化,從而降低細胞中炎性因子的含量減輕LPS誘導RAW 264.7細胞的炎癥反應。

a-IL-6含量;b-IL-18含量;c-IL-1β含量;d-TNF-α含量

2.2.5 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的RAW 264.7細胞氧化應激的影響

如圖5所示,與對照組相比,LPS可導致RAW 264.7細胞總ROS產生以及MDA含量明顯升高(P<0.05),而GSH、SOD、CAT的表達水平顯著降低(P<0.05)。經過金蕎麥總黃酮干預后,巨噬細胞產生總ROS和MDA水平呈劑量依賴性降低,LPS誘導的GSH、SOD、CAT的表達逆轉(圖4-a、圖4-b、圖4-c、圖4-d和圖4-e)。以上結果表明,金蕎麥總黃酮能有效上調RAW 264.7細胞中GSH與SOD和CAT的表達(P<0.01),清除RAW 264.7細胞內過量的ROS(P<0.01),進而減少由ROS積累誘發多不飽和脂肪酸過氧化產生的MDA。

a-ROS水平(×200);b-MDA含量;c-GSH水平;d-SOD活力;e-CAT活力

2.2.6 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的RAW 264.7細胞凋亡的影響

如圖6所示,LPS組的Hoechst 33342和PI陽性率較對照組顯著升高,表明RAW 264.7細胞質膜的完整性嚴重受損(圖6-b)。與LPS組相比,金蕎麥總黃酮可有效降低LPS誘導的RAW 264.7細胞Hoechst 33342和PI陽性率,且隨著金蕎麥給藥劑量的升高,活細胞染色的陽性率逐漸降低(圖6-c、圖6-d和圖6-e)。這表明,金蕎麥總黃酮可有效對抗LPS干預誘發的RAW 264.7細胞凋亡。

a-對照組;b-LPS組;c-10 μg/mL金蕎麥總黃酮組;d-20 μg/mL金蕎麥總黃酮組;e-30 μg/mL金蕎麥總黃酮組

2.3 金蕎麥總黃酮對LPS誘導小鼠急性肺損傷的影響

2.3.1 LPS構建小鼠急性肺損傷模型

小鼠肺組織觀察大體表現為對照組小鼠肺組織外觀正常,肺葉輪廓清晰,質軟且富有彈性,表面未見明顯出血點;LPS組小鼠肺組織塌陷,表面可見條狀性出血及彌漫性出血;金蕎麥總黃酮處理組可明顯減輕LPS滴鼻造成的肺組織肺充血及結構損傷程度,且呈現劑量依賴性(圖7-a)。HE染色結果表明(圖7-b),對照組小鼠肺泡結構完整,肺泡壁薄,肺泡腔內少見紅細胞和炎性浸潤;LPS滴鼻引起小鼠肺泡塌陷結構紊亂,肺泡間隔增厚,肺泡間質和肺泡腔內可見大量紅細胞及明顯炎性細胞浸潤,而金蕎麥總黃酮可明顯減輕肺組織充血及炎性滲出,且呈劑量依賴性。根據美國胸科協會2010年推出的實驗性ALI的標準判斷,LPS構建小鼠急性肺損傷模型成功。

a-肺組織大體觀察;b-肺組織HE染色(×400)

圖8 金蕎麥總黃酮對LPS誘導急性肺損傷小鼠血清中炎性因子的影響

2.3.2 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織濕干重比(W/D)的影響

肺濕干重比(W/D)用于評估肺水腫的程度。如表1所示,與對照組相比,LPS組的肺干濕重量比顯著升高(P<0.05),用金蕎麥總黃酮(25、50和100 mg/kg) 可有效緩解小鼠肺組織的水腫程度,且W/D以劑量依賴性方式顯著降低。這表明,金蕎麥總黃酮可有效緩解LPS干預誘發的小鼠肺組織水腫。

表1 金蕎麥總黃酮對小鼠肺組織濕干重比(W/D)的影響

2.3.3 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的急性肺損傷小鼠血清中炎性因子的影響

如圖7所示,LPS滴鼻給藥可顯著增加小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(P<0.01),而金蕎麥總黃酮可有效降低LPS刺激引起的小鼠血清中促炎介質TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.01),顯著逆轉了LPS干預的作用。結果表明,金蕎麥總黃酮可通過減少小鼠血中炎性因子的分泌減輕LPS誘導小鼠肺組織炎癥反應。

2.3.4 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的急性肺損傷小鼠血清中氧化應激標志物的影響

如表2所示,與對照組相比,LPS可導致小鼠血清中H2O2和MDA含量明顯升高,而CAT的活性顯著降低(P<0.01)。經過金蕎麥總黃酮干預后,小鼠血清中產生H2O2和MDA水平呈劑量依賴性降低CAT活力水平呈現逆轉(P<0.01)。以上結果表明,金蕎麥總黃酮能有效上調小鼠血清中抗氧化酶CAT的表達,減少由活性氧積累產生的MDA和H2O2,從而減輕LPS干預誘發的小鼠肺組織氧化應激反應。

表2 金蕎麥總黃酮對LPS誘導的急性肺損傷小鼠血清中氧化應激標志物的影響

2.4 討論

急性肺損傷是臨床上常見的危重癥之一,主要發病機制為肺部或全身不可控的炎癥,可發生于動物生長的各個階段,患病率和死亡率居高不下[13]。巨噬細胞是急性肺損傷發病機制中的關鍵協調者,是抵御空氣傳播顆粒和微生物的第一道防線,其功能傳統上被認定為“M1經典活化巨噬細胞(CAM)”與“M2替代活化巨噬細胞(AAM)”,M1巨噬細胞的特征是分泌促炎因子,如IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等促進自身免疫性疾病[14-15]。異常的巨噬細胞極化是氧化應激和炎癥反應之間的中心聯系,能引起微環境中的ROS與DNA、脂質(包括磷脂)以及抗氧化系統的分子相互作用,破壞氧化還原平衡,導致免疫系統對功能程序、分泌產物和周圍組織微環境的錯誤調節[16]。研究表明,多形核中性粒細胞的外泌體miR-30 d-5p靜脈注射可顯著降低盲腸結扎和穿刺(CLP)誘導的ALI小鼠肺中M1巨噬細胞活化和巨噬細胞死亡[17];宣肺白湯通過下調LPS誘導的急性肺損傷小鼠中促炎細胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β的表達以及巨噬細胞和中性粒細胞浸潤來改善肺損傷[18]。因此,調節巨噬細胞的異常極化可能是改善急性肺損傷的重要途徑。

由多種致病性病原菌經攝食進入人體內引起以炎癥為主的急性肺損傷,已成為危害人類健康安全的世界性難題。大量研究表明,革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖滴鼻或氣管滴注可有效增加ROS的產生以及炎癥因子的釋放,可有效模擬急性肺損傷的發病過程[19-20]。因此,本研究利用LPS建立RAW 264.7細胞損傷模型和小鼠急性肺損傷模型,結果表明,20 μg/mL LPS處理RAW 264.7細胞,可誘導RAW 264.7向M1狀態極化分泌IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等促炎細胞因子,產生ROS,誘發氧化應激和炎癥反應,炎性因子的大量釋放進一步加劇了活性氧的累積,細胞質膜完整性受損,將LDH迅速釋放至細胞外,導致細胞大量死亡;昆明小鼠以1 mg/kg LPS滴鼻給藥,可誘導小鼠肺組織濕干重比升高呈現肺水腫,大量釋放促炎細胞因子和氧化應激產物,降低抗氧化酶的活性。這提示,LPS成功建立小鼠體內外急性肺損傷模型。

金蕎麥是我國首先發掘的一種新型抗感染藥物,能安全及有效地提升呼吸系統健康,具有多種有益機體健康的藥理活性,其中黃酮類成分具有極高的抗炎與抗氧化能力[21-27]。據報道,黃酮類成分可通過降低M1巨噬細胞比例和增加M2巨噬細胞比例來發揮抗炎作用[28-29]。研究表明,表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯調節巨噬細胞向M2狀態極化,降低LPS給藥的肺微環境中促炎M1介質iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達,減輕了8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、硝基酪氨酸的表達,表明其抗炎和抑制氧化損傷的能力[30];鳶尾黃酮可抑制LPS誘導的內皮細胞損傷和M1極化,減少腎組織中巨噬細胞浸潤和M1極化來抑制腎臟炎癥[31]。以上研究表明,抑制巨噬細胞的M1極化可有效調節炎癥損傷。因此,我們推測金蕎麥黃酮可作為一種綠色保健食品預防人類和動物急性肺損傷的發生。本實驗發現,金蕎麥總黃酮能通過上調RAW 264.7細胞和小鼠血清中抗氧化酶的活力,提高抗氧化基因的表達,進而清除LPS積累的ROS和H2O2,減少ROS氧化多不飽和脂肪酸產生的MDA,繼而減輕小鼠肺組織和RAW 264.7細胞氧化應激損傷。金蕎麥總黃酮還可有效抑制RAW 264.7細胞M1極化,從而減少小鼠血清和細胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等的過度分泌;通過抵御LPS對RAW 264.7細胞質膜完整性的破壞,減少LDH以及促炎因子釋放至胞外。這表明,金蕎麥總黃酮發揮其抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用向巨噬細胞M1狀態極化、保護細胞質膜的完整性從而緩解LPS誘導的小鼠急性肺損傷。

3 結論

本研究采用LPS構建小鼠急性肺損傷及RAW 264.7細胞損傷模型,通過觀察氧化生物標志物、炎性因子指標的變化及細胞凋亡率,探討金蕎麥總黃酮對LPS誘導小鼠急性肺損傷的影響。研究發現,金蕎麥總黃酮能有效升高LPS誘導的抗氧化酶SOD和CAT的活力,提高抗氧化基因GSH的表達,進而清除積累的ROS、MDA和H2O2抵御氧化損傷;金蕎麥總黃酮能明顯抑制巨噬細胞向M1極化,減少促炎介質的分泌,從而減輕炎癥損傷;金蕎麥總黃酮通過保障細胞活力、減少LDH的釋放并保護細胞膜的完整性,從而抑制細胞凋亡;金蕎麥總黃酮通過降低小鼠肺干濕比重從而緩解肺組織水腫。綜上表明,金蕎麥總黃酮具有抗炎、抗氧化及抗凋亡作用,能緩解LPS誘導的小鼠急性肺損傷,為金蕎麥總黃酮作為功能性食品、綠色保健品的開發提供實驗依據和新思路。