實時熒光環介導等溫擴增快速分型致瀉大腸埃希氏菌方法的建立

李芮,黃艷梅,童曉鈺,山珊,,劉成偉,譚俁宬,陳芳,劉道峰*

1(南昌大學 公共衛生學院,江西省預防醫學重點實驗室,江西 南昌,330019)

2(江西省疾病預防控制中心,江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室,青年科研創新攻關團隊,江西 南昌,330029)

3(江西業力醫療器械有限公司,江西 南昌,330008)

4(江西師范大學 生命科學學院,國家淡水魚加工技術研發專業中心,江西 南昌,330022)

致瀉大腸埃希氏菌(diarrheagenicEscherichiacoli,DEC)是全球范圍內引起腹瀉的重要食源性致病菌,對食品安全、人類健康和社會經濟造成了嚴重的影響[1]。常見的引起人類發病的DEC有5種,包括腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)、產腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)、產志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)或稱為腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)與腸道聚集性大腸埃希氏菌(enteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)[2]。DEC感染后,不僅會導致人腹瀉,還會引起惡心、發熱及溶血性尿毒綜合征等癥狀,甚至導致死亡[3-6]。DEC在自然界分布廣泛,極易污染食品,GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》規定在牛肉制品、即食生肉制品、發酵肉制品及去皮或預切的水果與蔬菜食品中5份25 g樣本中均不可檢出。但DEC型別多樣,檢測上易與無害的普通大腸埃希氏菌混淆[7]。因此,建立適用現場、快速且同時能實現DEC檢測與分型的方法對快速確定DEC污染來源、保障食品安全具有重要意義。

近年來,隨著對DEC致病機制的深入研究和分子生物技術的不斷發展,DEC的檢測已經由分子分型檢測法代替了傳統免疫分型檢測法[8]。目前常用的分型DEC方法,如國標法GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》采用PCR擴增待檢菌攜帶的不同目標基因,結合瓊脂糖電泳方法來鑒定其具體型別,但此方法操作繁瑣,工作量巨大。多重核酸擴增通過向同一反應體系中加入多對引物可實現同時對多個目標基因的檢測,如胡安妥等[9]和袁慕云等[10]構建的多重熒光PCR方法,可以節約時間并有效判定樣本中大腸埃希氏菌的致病型,但也需依賴專業的場所及昂貴的儀器設備。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在2000年被日本學者NOTOMI等[11]首次提出,是一種不依賴專業設備、適用于現場和基層的核酸擴增方法。該方法利用具有高鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和4～6條特異性引物識別目標DNA上6個區域來進行擴增,在短時間(15～60 min)、恒溫條件下可將有限的初始DNA拷貝數實現109～1010倍的擴增。LAMP目前已在食品安全[12-13]、臨床診斷[14]與法醫鑒定[15]等方面得到了廣泛應用。

本研究針對DEC的8段特征毒力基因pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV、invE及大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA設計LAMP引物,構建實時熒光LAMP方法,實現對DEC的快速檢測及分型。該方法簡化了操作步驟,降低了設備門檻,提高了分型速度,為DEC的檢測及防控提供了重要技術支持,有利于保障食品安全,促進公眾健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株信息

菌株及編號見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036329),由江西省疾病預防控制中心提供。

表1 實時熒光LAMP方法與國標法各特征基因檢出限

1.1.2 試劑

營養瓊脂(nutrient agar,NA)、營養肉湯(nutrient broth,NB),青島高科技工業園海博生物技術有限公司;10×LAMP緩沖溶液、Bst DNA聚合酶(Bst Ⅱ DNA Polymerase),翌圣生物科技(上海)股份有限公司;dNTP Mix,南京諾唯贊生物科技有限公司;SYBR Green Ⅰ,北京金博益生物科技有限公司;引物(HPLC級),上海生工生物有限公司。

1.1.3 儀器與設備

QT-1旋渦混合器,中國上海琪特分析儀器有限公司;QuantStudio 12K熒光擴增平臺,美國ABI公司;Synergy超純水系統,德國Merck Millipore公司;ZWYR-4912恒溫振蕩培養箱,中國上海智城分析儀器制造有限公司;1-16K冷凍離心機,德國Sigma Laborzentrifugen公司;LTI-1200 W生化培養箱,日本東京理化公司;AC2-6S1生物安全柜,新加坡ESCO公司;QIAxcel Advanced全自動實時毛細管電泳儀,德國QIAGEN公司;K5500Plus超微量分光光度計,中國北京凱奧科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測目標基因的選擇及引物設計

DEC根據其致病機制、血清學及毒力因子等特征主要被分為5種類型,分別為EAEC、ETEC、EPEC、STEC和EIEC。其中,escV為EPEC特征性毒力基因;stx1與stx2為STEC特征性毒力基因;invE為EIEC特征性毒力基因,aggR與pic為EAEC特征性毒力基因。熱穩定性腸毒素基因(st)[16]和lt為ETEC特征性毒力基因。此外,uidA為大腸埃希氏菌屬特異性基因,所以研究根據上述9段基因序列設計LAMP引物。

根據NCBI數據庫中公布的pic(登錄號:AF097644.1)、aggR(登錄號:Z18751)、lt(登錄號:EU113250)、st(登錄號:AJ868113.1)、stx1(登錄號:AE005174.2)、stx2(登錄號:AE005174.2)、escV(登錄號:FM180568.1)、invE(登錄號:AF283289.1)及uidA(登錄號:S69414.1)的基因序列,利用Primer Explorer V5軟件進行引物設計,引物序列見附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036329)。

表2 實時熒光LAMP的特異性評價

1.2.2 細菌培養和DNA提取

菌株接種于10 mL NB培養基中,37 ℃振蕩(160 r/min)活化培養12 h后,菌液劃線于NA培養基平板,置于37 ℃培養12 h,再挑取單菌落接種于10 mL NB培養基,37 ℃振蕩(160 r/min)培養12 h。采用煮沸法提取菌株DNA,步驟如下:取1 mL液體培養基,置于冷凍離心機中離心5 min(4 ℃,9 000 r/min),棄上清液。然后用1 mL超純水清洗菌體沉淀,在4 ℃條件下離心5 min(9 000 r/min),棄上清液。再向離心管中加入200 μL超純水復溶,在100 ℃的恒溫金屬浴鍋中煮沸裂解10 min后,迅速冰浴5 min,離心5 min(4 ℃,9 000 r/min),保留上清液,作為DNA粗提物,用超微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.2.3 LAMP引物的驗證及反應體系的優化

LAMP基礎反應體系為:10×LAMP緩沖溶液(含80 mmol/L MgSO4)2.5 μL;dNTP Mix(10 mmol/L)3.5 μL;內引物(FIP/BIP,40 μmol/L)1 μL;外引物(F3/B3,5 μmol/L)1 μL;環引物(LF/LB,10 μmol/L)1 μL;Bst DNA聚合酶(8 U/μL)1 μL;SYBR Green I(10×)1 μL及DNA模板(10 ng/μL)1 μL,按順序依次添加,最后超純水補齊至25 μL。將配制后的LAMP體系置于65 ℃加熱1 h,利用毛細管電泳儀分析擴增產物,對引物的擴增能力進行驗證。

在基礎反應體系的基礎上對部分條件進行優化:SYBR Green I(10×)添加量為0.5、1、1.5、2.5 μL;環引物(LF/LB,10 μmol/L)添加量為0、0.5、1、2 μL;Bst DNA聚合酶(2、4、6、8 U/μL)1 μL;根據優化的結果確定各特征基因的最優反應體系。

1.2.4 實時熒光LAMP分型DEC方法的建立

以1 μL 10 ng/μL的EAEC、ETEC、EPEC、STEC、EIEC及普通大腸埃希氏菌標準菌株的DNA為陽性模板,分別加入對應的優化好的LAMP反應體系,通過熒光擴增曲線判斷該方法是否能實現對5種DEC及普通大腸埃希氏菌的快速分型。

1.2.5 實時熒光LAMP方法檢出限的評價及與國標方法的對比

將標準菌株粗提取得到的DNA模板質量濃度調整為:100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL與10 pg/μL,用上述DNA對本方法的檢出限進行評價,通過熒光擴增曲線判斷各特征基因的檢出限。同時,用國標法GB 4789.6—2016中的PCR擴增結合電泳法進行對比,以比較2種方法在檢出限上的差異。

1.2.6 實時熒光LAMP方法的特異性評價

采用12株非大腸埃希氏菌標準菌株,評價該方法特異性(排他性)。包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌、產氣腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、創傷弧菌、表皮葡萄球菌及小腸結腸炎耶爾森氏菌。

1.2.7 實際菌株的驗證

采用從食源性疾病患者糞便樣本中分離出的23株臨床株對本研究構建的實時熒光LAMP方法進行驗證。分離株包括:5株EAEC、5株ETEC、5株EPEC、5株STEC、1株EIEC及2株普通大腸埃希氏菌。與實際結果對比,評價本方法對DEC的檢出靈敏度(包容性)及分型DEC的準確性。

2 結果與分析

2.1 LAMP引物擴增能力的驗證

利用設計好的LAMP引物,構建LAMP反應體系。分別以EAEC、ETEC、STEC、EPEC和EIEC為陽性模板,超純水作為陰性對照,對pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV、invE以及uidA的LAMP引物擴增能力進行驗證。利用毛細管電泳儀對每組基因的LAMP擴增產物進行檢測。結果如圖1所示,添加了對應目標菌DNA的陽性組(+)其擴增產物都顯示出了彌散性的梯狀條帶,每種基因的陰性組(-)均未見條帶產生,結果表明,本文設計的LAMP引物具有良好的擴增能力,且特異性強。

圖1 不同基因LAMP擴增產物毛細管電泳圖

2.2 SYBR Green Ⅰ添加量的優化及反應時間的確定

以大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA為待檢基因,在LAMP反應體系中調整SYBR Green Ⅰ的添加量,陽性(+)以10 ng/μL EAEC為模板,以超純水為陰性(-)對照,利用熒光擴增平臺采集熒光信號。如圖2所示,SYBR Green Ⅰ的添加量越多陽性與陰性峰值差值越大。但是SYBR Green Ⅰ添加量過多會導致擴增速度慢,起峰時間晚。綜上所述,選取SYBR Green Ⅰ(10×)的最優添加量為1.5 μL。反應40 min以后,擴增曲線的熒光值平穩,所以實時熒光LAMP分型DEC的檢出時間設為40 min。

圖2 SYBR Green Ⅰ添加量對實時熒光LAMP的影響

2.3 Bst DNA聚合酶添加量對實時熒光LAMP擴增效率的影響

Bst DNA聚合酶的添加量是影響LAMP擴增效率的關鍵。實驗結果表明(圖3),Bst DNA聚合酶添加量越多擴增速度越快。但是相關研究結果顯示,過量的Bst DNA聚合酶不僅會增加反應成本,還會使引物形成二聚體,降低擴增效率[17]。綜上,確定每段基因實時熒光LAMP體系中Bst DNA聚合酶的最優添加量分別是:pic與escV添加量為2 U,aggR、lt、stx1與stx2添加量為4 U,st與uidA添加量為6 U,invE添加量為8 U。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.4 環引物添加量對實時熒光LAMP擴增效率的影響

圖4表明在LAMP體系中,環引物的添加能大大加快目標基因的擴增速度。不加環引物,pic、lt、escV及uidA基因在40 min內都不能發生擴增。但是,環引物添加量過多可能會造成引物之間的錯配,影響擴增效率,如stx2、invE的陰性組會起峰。綜上,確定每段基因實時熒光LAMP體系中最優的環引物(10 μmol/L)添加量,除uidA添加量為1 μL,其余的pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV與invE添加量均為0.5 μL。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.5 實時熒光LAMP分型DEC結果

利用所建立實時熒光LAMP方法對EAEC、ETEC、STEC、EPEC、EIEC和普通大腸埃希氏菌標準菌株進行檢測,結果如圖5所示,該方法可檢出6株大腸埃希氏菌的菌屬特異性基因uidA。DEC的標準菌株對應的各特征基因均呈現明顯地擴增,標準菌株的基因組也并未造成其余基因擴增管的交叉反應。

A-EAEC;B-ETEC;C-STEC;D-EPEC;E-EIEC;F-普通大腸埃希氏菌

2.6 實時熒光LAMP方法檢出限的確定及與國標方法的比對

以粗提取得到的不同濃度的目標菌DNA評價方法的檢出限。結果如圖6所示,pic和escV的檢出限是1 ng/μL,aggR、stx1、invE和uidA的檢出限是100 pg/μL,lt、st和stx2的檢出限是10 pg/μL。同時,用國標法對相同濃度的DNA模板進行檢測作為對比,結果如表1所示,本研究構建的實時熒光LAMP方法對各特征基因的檢出限均低于國標法。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.7 實時熒光LAMP方法的特異性評價

利用本文構建的方法對12株已知菌型的非大腸埃希氏菌進行檢測,結果如表2所示,9段基因均未被檢出,表明本文所建立的方法對DEC進行檢測和分型時特異性好,不受其他致病菌的干擾,方法特異度為100%(12/12)。

2.8 臨床菌株的驗證結果

利用本文構建的方法對腹瀉患者糞便樣本中分離的23株臨床株進行檢測,結果見表3,所有菌株均可檢出大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA,并可準確檢測出21株DEC的毒力基因進行分型,與實際結果一致,且型間無相互交叉反應,該方法檢出DEC靈敏度為100%(21/21)。

3 結論

研究構建了實時熒光LAMP方法,實現了等溫條件下5種DEC的快速準確分型。不同基因的擴增速率差異是多基因的擴增檢測方法構建過程的難點問題。研究為了實現特定結果判讀時間點(本文為40 min)所有靶基因檢測結果的統一、準確判讀,需保證所有靶基因擴增速率相對一致且均不發生非特異性擴增。研究發現Bst DNA聚合酶和環引物的添加量是影響LAMP擴增效率的關鍵因素,通過合理調整Bst DNA聚合酶的添加量,可保證LAMP擴增效率的同時提高方法的經濟性。環引物的添加對LAMP擴增有明顯的“促進效應”,本研究發現,若不加環引物,pic、lt、escV及uidA在40 min內不能開始擴增。然而,相比“添加與否”,環引物的“添加量”對LAMP擴增速度影響不大,添加量過多還會導致LAMP的非特異性擴增,降低擴增準確度,這些發現與其他研究者研究結果[18-20]一致。此外,研究還發現SYBR Green Ⅰ添加量對LAMP擴增有顯著的影響,SYBR Green Ⅰ添加量過少會導致陰陽性峰值相差較小,過多則會對擴增有抑制作用,導致擴增速度變慢。

綜上,研究根據DEC的pic、aggR、lt、st、escV、stx1、stx2、invE基因及大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA構建了實時熒光LAMP方法,實現了等溫條件下對DEC快速檢測與分型。方法對pic和escV的檢出限是1 ng/μL,對aggR、stx1、invE和uidA的檢出限是100 pg/μL,對lt、st和stx2的檢出限是10 pg/μL,非DEC的標準菌株評價結果表明,方法特異度為100%(12/12),臨床菌株驗證結果顯示,方法對臨床DEC檢出靈敏度為100%(21/21),分型結果也與實際結果完全符合。本方法簡便、經濟、高效,對設備要求低,能將檢測時間縮短至40 min內,適合基層機構使用,有利于食源性疾病的早發現、早診斷、及時對癥治療,對保障食品安全和維護公眾健康有積極意義。