黃芪根腐病拮抗菌的篩選及生防機制

許磊磊　白曉麗　李哲斐

摘要：由Fusarium oxysporum引起的根腐病是制約黃芪產量和品質的重要因素之一，為了獲得環境適應性強且拮抗效果好的黃芪根腐病生防菌，以病原真菌F.oxysporum為指示菌，通過稀釋涂布法和平板對峙實驗從黃芪根和根際土壤中共分離得到197株細菌，其中20株細菌對病原真菌有拮抗作用，且20株拮抗菌中優勢菌為芽孢桿菌.7株拮抗菌對病原真菌生長抑制率超過35%，用這7株細菌進行盆栽試驗，結果表明，菌株AS1對黃芪根腐病的防治效果最好，在接種病原菌第20 d時AS1對黃芪根腐病的防效達46.86%.進一步研究發現，菌株AS1基因組中含有伊枯草素、脂肽和桿菌霉素的編碼基因，AS1處理后病原真菌孢子萌發率下降了74.4%.接種AS1第8 h后植物的苯丙氨酸解氨酶、幾丁質酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶活性和茉莉酸含量較不接種對照分別提高了16.0%，21.5%，10.6%，12.6%，14.2%和97.3%.此外，AS1處理15 d后使黃芪的根長和株高分別增加了37.52%和12.78%.根據生理生化特征和16S rDNA測序發現菌株AS1歸屬于貝萊斯芽孢桿菌.因此，AS1是一株具有較大應用潛力的生防和促生菌株.

關鍵詞：黃芪根腐病；生防菌；誘導性系統抗性；貝萊斯芽孢桿菌

中圖分類號：S 432.45 文獻標志碼：A文章編號：1001－988Ⅹ（2024）02－0077－09

Screening of antagonistic bacteria and biocontrol mechanism of astragalus root rot

XU Lei－lei，BAI Xiao－li，LI Zhe－fei

Abstract：Root rot caused by Fusarium oxysporum is one of the important factors restricting the yield and quality of Astragalus mongholicus.In order to obtain biocontrol bacteria with excellent environmental adaptability and antagonistic effect，a total of 197 bacterial strains were isolated from the roots and rhizosphere soil of Astragalus mongholicus via dilution coating method and plate confrontation using F.oxysporum as indicator pathogen.Twenty bacterial strains had the ability to inhibit the growth of fungal pathogenic mycelia through preliminary screening，and the dominant bacteria among the twenty strains were Bacillus.The inhibition rate of 7 antagonists to fungal mycelial growth was more than 35%，these 7 bacteria were selected to perform pot experiment.The results showed that strain AS1 had the best control effect on astragalus root rot，and the control effect was 46.86% on the 20th day after inoculation of AS1.Further studies showed that the genome of strain AS1 contained the coding genes of iturin，lipopeptide and Bacilysin.After AS1 treatment，the spore germination rate of pathogenic fungi decreased by 74.4%.The activities of phenylalanine ammonia lyase，chitinase，polyphenol oxidase，peroxidase，lipoxygenase and jasmonic acid content of plants inoculated with AS1 increased by 16.0%，21.5%，10.6%，12.6%，14.2% and 97.3%，respectively.In addition，after 15 days of AS1 treatment，the root length and plant height of astragalus increased by 37.52% and 12.78%，respectively.According to physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing，the strain was found to belong to Bacillus velezensis.Therefore，AS1 is a biocontrol and growth promoting bacterium with great application potential.

Key words：root rot;biocontrol bacteria;inducing systemic resistance;Bacillus velezensis

黃芪是我國使用非常廣泛的傳統中藥材，為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge）的干燥根.黃芪含有黃酮類、皂苷類和多糖類等多種活性成分，具有抗菌、利尿、降壓、補氣固表等功能［1－3］.因其極高的應用價值和經濟價值而在我國廣為栽培［4］，其中山西、甘肅、內蒙古、陜西、河北等省為主要產區.由于黃芪生長需要質地疏松和滲水較好的土壤，使得黃芪種植區域受到一定限制.因此，黃芪種植過程中連作時間延長，輪作周期變長，造成了土壤中微生物群落組成發生改變［5］，細菌總數/真菌總數比例減小，最終使得黃芪在種植過程中土傳病害發生率較高.其中根腐病是一種比較常見的病害，嚴重感染時能造成田間30%～80%的植株染病，極大的降低了黃芪的產量和品質［6－7］.引起黃芪根腐病的病原體主要包括Fusarium solani，Fusarium oxysporum，Fusarium acuminatum，Fusarium equisetim，Alternaria sp.等真菌［8－9］.這些病原真菌的孢子在土壤中以休眠體形式長期存在，防控較為困難［10］，所以如何有效的防治根腐病的發生是黃芪種植產業中亟待解決的問題.

目前對黃芪根腐病的防治主要通過使用化學殺菌劑和篩選抗性品種.然而篩選抗性品種是一項耗費時間、投資較高的手段，但抗根腐病能力較強的黃芪品系依然缺乏.化學殺菌劑是一種快速有效的黃芪根腐病防治方法，但長期使用化學農藥不但造成殘留在土壤中農藥的積累，引起環境污染，而且農藥也在植物中大量富集，使藥材品質嚴重下降［11］.生物防治方法對環境友好，是預防作物土傳病害最有前景的方法之一.目前已經從多種植物組織和根際土壤中分離得到了對病原真菌生長具有抑制作用的微生物.張愛梅等［12］從沙棘根瘤內分離的Bacillus tequilensis對黃芪根腐病有較好的防治效果.

高通量測序技術的發展揭示了在干旱、鹽堿和病害脅迫下，植物能招募有益的微生物在其根際、葉際和植物組織內定殖，這些富集的微生物能幫助植物抵抗非生物和生物脅迫［13］.所以近些年來學者們開始關注從植物根際和根內分離拮抗菌并用于作物土傳病害的生物防治.例如沈艷等［14］從小麥中分離的生防菌解淀粉芽孢桿菌B9601－Y2對Botrytis cinerea的生長有明顯的抑制作用，在接種該生防菌后對番茄灰霉病的防治效果可達88%.閆助冰等［15］發現Bacillus velezensis在PDA平板上對Sclerotium rolfsii菌絲的生長抑制率為81.9%.盆栽試驗表明該菌對花生白絹病的生防效果高達66%［15］.然而，關于黃芪根腐病生物防治方面的研究較為缺乏.

為了探究拮抗菌對黃芪根腐病的防控作用，從甘肅省宕昌縣采集黃芪和土壤樣品，通過稀釋涂布法從樣品中分離細菌，再采用平板對峙法篩選對黃芪根腐病病原真菌Fusarium oxysporum生長有拮抗作用的菌株，最后通過溫室盆栽實驗研究了生防菌株對黃芪根腐病的防治效果和植物誘導性抗性的激活作用，以期為黃芪根腐病的田間防治提供新的途徑.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 試驗所用黃芪為蒙古黃芪，種子購買于當地農戶.

1.1.2 供試菌株 黃芪根腐病病原真菌（Fusarium oxysporum HQ16）分離自患病黃芪根部（植株采自甘肅省宕昌縣哈達鋪），菌株保存于西北農林科技大學農業與環境微生物重點實驗室.

1.2 方法

1.2.1 采樣地點 試驗所用黃芪和土樣均采自于甘肅省宕昌縣哈達鋪鎮（N 34°16.819′，E 104°09.855′，海拔2379 m）.2019年5月，在黃芪樣地中隨機采挖具有根腐病癥狀和健康的黃芪植株各6株，采樣深度為40 cm.將采集的植物樣品連同根部附著的土壤裝于自封袋并在袋上標記采樣信息后帶回實驗室備用.

1.2.2 根際和根內生細菌分離 用力抖動健康或發病植株根系除去表面松散結合的土壤，用毛刷將根表面1～2 mm厚的根際土刷到無菌離心管中，稱取1 g黃芪根際土溶于9 mL無菌水中充分溶解，吸取1 mL土壤懸液10倍梯度稀釋至10-7，備用.然后將上一步去掉根際土的根段用75%乙醇消毒2 min，3%次氯酸鈉消毒1 min，再以無菌水沖洗6次.將表面消毒的根在無菌研缽中充分研磨，吸取1 mL勻漿液并進行10倍稀釋至10-7，分別取100 μL上述根際土懸液和根研磨液（10-5，10-6和10-7）以無菌操作法涂布于TSA，LB和R2A固體培養基上，于28 ℃培養3～5 d.將長出的不同特征菌落在LB培養基上純化，所得菌株保存于4 ℃冰箱備用.

1.2.3 拮抗菌篩選 用無菌打孔器從長有F.oxysporum的PDA平板取直徑5 mm的菌塊，將菌塊置于新的PDA平板中心，將10 μL根內生或根際細菌懸液分別接種于距離菌塊中心2.5 cm處，以滴加相同體積無菌水作為對照，每個處理含3個重復，所有平板于28 ℃培養5 d.觀察病原真菌生長情況，計算生長抑制率.

菌絲生長抑制率=（對照組真菌菌落半徑-處理組真菌菌落半徑）/對照組真菌菌落半徑×100%.

1.2.4 拮抗菌株的鑒定 用細菌DNA提取試劑盒DP302（北京天根生化科技有限公司）提取所分離得到的拮抗菌株基因組DNA，以引物27F/1429R擴增各個菌株的16S rDNA（表1）.擴增體系和條件為：模板DNA 2 μL，引物27F和1429R各1 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL，95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，30循環；72 ℃延伸6 min.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后剩余擴增液送上海生工測序，在NCBI網站對所得序列進行搜索，將相似度較高的16S rDNA序列下載并輸入到MEGA6.06軟件中.序列比對完成后選擇MEGA軟件菜單中“Phylogeny”－“Construct/Test Neighbor－Joining Tree”，Bootstrap Replications參數選擇1000，其余為軟件默認構建系統發育樹.并參照《伯杰氏細菌學鑒定手冊》對菌株AS1的生理生化特性進行測定.

1.2.5 盆栽防效測定 將土壤、蛭石和泥炭按3∶2∶1（V/V）混合均勻后裝入蘑菇種植袋，每袋600 g.將7株拮抗能力較強的菌株分別接種于LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養24 h.菌懸液8 000 r·min-1離心10 min，沉淀用無菌水洗滌后再次離心，將細胞重新溶解于無菌水中，調節OD600為0.8，取10 mL上述菌懸液接種到種植袋中.將5棵發芽2 d的黃芪種子播種于種植袋中.5 d后，在種植袋中加入10 mL病原菌孢子懸浮液（105個·mL-1）.2 d后再向種植袋中接種10 mL菌懸液.以無菌水代替菌懸液作為對照，每個處理做10袋重復，所有處理放于玻璃溫室培養.期間每隔3 d統計黃芪發病株數和20 d的病情指數，同時對植物株高、根長、干重和鮮重等指標進行測定.黃芪根腐病防治效果=（（對照病情指數-菌液處理病情指數）/對照病情指數）×100%.

1.2.6 菌株AS1對真菌孢子萌發的抑制 將菌株AS1在LB培養基中培養至指數生長階段，調整菌懸液濃度為108 CFU·mL-1.將等體積的細菌懸液和真菌孢子懸液（106孢子·mL-1）混合，以不接菌的LB培養基和孢子懸液混合作為對照，每個處理重復3次.孢子在25 ℃黑暗環境下萌發10 h，顯微鏡下統計同一個視野中萌發的孢子數量，計算萌發抑制率：孢子萌發抑制率=（（對照組萌發孢子數-處理組孢子萌發數）/對照組萌發孢子數）×100%.

1.2.7 菌株AS1抗菌物質編碼基因檢測 如1.2.4所述提取菌株DNA，參照Zhu等［16］的方法對菌株可能的抗菌物質編碼基因進行擴增（表 1），PCR產物送北京擎科生物技術公司測序，在NCBI以BLASTn進行比對.

1.2.8 植物誘導性系統抗性測定 將600 g基質（土壤、蛭石和泥炭按3∶2∶1混合）裝入蘑菇種植袋并種植催芽的黃芪種子.當黃芪生長1個月后將10 mL OD600為0.8的AS1菌懸液接種于黃芪根周圍，以添加等量無菌水作為對照.分別于接菌后8，24，48，72，120和168 h后采集植物，分別取1 g接種AS1和無菌水的黃芪根（每個處理3個重復），加入2 mL 0.1 mol·L-1PBS緩沖液置于冰上研磨.勻漿液在14 000 r·min-1條件下離心20 min，根據試劑盒說明書取上清液對苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、幾丁質酶（chitinase）酶活性和茉莉酸（JA）含量進行測定.

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0和EXCEL 2013軟件對所得數據進行分析和處理.

2 結果與討論

2.1 拮抗菌株篩選

從黃芪根際和根共分離得到197株細菌，其中發病根中分離到104株，健康根中得到44株，發病植物根際土8株，健康根根際土41株.平板對峙試驗結果表明，有20株細菌對F.oxysporum菌絲的生長有明顯的抑制作用，占所有分離菌株的10.2%.進一步統計發現，從患病植物根和根際中分離得到拮抗菌株9株，從健康植物根和根際分離到拮抗菌株11株.此外，20株拮抗菌分別屬于芽孢桿菌屬、不動桿菌屬和假單胞菌屬等13個屬，其中芽孢桿菌為優勢屬（7株）.這可能是芽孢桿菌屬細菌在不良環境中形成孢子，從而對干燥、輻射和滲透壓具有比較強的抵抗能力.例如枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等都被研制成生防菌劑并用于田間作物防病［17－18］.胡黨振等［19］發現復合芽孢桿菌灌根處理能‘沃柑根褐變減少、黃龍病的發病率降低約50%.

通過對這20株拮抗菌的真菌菌絲抑制率計算發現，編號為AS1，AS11，AS51，AS56，AS5，AS42和AS87的7株菌抑菌效率較高，每株菌的平均抑制率均超過35%（表2），故后續選擇這7株拮抗菌進行下一步試驗.

2.2 拮抗菌對黃芪根腐病發病率的影響

通過盆栽試驗評價了上述7株拮抗菌對黃芪根腐病的防治效果，結果列于表3.菌株AS11，AS56和無菌水處理植物在接種病原真菌孢子第5 d后開始出現發病癥狀.從接種病原菌第10 d開始，所有處理組都有植物出現發病癥狀，但AS1和AS42處理組的發病率明顯低于其他組.隨著培養時間的延長，AS1處理組植物的發病率基本無太大變化并且發病率保持在較低水平，AS42處理組植物的發病率開始逐漸增加，但低于除AS1之外的其他處理組.本研究中，雖然菌株AS1對病原真菌菌絲生長的抑制效率低于AS56和AS11，但盆栽試驗條件下，AS1處理黃芪在生長20 d后的發病率和死亡率分別比對照降低了34.4%和59.06%，其防病效果明顯高于AS11和AS56.這可能是由于AS1屬于貝萊斯芽孢桿菌，其在土壤中的生存能力要優于其他屬的菌株，所以AS1能更好的在黃芪根際或根內定殖，進而發揮防病功能.

同時，從試驗結果發現AS1處理后大部分植物根部顏色呈白色，沒有發現病斑，地上部分直立.空白對照組的大部分植物根部出現褐色病斑，根莖結合出長出大量白色菌絲，植物葉片枯萎，莖開始倒伏（圖1）.近年來，由一些病原真菌引起的作物土傳病害在世界范圍內造成了重大的經濟損失［20］.而黃芪是我國一種重要的傳統中草藥，在長期的栽培過程中根腐病發病率較高.從植物根際分離有益微生物，用這些微生物制劑替代化學殺菌劑防治植物病害是作物病害防治的熱點［21］.張妞等［22］從34株細菌中篩選出9株枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，對馬鈴薯腐爛莖線蟲病有較好的生防效果.許樂等［23］發現丹參內生細菌DS－R5的發酵提取物對腐皮鐮刀菌孢子萌發和菌絲生長有明顯抑制作用.然而，要想在田間取得理想的防治效果，需要拮抗菌能夠在植物根際或植物組織內定殖.所以研究者大都傾向于從根、莖、葉和種子中分離拮抗菌［24－25］.也有學者分離了針對黃芪根腐病的拮抗細菌和放線菌［26－27］，但在這些研究中只測定了菌株或發酵液對病原真菌菌絲生長的抑制作用，沒有開展盆栽試驗，所以這些拮抗菌株在實際中的效果并不清楚.本研究從黃芪根際和根內篩選的拮抗菌能更好的在根際繁殖并起到較好的生防效果.

2.3 拮抗菌對黃芪根腐病發病的盆栽防治效果

由于只有AS1能顯著降低植物的發病率，因此文中計算了溫室盆栽條件下該株菌對黃芪根腐病的防治效果.由表4可以看出，植物接種病原真菌孢子20 d后，AS1能很好的保護植物，其盆栽防效可達46.86%

2.4 菌株AS1對植物的促生作用

既然拮抗菌AS1能有效防治黃芪根腐病，本文研究也檢測了這株菌是否具有植物促生能力.

如圖2所示，接種AS1能顯著增加植株的根長和根高，與未接菌的對照相比，AS1處理植株根長和根高分別增加了37.52%和12.78%.雖然接種AS1植株的鮮重和干重與對照無顯著差異，但接菌處理依然高于對照.

2.5 菌株AS1的鑒定

菌株AS1在TSA培養基的上單菌落呈現乳白色，表面粗糙，不透明，邊緣不規則，以膜狀附著在培養基表面.在光學顯微鏡下觀察發現該菌體形態呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性（圖3a，b）.能以淀粉、檸檬酸為碳源生長，甲基紅試驗和接觸酶試驗呈陽性（表5）.對菌株的16S rDNA序列進行比對并構建系統發育樹，發現菌株AS1與Bacillus velezensis CR502更接近，其相似性為99.71%（圖3c）.因此，文中將菌株AS1命名為Bacillus velezenssi AS1.

2.6 菌株AS1的防病機制

2.6.1 菌株AS1對病原真菌孢子萌發的抑制 如圖4所示，將拮抗菌AS1與病原真菌孢子在25 ℃的黑暗條件下共培養10 h，不加拮抗菌對照組的大部分孢子開始萌發，然而AS1處理組種只有少量真菌孢子有萌發.和對照相比，AS1處理后的真菌孢子萌發率下降了74.4%，并且拮抗菌處理組的真菌菌絲明顯要短于對照組.

2.6.2 菌株AS1抗菌物質編碼基因 由于芽孢桿菌屬中的許多菌株都能產生抗生素，因此通過PCR對菌株AS1中一些抗菌物質合成相關的編碼基因進行檢測.試驗結果發現有3對引物（ituA F/R，srfA F/R和bacA F/R）能夠從AS1基因組中擴增出DNA片段.經序列比對，這3個DNA片段分別為伊枯草素、脂肽和桿菌霉素的編碼基因，這些抗真菌代謝產物可以與病原真菌相互作用，導致菌絲形態異常和破壞［28］.

2.6.3 菌株AS1對植物系統抗性的誘導

探究了AS1能否可以誘導植物系統抗性以阻止病原菌入侵.從圖5可以看出，在F.oxysporum的侵染下，植物JA含量、PPO和幾丁質酶活性逐漸增加，PAL，POD和LOX酶活性先升高后降低，在接種病原菌72 h后恢復上升，在168 h達到最大值.與未接種生防菌的對照植株相比，接種AS1植株的酶活性和JA含量在整個采樣時間段內均顯著高于對照植株.這說明在F.oxysporum侵染初期，AS1提高植物JA含量以及PAL，PPO，SOD，LOX和POD酶活性，大大增強了植株對病原真菌的抗性［29］.并且菌株AS1還提高了幾丁質酶活性，而幾丁質酶通過降解病原真菌細胞壁而使其裂解死亡［30］.這也可能是菌株AS1在PDA平板上抗真菌能力較弱，但在盆栽試驗中其防治效果較好的一個原因.

3 結論

通過平板對峙實驗從黃芪根際和根內篩選到20株拮抗細菌，其中芽孢桿菌為優勢屬.貝萊斯芽孢桿菌AS1在PDA培養基上對病原真菌的抑制率只有36.84%，但在盆栽實驗中其防病效果卻明顯高于其他菌株.貝萊斯芽孢桿菌AS1基因組中包含編碼伊枯草素、脂肽和桿菌霉素的合成基因.此外，貝萊斯芽孢桿菌AS1還能激活黃芪的誘導性抗性來增強植物對病原真菌的抵抗能力.

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（責任編輯 陸泉芳）

收稿日期：2023－11－05;修改稿收到日期：2024－01－22

基金項目：國家自然科學基金資助項目（42277317）;陜西省重大科技專項（2020zdzx－03－02－01）

作者簡介：許磊磊（1999—），男，安徽淮南人，碩士研究生.主要研究方向為微生物資源利用.E－mail：2188209141@qq.com

*通訊聯系人，教授.主要研究方向為微生物資源利用.E－mail：lizhefei@nwafu.edu.cn