基于條件優化探索對流免疫電泳技術的實驗教學設計

康艷華，姚佳露，杜斌豪

（杭州師范大學 基礎醫學院，浙江 杭州 310000）

對流免疫電泳（convective immunoelectrophoresis，CIEP）是一種結合了雙向瓊脂擴散和電泳的定向加速免疫擴散技術。該技術具有微量、快速和高靈敏性等特點，可用于抗原或抗體的快速診斷。在高校免疫學實驗教學中，CIEP是最經典的教學項目之一［1］。其實驗原理是在pH8.6的緩沖液中，大部分蛋白質抗原帶有強負電荷，在電場中向正極移動；而IgG類抗體帶有較少的負電荷且分子量較大，因此它們本身移動緩慢甚至不移動，但在電泳介質的電滲作用下向負極移動。抗原抗體在比例適當處形成沉淀線，并可以通過沉淀線相對于兩孔位置來判斷它們之間的比例關系［2］。目前，CIEP已被廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲和毒素等抗原或抗體的定性分析、效價測定及分類鑒定［3-5］。

近年來，對流免疫電泳常用的巴比妥電泳緩沖系統的試劑不易購得，而其他替代緩沖液的使用效果存在爭議［6］。因此，在實驗原理和電泳緩沖系統特性的基礎上，我們進行了三種Tris緩沖液與巴比妥電泳緩沖液的使用效果比較，并分析了電泳介質、電泳時間對實驗結果的影響，以期尋求最佳實驗方案并推廣應用。

一、材料與方法

（一）實驗動物

成年家兔（體重約2.5 kg），由杭州師范大學實驗動物中心提供。

（二）主要試劑

牛血清白蛋白（BSA，A116563，阿拉丁）、純瓊脂粉（凝膠強度＞1 300 g/cm2，Biosharp）三羥甲基氨基甲烷（B010038，安耐吉）、瓊脂糖（A104062，阿拉丁）、50×TAE緩沖液（T197243，阿拉丁）、5×TBE緩沖液（T196389，阿拉丁）、完全弗氏佐劑（F5881，Sigma）、不完全弗氏佐劑（F5506，Sigma），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

（三）設備與儀器

DYCP-38C型臥式水平電泳儀（北京六一儀器廠）、恒溫恒濕培養箱（BSC-150，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、離心機（ST-16R，Thermo Fisher）、載玻片、打孔樣紙、打孔、針頭、濕盒等。

（四）實驗方法

1.抗血清制備。6只新西蘭大白兔適應飼養1周后。按照參考文獻［7］報道的免疫程序，稍加改進進行免疫。將抗原與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化后進行皮內、皮下首次免疫家兔，于免疫后第7、14天以同樣劑量與方式進行第二次和第三次免疫，首免后第21天，不加佐劑經耳緣靜脈進行加強免疫，共免疫4次。末次免疫一周后經頸動脈采血，置37 ℃恒溫培養箱孵育2小時；2 500轉/分離心5分鐘；收集上清液，即為兔抗血清，分裝后置-80 ℃保存備用。

表1 緩沖液的配制

2.緩沖液的配制。

3.雙向瓊脂擴散試驗。參照文獻［8］報道的方法，在瓊脂玻片上制備梅花型孔，將20μL抗原（5 mg/mL BSA）加入中央孔，按順時針方向分別加入免疫血清原液，分別按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的比例稀釋的免疫血清加入周圍孔中。37 ℃下孵育24小時后觀察結果，并以出現清晰的白色沉淀線的最高稀釋度作為抗血清效價。

二、實驗結果

（一）雙向瓊脂擴散試驗測定抗血清效價

將抗血清按照不同的稀釋比例進行雙向瓊脂擴散試驗。結果如圖1所示，當抗血清稀釋比例為1∶4時，兩孔之間可見清晰沉淀線，故免疫所獲得兔抗BSA抗血清效價為1∶4。此濃度作為以下對流免疫電泳實驗的抗血清濃度。

圖1 雙向瓊脂電泳擴散試驗結果

（二）對流免疫電泳實驗條件的優化

1.不同的載體介質對免疫沉淀線形成的影響。瓊脂和瓊脂糖作為電泳介質廣泛應用于DNA、免疫球蛋白、脂蛋白等大分子的分離與鑒定［9-11］。本實驗比較了兩者作為電泳支持介質對CIEP實驗結果的影響，結果顯示，在pH8.6巴比妥電泳緩沖系統中，100 V電壓，經過15～20 分鐘電泳后，在1.2%瓊脂凝膠板上兩孔之間可見較淡的白色沉淀線；而在瓊脂糖凝膠板上則不明顯（如圖2）。由此可見，瓊脂作為對流免疫電泳支持介質效果更佳。

圖2 不同電泳介質對沉淀線形成的影響

2.不同電泳緩沖系統對免疫沉淀線形成的影響。在電泳實驗中，電泳緩沖系統扮演著至關重要的角色。我們比較了科研領域常用的四種電泳緩沖系統在抗原-抗體對流免疫電泳實驗效果上的差異。結果表明，在1.2%瓊脂凝膠電泳15～20分鐘后，四種不同的電泳緩沖系統均呈現清晰可見的白色沉淀線（如圖3）。從沉淀線的形狀和清晰度來看，TAE緩沖液與巴比妥緩沖液具有相當的緩沖性能。

圖3 不同電泳緩沖系統對沉淀線形成的影響

3.不同濃度的瓊脂凝膠對沉淀線形成的影響。經過觀察不同濃度瓊脂凝膠中的沉淀線形成，發現在巴比妥緩沖體系下，0.8%至1.5%范圍內可見清晰可辨的沉淀線；而在TAE和TBE緩沖條件下，0.6%至1.5%范圍內均呈現短粗且明顯的沉淀線；Tris-HCl緩沖液需要將瓊脂凝膠濃度控制在1.0%至1.5%，才能看到細長而清晰的沉淀線（如圖4）。考慮到膠配制和打孔方便性的因素，建議使用1.0%～1.5%濃度的瓊脂凝膠。

圖4 不同濃度的瓊脂凝膠對沉淀線形成的影響

三、討論

經典的抗原抗體血清學檢測技術——對流免疫電泳，是醫學與生命科學相關專業本科生必備的免疫學實驗內容。在本研究中，我們以自制備的兔抗BSA免疫血清為實驗材料，并對CIEP實驗條件進行了探索和優化，明確了適合該實驗的電泳緩沖液、介質等關鍵因素，為實驗教學提供理論支持和指導。

制備高效價的免疫血清是實驗成敗的關鍵。在本實驗中，我們采用短程免疫法獲得了滿足實驗教學要求所需的兔抗BSA血清，并比較分析了影響免疫電泳的因素，如電泳支持介質和緩沖體系。近年來，對流免疫電泳替代緩沖液的使用效果存在爭議。周瑞雪等人［13］的研究表明，Tris-HCl緩沖液在替代巴比妥鈉緩沖液方面具有最佳效果，其次是TAE。在我們的實驗中，根據沉淀線形成的時間、形狀及位置判斷也驗證了Tris-HCl緩沖液的效果。然而，與之不同的是，我們發現TAE的緩沖效果優于Tris-HCl，并且當瓊脂凝膠濃度在1.0%～1.5%范圍內時，能夠形成清晰可見的細長型沉淀線。這一結果與張淑莉等［12］所得到的結論相符。盡管Tris-HCl和TAE作為緩沖液均易獲取且成本較低，實驗效果良好，但就安全性而言，Tris-HCl緩沖液在實驗過程中可能會電解生成有毒氣體氯氣，對實驗環境及實驗者存在一定的危害性，而TAE緩沖液安全性較高，電泳過程中沒有毒氣的生成，并且實驗效果較好，完全能夠替代巴比妥緩沖液在對流免疫電泳中的使用［12］。

同時，我們發現TBE也可作為替代緩沖液。相較于TAE，TBE緩沖液具有更強的緩沖能力和電導率。然而，當瓊脂凝膠濃度在0.6%～1.0%范圍內時才能形成清晰、短粗的白色沉淀線。但在低濃度的瓊脂凝膠板上制備上樣孔比較困難，因此，若選擇TBE作為電泳緩沖液，則最好配置1.0%瓊脂凝膠濃度。

瓊脂和瓊脂糖是電泳實驗中常用的支持介質，然而它們在對流免疫電泳實驗中的應用仍存在爭議。周瑞雪等［13］的研究表明，瓊脂糖作為電泳介質對沉淀線形成具有最佳效果。這主要歸因于其具有良好的電滲效應、高韌性和硬度以及便于打孔。然而，我們的實驗結果與張淑莉等［12］的研究結果均表明，瓊脂凝膠作為電泳支持介質更加優越。這可能是由于其含有硫酸根所致的高電滲力所致。相比之下，瓊脂糖則是一種中性物質，由半乳糖及其衍生物構成，并不帶任何電荷，因此它的電滲力相對較弱。同時發現，相同的電泳緩沖液下，沉淀線形成不僅與電泳支持介質有關，還受電泳時間的影響。在四種緩沖液的瓊脂凝膠中，沉淀線能夠在電泳15～20分鐘內清晰可見，而在瓊脂糖凝膠中，僅有TAE緩沖條件下，需要經過45～60分鐘后才呈現沉淀線。此外，抗原-抗體在凝膠內形成沉淀線時，瓊脂凝膠濃度也會影響到沉淀線的形狀。為了方便進行打孔操作，建議將瓊脂凝膠濃度控制在1.0%～1.2%。

綜上所述，三種Tris緩沖液（TAE、Tris-HCl和TBE）均可替代巴比妥緩沖液用于對流免疫電泳實驗，其中TAE效果最佳。此外，在選擇電泳支持介質時，最佳選擇為優質瓊脂粉，其使用濃度應為1.0%～1.2%，電泳時間應控制在15～20分鐘。