金屬離子對Trichoderma longibrachiatum UN32石斛堿型生物堿產量的影響

秦一彤,余娧凡,錢旭,姚云君,金磊磊,陳集雙,2*,虞龍*

1(南京工業大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京,211800)

2(遵義醫科大學,生物資源健康利用研究中心,貴州 遵義,563000)

石斛堿型生物堿(dendrobine-type total alkaloids,DTTAs)是藥用植物金釵石斛的特征成分[1],具有降血糖、抗腫瘤、抗白內障等成效[2],結構上屬于倍半萜類生物堿[3]。近年,石斛堿醫學價值不斷提高,金釵石斛產業快速發展,以其制備的中成藥年銷售額已近40億元[4]。由于傳統獲取生物堿的方式具有周期長、技術難以實現或經濟性差的缺點,無法滿足市場日益增長的需求[5]。大量能夠產植物相似活性化合物的內生菌的發現,在天然化合物獲得和生物制藥中表現出巨大潛力[6]。但是內生真菌中產物表達不穩定現象普遍存在[7],為解決這一問題,前體飼喂、誘導子添加等策略被開發用于提高內生菌次生代謝物產量。除此之外,發酵條件和工藝也是提高產量常考慮的重要因素。

傳統上,“單因素(one-factor-at-a-time,OFAT)”是優化發酵參數的常見方法。當涉及多變量時,OFAT易忽略參數間的相互作用,所以部分研究中會采用Plackett-Burman設計、Box-Behnken設計(Box-Behnken design,BBD)[8]和中心組合設計(central composite design,CCD)[9]等統計學方法,結合響應面(response surface methodology,RSM)來說明因變量和自變量之間的聯系[10]。目前,利用RSM方法進行優化已大大增加了內生菌中重要代謝物的產量[11]。例如,通過利用RSM制定的最佳培養基培養青霉屬H1,紫金草皂苷的產量提高到37.16 mg/L[12]。BEN MEFTEH等[13]在使用RSM優化后,Penicilliumbilaiae分離物TDPEF30的蛋白酶產量增加了1 086倍。

TrichodermalongibrachiatumMD33是本課題組首次分離報道的具有產DTTAs能力的內生真菌[14-15]。通過復合誘變后,獲得產量穩定的正突變體T.longibrachiatumUN32,DTTAs產量是出發菌株MD33的2.62 倍[16]。金屬離子會對部分酶活性產生影響,從而影響代謝產物的合成[17],而在優化發酵培養基過程中,發現眾多金屬離子能夠提高DTTAs的產量。本研究在前期基礎上,擬以Cu2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Fe2+、Ca2+和Mg2+共8種金屬離子為對象,通過RSM優化,以DTTAs產量為篩選標準,建立UN32發酵最適金屬離子體系。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

T.longibrachiatumUN32是本試驗所用菌株,是由T.longibrachiatumMD33菌株經紫外和氮離子束復合誘變,獲得穩產DTTAs的正突變株,現保藏于本實驗室。

馬鈴薯,當地永輝超市;葡萄糖、瓊脂、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、溴甲酚綠、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、MnSO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4和KCl均為分析純,國藥試劑。

1.2 儀器與設備

PYX-DHS-49X50-BS恒溫培養箱,Thermo Fisher Scientific;BXM-110VE立式壓力蒸汽滅菌器,博迅醫療生物儀器股份有限公司;BLM-1000超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;GL21M離心機,鹽城凱特實驗儀器有限公司;Spectrum lab 752S紫外分光光度計,Grant公司;GZX-9070 MBE電熱鼓風管干燥箱,上海博訊實業有限公司;QQ-201離心管振蕩器,上海啟前電子科技有限公司;ZQZY-BG振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司。

1.3 培養基、無機鹽溶液及生物堿檢測相關溶液

a)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,121 ℃高壓滅菌20 min后備用。馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養基無瓊脂加入。

b)無機鹽溶液母液:使用蒸餾水配制濃度為0.1 mol/L的CuSO4、ZnSO4、CoCl2、CaCl2、MnSO4、MgSO4、FeSO4、KCl溶液,使用0.22 μm濾頭過濾除菌。

c)生物堿檢測相關溶液:

鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液:分別配制0.2 mol/L的鄰苯二甲酸氫鉀與氫氧化鈉溶液,使用氫氧化鈉溶液調節鄰苯二甲酸氫鉀溶液pH值至4.55。

0.4 g/L溴甲酚綠酸性染料:取0.04 g溴甲酚綠粉末,用100 mL鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液溶解。

堿性乙醇溶液:以無水乙醇為溶劑配制0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌絲培養及收集

無菌條件下,使用打孔器于活化平板外圍挑取直徑為1 cm的菌餅,接入裝液量為100 mL PDB液體培養基的250 mL錐形瓶中,在120 r/min,28 ℃恒溫搖床中振蕩培養10 d。

發酵液中的菌體通過抽濾收集,于45 ℃鼓風干燥箱內干燥至恒重,分析天平稱重獲得菌體干重。

1.4.2 生物堿提取及檢測

對傳統生物堿提取方法[18]進行步驟改進,將烘干后的菌絲研磨成粉末,稱取0.3 g放入試管內,加入30 mL的2%鹽酸水溶液進行提取,超聲破碎10 min,浸提過夜;取10 mL上清液,加入氨水調節pH值至10,加入10 mL二氯甲烷振蕩后進行萃取,取下層進行生物堿含量檢測。采用“鄰苯二甲酸氫鉀-溴甲酚綠”比色法[19]進行生物堿測定。

1.4.3 生物堿標準曲線測定

配制100 μg/mL的標準品溶液,用二氯甲烷稀釋到質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、10、15 μg/mL,然后各取不同濃度對照品溶液5 mL加入3 mL緩沖液和2 mL溴甲酚綠酸性染料,振蕩后靜置30 min,取下層2.5 mL,加入0.5 mL堿性乙醇溶液,以二氯甲烷作為空白對照,在620 nm波長處測定吸光度作為縱坐標,以標準品溶液濃度作為橫坐標進行線性擬合,得到線性回歸方程。

1.4.4 OFAT

分別在培養基中加入不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)的無機鹽溶液,初步探究不同金屬離子對生物堿產量的影響。

1.5 響應面設計優化產生物堿培養基

1.5.1 Plackett-Burman試驗設計

根據單因素試驗結果,確定Cu2+、Mg2+、Mn2+、K+、Fe2+、Zn2+、Na+和Ca2+8種離子的高(1)低(-1)水平,使用軟件Design expert 10.0進行Plackett-Burman設計(表1)。每組試驗重復3次,最終結果取平均值。根據PB試驗結果擬合出方程如公式(1)所示:

表1 Plackett-Burman設計因素水平

Y=α0+∑αiXi

(1)

式中:Y,響應結果生物堿量;α0、αi,常系數;Xi,試驗探究的因素。

1.5.2 金屬離子最佳添加時間

金屬離子加入的時間也是影響代謝物合成的原因之一[20]。由Plackett-Burman試驗結果篩選出了對生物堿產量影響最大的3種金屬離子,分別在發酵第0、3、6、9天加入不同濃度的離子,進一步優化加入濃度和時間。

1.5.3 Box-Behnken響應面設計

結合Plackett-Burman試驗與最佳加入時間實驗結果,得到貢獻值最大的3種因素的最優濃度范圍,確定每種因素的3個水平(-1、0、1)如表2所示,使用Design expert 10.0設計BBD試驗,按照設計每組試驗進行3次重復,結果求取平均值。

表2 Box-Behnken設計中各因素的變量水平

將BBD試驗得到的結果進行擬合,得到的回歸方程如公式(2)所示:

(2)

式中:Y,預測的響應值;Xi和Xj,各獨立因素;α0,此模型的截距;αi,線性系數;αii,二次系數;αij,交互作用系數。

2 結果與分析

2.1 生物堿標準曲線

以石斛堿標準品濃度作為橫坐標,620 nm處測得的吸光度值為縱坐標進行標準曲線的擬合后,結果得回歸方程y=0.100 9x+0.095 6(R2=0.998 0),因為相關系數R2>0.99,說明線性關系良好,可用于后續實驗。

2.2 單因素試驗結果

各金屬離子對生物堿產量的影響如圖1所示,當Cu2+、Mn2+和Fe2+濃度為0.5 mmol/L時,Zn2+、Na+和Ca2+濃度為1.5 mmol/L時,Mg2+和K+濃度為2.0 mmol/L時,生物堿的產量最高。將此單因素試驗的結果作為Plackett-Burman試驗中各因素的中心水平設計試驗,用于后續研究。

a-Cu2+;b-Mg2+;c-Mn2+;d-K+;e-Fe2+;f-Zn2+;g-Na+;h-Ca2+

2.3 Plackett-Burman試驗結果

根據設計的組合進行Plackett-Burman試驗,試驗結果見表3,使用軟件對結果數據進行分析處理,挑選出了3種貢獻度最大的因素:Cu2+、Fe2+和Zn2+進行顯著性分析和方差分析,結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 Plackett-Burman試驗顯著性分析及方差分析

在設計的高低水平范圍中,這幾種因素對響應結果影響值的大小順序為Zn2+>Fe2+>Cu2+>Mn2+>Na+>Mg2+>K+>Ca2+,除Ca2+對響應結果生物堿量為正效應外,其他因素對結果影響都為負效應。各因素中Zn2+貢獻度最大,占比有47.84%。由上可知影響UN32生物堿產量最重要的3個因素為Zn2+、Fe2+和Cu2+,對這3個因素與響應結果進行擬合,得到回歸方程如公式(3)所示:

生物堿量=279.49-38.08×A-44.03×E-42.02×F

(3)

式中:A,Cu2;E,Fe2+;F,Zn2+。

各因素方差分析結果顯示(表4),本次Plackett-Burman試驗整體模型P值為0.000 1,說明該模型是極顯著的,可以用于后續數據分析,同時由貢獻值篩選出的這3種因素的P值分別為0.003 3、0.001 4、0.000 1,均小于0.05,說明這3種因素對于本模型都是顯著的,可以有效促進UN32生產生物堿,所以選擇這3種因素進行后續的分析。

2.4 金屬離子添加濃度和時間優化

金屬離子的添加時間是影響真菌代謝的關鍵因素。上述Plackett-Burman實驗中雖發現Cu2+、Fe2+和Zn2+能提高DTTAs產量,對結果的影響呈現負效應,這可能和他們的濃度和添加時間不適相關。因此,對他們的添加濃度和時間進行優化。結果(圖2)表明,Cu2+的最佳添加濃度和時間為0.5 mmol/L(第6天添加),生物堿量達到(304.77±12.51) μg;Fe2+的最佳添加濃度和時間為0.4 mmol/L(第6天添加),生物堿量為(275.32±13.15) μg;Zn2+的最佳添加濃度和時間為0.7 mmol/L(第3天添加),生物堿量為(285.16±13.26) μg。

a-Cu2+(A～G代表培養基中Cu2+的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L);b-Fe2+(A～G代表培養基中Fe2+的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L);c-Zn2+(A～G代表培養基中Zn2+的濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mmol/L)

2.5 Box-Behnken試驗結果

根據前期試驗結果,確定這3種因素的低(-1)和高(1)水平,使用Design expert 10.0設計BBD試驗,共進行17組試驗,測定的結果如表5所示,能夠看出,每組試驗的實際結果與預測的結果是接近的,說明結果可信度較高。

表5 BBD實驗設計矩陣及響應預測結果

對模型進行方差分析,由模型擬合得到的回歸方程如公式(4)所示:

生物堿量=-197.39+1 033.40×A+337.53×B+545.74×C-153.47×AB-95.07×AC+295.83×BC-826.00×A2-268.26×B2-881.85×C2

(4)

式中:A,Cu2+;B,Zn2+;C,Fe2+。

模型方程的決定系數R2為0.983 6,接近于1,說明此模型的擬合度高,并且預測結果與實際結果之間的相關性好;變異系數為2.40,是指此模型中的數據僅有2.40%與實際的結果不符合;同時AdjR2=0.962 5,PredR2=0.851 1,兩者差值小于0.2,信噪比Adeq Precision=17.520>4,這些數值能夠表示此模型受到外界因素的干擾較小。

由模型的方差分析結果(表6)可知,此模型的P值<0.000 1,說明是極顯著的,能夠準確預測響應結果,其他項數值如A、AB、BC、A2、B2、C2的方差檢驗P值均小于0.05,說明這些參數都是顯著的。失態項指的是回歸模型得到的預測數值與進行的試驗實際結果不相符合的概率,而由分析結果可知本實驗擬合的模型失態項P值為0.354 8>0.05,說明是不顯著的,表示此模型能夠準確預測結果。

表6 Box-Behnken Design試驗擬合模型的方差分析

2.6 響應面二維等高線圖與三維曲面圖分析

使用軟件Design expert 10.0在進行響應面分析時,能夠生成兩兩因素與響應結果間的等高線圖,其所呈現出來的形狀可以一定程度表達出這2個因素之間是否存在著交互關系,若二維圖呈圓形則表示關系不顯著,橢圓形則表示關系顯著。本試驗結果擬合的模型繪制出的響應圖如圖3所示。

a、b-Cu2+和Zn2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖;c、d-Cu2+和Fe2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖;e、f-Zn2+和Fe2+對生物堿量交互影響的二維等高線圖和三維曲面圖

圖3-a展示了生物堿量隨Cu2+和Zn2+濃度變化的二維和三維響應面圖,二者交互關系繪制的圖是橢圓形,證明其相互作用對響應結果生物堿量產生的作用效果顯著。圖3-b表示當ZnSO4濃度保持在0.7 mmol/L時,Cu2+和Fe2+濃度與生物堿產量變化的響應面圖。Zn2+與Fe2+相互作用的響應面圖如圖3-c所示,能夠看出二者交互關系繪制的圖為橢圓形,表示其相互作用對響應結果生物堿量產生的作用效果也是顯著的。各圖中不同因素對生物堿產量的影響相似,在本模型所選擇的取值范圍內,生物堿產量先隨著兩種因素濃度的增加而增加,當響應結果達到最大值后,隨著2種因素濃度的增加而減少。

2.7 驗證試驗

對此模型結果擬合出的回歸方程求解,能夠得到當預測響應結果生物堿產量達到最大時,這幾種因素的濃度取值為:Cu2+0.54 mmol/L,Zn2+0.69 mmol/L,Fe2+0.39 mmol/L。分別使用優化后的培養基與基礎發酵培養基對UN32進行液體發酵及平板培養,對菌絲的生物堿產量進行對比。優化后的培養基配方為:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,CuCl20.54 mmol/L,ZnSO40.69 mmol/L,FeSO40.39 mmol/L。

優化后的培養基中發酵UN32,生產的生物堿量為(317.36±6.48) μg,達到了模型預測值(309.33 μg)的102.60%,與預測結果基本一致,比起基礎發酵培養的結果[(183.78±7.54) μg],產量提高了72.68%。

3 結論

本試驗對真菌發酵培養基所需營養物質無機鹽進行優化探究,首先研究了金屬離子對UN32產石斛堿的作用。基于單因素試驗結果,進行Plackett-Burman試驗,發現Zn2+、Cu2+和Fe2+3種金屬離子在適當濃度下對石斛堿的生成具有最顯著的影響作用。對它們的添加時間和濃度進行進一步研究,發現各離子的最優添加濃度和時間分別為Cu2+0.5 mmol/L(第6天),Fe2+0.4 mmol/L(第6天),Zn2+0.7 mmol/L(第3天)。隨后基于BBD和RSM的統計方法,進一步優化Zn2+、Cu2+和Fe2+在石斛堿生產中的相互作用,最終得到當響應結果生物堿量達到最大值,3種離子的濃度分別為Cu2+0.54 mmol/L,Zn2+0.69 mmol/L,Fe2+0.39 mmol/L,優化后的培養基培養UN32的生物堿產量,實驗值與預測值之間無顯著差異,說明模型擬合程度較高,可以指導內生真菌UN32在液體培養過程中產生石斛堿。試驗結果顯示,添加金屬離子在液體發酵培養UN32產生石斛堿,是未來石斛堿進行大規模工廠生產的有效策略。由于本工作只著重研究了金屬離子對石斛堿生產促進作用的組合效應,因此在今后的工作中可以考慮在發酵培養中的碳源,氮源,前體物質等的優化。當然除了發酵培養基的優化外,還可以從UN32的發酵條件如溫度、接種量、轉速等方面使用響應面法進行優化,或者通過基因編輯等手段進一步提高生物堿產量。