hUMSCs外分泌上清聯合替莫唑胺在不同膠質瘤細胞系中的協同增敏作用*

劉雨思， 王明明， 張玉富， 靳小燕， 賀 晶， 史海燕， 陳美霓， 張 靜，3，4△

（1延安大學基礎醫學院，陜西 延安 716000；2延安大學附屬醫院，陜西 延安 716000；3西安醫學院第二附屬醫院，陜西 西安 710038；4陜西干細胞工程有限公司，陜西 西安 710075）

多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是惡性程度最高的膠質瘤，也是成人中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，隨著人們生存環境的改變，其發病率呈逐年上升趨勢［1］。由于常侵及瘤周重要的生命調控中樞，GBM預后遠差于其他各系統腫瘤，死亡率很高［2］。對患者進行術后輔助性化療被認為是延長GBM 患者生存時間的主要手段［3］。第二代口服烷化劑替莫唑胺（temozolomide， TMZ）因其較易通過血腦屏障而成為抗GBM 的一線化療藥［4-5］。但臨床數據顯示TMZ 的初始有效率約為56%［6］，繼發耐藥率高達83%［7］，這可直接導致化療失敗。因此，對于復發/難治及耐藥的GBM 患者，迫切需要靶向性強且副作用可控的全新方案以輔助或取代現有治療。

目前，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUMSCs）憑其低免疫原性及腫瘤嗜性等已成為腫瘤靶向療法中的“種子細胞”［8］。對腦腫瘤而言，hUMSCs 還可跨越血腦屏障從而實現顱內定向給藥。研究表明，hUMSCs可能是通過其外分泌上清（hUMSC culture supernatant，hUMSC-CM）的“細胞替代［9］”與“偽旁觀者效應［10］”等方式共同發揮抗腫瘤作用。hUMSC-CM 含有多種細胞外囊泡和生物活性因子，其活性可顯著影響鄰近細胞的關鍵生物學功能。同時它保留了hUMSCs 穿過血腦屏障的特性與腫瘤傾向性。利用干細胞上清提取物治療腫瘤既能發揮干細胞優勢又可避免細胞遞送的局限性，是一種可行的無細胞療法替代方案［11］。抗癌藥的配伍能有效克服腫瘤的原發和繼發性耐藥，這也許是提高GBM 對TMZ 敏感度的潛在途徑。與大多數抗癌藥不同，有效劑量的hUMSC-CM對正常細胞和組織器官的功能無不良影響，提示其與其它藥物配伍治療的安全性［12］。本研究以大鼠惡性膠質瘤細胞系RG-2、人星形細胞瘤細胞系U251和人膠質母細胞瘤細胞系LN-428 為研究對象，通過細胞活力檢測、病理形態學觀察及凋亡分析等技術，評估不同膠質瘤細胞系對TMZ以及hUMSC-CM 的敏感度差異，進而篩選出有效配伍濃度，觀察二者體外治療膠質瘤的協同增敏效果。通過檢測膠質瘤細胞凋亡與自噬通路變化，以期揭示配伍給藥的有效作用機制，為聯合給藥的選擇性用藥濃度及個體化治療提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 細胞 人膠質母細胞瘤細胞U251和LN-428購自廣州華拓科技有限公司；大鼠膠質母細胞瘤細胞RG-2購自上海雅集生物科技有限公司。

1.2 臍帶標本 臍帶組織取自延安大學附屬醫院產科剖宮產足月健康胎兒，臍帶組織標本使用經過產婦本人允許并簽訂知情同意書，并獲得延安大學醫學生物科學倫理委員會（2022036）批準。

1.3 主要試劑與儀器 H-DMEM 培養液、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自Gibco；hUMSCs完全培養液購自武漢普諾賽生物科技有限公司；CCK-8 試劑購自Dojindo；蘇木精-伊紅染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；TUNEL 試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司；細胞周期試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；抗人CD34、CD45、CD73、CD90 和CD105 流式抗體購自Affinity；cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved PARP1、beclin-1、LC3 和β-actin 抗體購自Proteintech。流式細胞儀購自Agilent Technologies。

2 實驗方法

2.1 膠質瘤細胞培養 RG-2、U251 和LN-428 細胞使用H-DMEM培養液，于37 °C、5% CO2孵箱中培養。

2.2 hUMSCs的分離、培養與鑒定 利用組織塊貼壁法提取hUMSCs［13］。將臍帶組織切成段，去除臍靜脈和臍動脈，將華通氏膠切成2～3 mm 長度大小的組織塊接種于細胞培養瓶中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養；細胞生長到80%～90%融合狀態時第一次傳代。當第3～8 代hUMSCs 生長密度達到80%～90%時加入胰酶消化，離心。用PBS將細胞重懸成1×109/L，加入I抗（純化的抗人CD34、CD45、CD73、CD90和CD105）5 μL，4 ℃孵育60 min。PBS 洗滌3 遍，1 000×g離心5 min；用PBS將細胞重懸后使用流式細胞儀檢測。

2.3 hUMSC-CM 的收集和凍干粉的制備 當第3～8代hUMSCs生長到80%～90%融合狀態時，胰酶消化，1 000×g離心5 min。hUMSCs按照每75 cm2培養瓶接種7×105個細胞培養。hUMSC-CM 分兩種FBS 剝奪方式收集：（1）24 h FBS 剝奪法：使用8～9 mL 含有10% FBS 的H-DMEM 孵育24 h，之后用14 mL 不含FBS 的H-DMEM 繼續培養48 h 后收集hUMSC-CM；（2）48 h FBS 剝奪法：使用8～9 mL 含10% FBS 的HDMEM 孵 育48 h 后更 換14 mL 不含FBS 的H-DMEM孵育24 h，收集hUMSC-CM。將hUMSC-CM 于?80 ℃冷凍凝固后置于預冷的真空機中抽真空，升華干燥，制備成凍干粉，稱重，溶解于PBS，經0.22 μm濾膜過濾篩選后收集在無菌離心管中，于?20 ℃儲存。

2.4 CCK-8 實驗檢測細胞活力 將處于對數生長期的膠質瘤細胞接種于96 孔板中，加入含hUMSCCM 或TMZ 的培養液，孵育后每孔加入CCK-8 試劑10 μL，于37 °C 孵育2 h，酶標儀測定450 nm 處吸光度（A）。

2.5 HE 染色形態學分析 將處于對數生長期的膠質瘤細胞以5×107個/L 濃度接種于Nest-Dishes 蜂巢式爬片皿，待細胞生長密度達到75%時，加入含hUMSC-CM或TMZ的培養液，孵育48 h后取出。PBS洗滌3 遍，冷丙酮?20 °C 固定15 min，蘇木精染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇10 s，自來水沖洗，1%氨水返藍30 s，自來水沖洗，置伊紅液2 min，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察拍照。

2.6 流式細胞技術測定膠質瘤細胞周期 將處于對數生長期的膠質瘤細胞以5×107/L 濃度接種于直徑6 cm 培養皿，待細胞生長密度達到75%時，按照不同給藥組分組處理48 h，收集細胞懸液于離心管中，1 000×g離心5 min。PBS 洗滌3 遍，1 000 ×g離心5 min，加入預冷的70%乙醇重懸，?20 ℃固定過夜。離心，用預冷的PBS 洗滌2 次，加入RNase 室溫孵育15 min，利用PI 染色法進行染色［14］。室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測數據并分析結果。

2.7 TUNEL 法測定膠質瘤細胞凋亡 將對數生長期的膠質瘤細胞以5×107/L濃度接種于Nest-Dishes蜂巢式爬片皿，待細胞生長密度達到75%時，加入含hUMSC-CM 或TMZ 的培養液，孵育48 h，收集細胞爬片。PBS 洗滌，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗滌。滴加細胞通透液0.1% Triton X-100通透細胞，靜置5 min。將50 μL 1×標記溶液與TdT混勻后滴加至爬片表面，37 ℃避光標記1 h。向標本上滴加100 μL 0.1% Triton X-100，靜置5 min。滴加2.5 μL 抗熒光淬滅劑，封片，通過熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2.8 Western blot 檢測凋亡和自噬相關蛋白表達水平 按照不同給藥實驗組處理膠質瘤細胞，洗滌細胞后加入細胞裂解液，4 ℃、13 000 ×g離心15 min，吸取上清液，加入凝膠上樣緩沖液，沸水浴煮10 min，得到蛋白樣品。進行SDS-PAGE 凝膠電泳，350 mA恒流電流模式轉膜2 h，置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，4 ℃孵育Ⅰ抗過夜，TBST 洗滌3 遍，室溫下Ⅱ抗孵育1 h，滴加ECL發光液后曝光。

3 統計學處理

采用Graphpad Prism 9.0 軟件進行統計學分析，兩組數據差異分析采用非配對t檢驗，多組數據差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。計量實驗數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 hUMSCs的培養與鑒定結果

觀察原代（P0）和傳代（P1～P8）hUMSCs 的形態特征，可見hUMSCs 呈長梭形、渦旋狀的成纖維細胞形態（圖1A）。流式細胞術檢測第4 代hUMSCs 抗原標志物表達情況，結果顯示，hUMSCs 高表達CD73（98.2%）、CD105（97.7%）、CD90（98.5%）等陽性抗原標志物，低表達CD34（0.5%）、CD45（0.7%）等陰性抗原標志物，證明所檢測細胞為間充質干細胞且純度較高（圖1B）。

2 hUMSC-CM的收集和凍干粉的制備

因第1～2 代hUMSCs 染色體異常核型比例偏高，而高代次hUMSCs 有老化征象，所以使用第3～8 代hUMSCs做后續實驗。采用兩種去血清法收集第3～8代hUMSCs 上清液，將收集的hUMSC-CM 放置?80 ℃冷凍、凝固后制備成凍干粉，見圖2。

Figure 2. Method of powder preparation of P3～P8 hUMSC-CM. A： schematic diagram of collection of P3～P8 hUMSC-CM（ the 24 h serum deprivation method is shown on the left and the 48 h serum deprivation method is shown on the right）； B： hUMSCCM after freezing at ?80 ℃； C： hUMSC-CM powder prepared by freeze-drying technique.圖2 第3～8代hUMSCs培養上清液的粉末制備法

3 對比兩種FBS 剝奪法收集hUMSC-CM 對膠質瘤細胞活力的影響

為明確hUMSC-CM 濃度是否受孵育時間和FBS的影響，將兩種FBS 剝奪法收集的hUMSC-CM 分別設置為5 種劑量（0、1、3、6 和9 g/L）作用于RG-2、U251 和LN-428 細胞24、48 和72 h。根據CCK-8 結果，hUMSC-CM 以濃度依賴性方式抑制膠質瘤細胞增殖，膠質瘤細胞系對hUMSC-CM 的敏感度也不盡相同，如24 h 血清剝奪法收集的9 g/L hUMSC-CM 作用于膠質瘤細胞48 h 后，RG-2 細胞相對活力為（33.4±0.5）%，U251細胞為（53.4±0.7）%，LN-428細胞為（68.6±0.5）%；將48 h 血清剝奪法收集的9 g/L hUMSC-CM 作用于膠質瘤細胞48 h 后，RG-2 細胞相對活力為（21.3±0.5）%，U251 細胞為（48.2±0.4）%，LN-428細胞為（52.8±0.2）%，見圖3。膠質瘤細胞對hUMSC-CM 的敏感度為RG-2>U251>LN-428。因24 h 收集法中hUMSCs 狀態受剝奪血清時間影響較大，分泌上清能力受限，故采用48 h 收集法的hUMSCCM用于后續實驗。

Figure 3. Effects of hUMSC-CM obtained by two serum deprivation methods on the viability of glioma cells. A： the viability of RG-2，U251 and LN-428 cells was detected by CCK-8 assay after 24， 48 and 72 h of treatment with hUMSC-CM collected by the method of serum withdrawal at 24 h； B： the viability of RG-2， U251 and LN-428 cells was detected by CCK-8 assay after 24， 48 and 72 h of treatment with hUMSC-CM collected by the method of serum withdrawal at 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 g/L hUMSC-CM group.圖3 兩種血清剝奪法采集hUMSC-CM對膠質瘤細胞活力的影響

4 膠質瘤細胞化療敏感度差異及病理形態學檢測

0、25、50、100、200 和400 μmol/L 的TMZ 處理RG-2、U251 和LN-428 細 胞48 h 后，TMZ 對RG-2、U251 和LN-428 細胞的IC50分別為74.2、140.6 和183.2 μmol/L。膠質瘤細胞對TMZ 的敏感度為：RG-2>U251>LN-428（圖4A）。HE 染色病理形態學結果顯示，對照組細胞生長密集，形態飽滿，TMZ 處理組細胞數目減少，細胞形態呈現膠質樣分化，部分收縮變圓，胞核致密濃縮（圖4B）。

5 hUMSC-CM 聯合TMZ 抗膠質瘤的協同增敏效應分析

CCK-8 實驗結果顯示，hUMSC-CM 與TMZ 配伍處理RG-2、U251 和LN-428 細胞48 h 后表現出對膠質瘤細胞的協同式劑量依賴性抑制作用（圖5A）。在RG-2、U251 和LN-428 細胞中，9 g/L hUMSC-CM（C9）聯合50 μmol/L TMZ（T50）配伍（C9+T50）組與T50 組相比細胞相對活力分別下降（66.8±0.4）%、（59.8±0.4）%和（38.9±0.7）%，差異有統計學意義（P<0.05）。C9 與T50 配伍后TMZ 對RG-2、U251、LN-428 細胞的IC50分 別 為21.16、42.52 和63.77μmol/L。C9+T50 組合可作為有效配伍濃度。HE 病理形態學結果顯示，與對照組相比，C9+T50 組合處理后膠質瘤細胞生長密度變低，形態上表現出體積變小，突起伸長（圖5B）。流式細胞術分析細胞周期結果顯示，C9+T50 組RG-2 和U251 細胞被阻滯于G2/M期，LN-428細胞被阻斷在G0/G1期（圖5C）。

6 有效濃度hUMSC-CM/TMZ 配伍對膠質瘤細胞凋亡形態學的影響

TUNEL 熒光染色結果顯示，與對照組或單獨給藥組相比，C9+T50 組RG-2、U251 和LN-428 細胞中TUNEL陽性染色熒光強度明顯增強，見圖6。

Figure 6. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of glioma cells（ scale bar=50 μm）. Compared with control（ CON） group，TUNEL expression was strongly positive after 9 g/L hUMSC-CM（ C9） combined with 50 μmol/L temozolomide（ T50）， and the intensity of fluorescence was RG-2 > U251 > LN428.圖6 TUNEL染色檢測膠質瘤細胞凋亡

7 hUMSC-CM/TMZ 通過上調凋亡蛋白PARP1 和caspase-3/8 剪切并促進自噬蛋白beclin-1 和LC-3表達

Western blot結果表明，與對照組相比，聯合組內RG-2、U251 和LN-428 細胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8 和cleaved PARP1 蛋白水平顯著升高（P<0.01），且自噬蛋白beclin-1 和LC3-II/LC3-I 水平顯著高于對照組（P<0.01），見圖7。

Figure 7. The protein levels of cleaved caspase-3， cleaved caspase-8， cleaved PARP1， beclin-1 and LC3 in RG-2， U251 and LN-428 cells were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs CON group.圖7 Western blot 檢測RG-2、U251 和LN-428 細胞內cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved-PARP1、beclin-1 和LC3蛋白水平

討 論

hUMSCs 抗腫瘤的作用機制可能包括分化為受損細胞達到修復目的、分泌多種生物活性因子等兩種方式［15］。前者可能會引起促瘤效應，對腫瘤細胞的抑制起到相反作用［16］，因而利用富含細胞活性因子的干細胞上清提取物作為細胞替代療法得到了越來越多的關注。但對hUMSC-CM 抗膠質瘤的研究鮮有報道，且hUMSC-CM 的濃度是否受FBS 和孵育時間的影響尚不清楚。據此，本研究采用24 和48 h 兩個時點分批次剝奪血清收集hUMSC-CM，并以不同濃度梯度和時間作用于膠質瘤細胞，結果提示兩種去剝奪血清法收集的hUMSC-CM 均可以劑量依賴性方式抑制膠質瘤細胞的活力。此外，為保證相同質量的粉末中成分基本相同，本實驗采用第3～8 代hUMSCs 作為上清提取來源，經過3 次平行實驗驗證hUMSC-CM 對膠質瘤的殺傷效果是否一致。后續需結合組學分析等多層次實驗鑒定每批次粉末中質量與成分是否保持均一。

目前，干細胞與多種化療藥在針對腫瘤的體內、外殺傷實驗中已經取得了良好的協同式互作效應［17］，但將hUMSC-CM 與TMZ 聯用治療膠質瘤的研究較少。本實驗將hUMSC-CM 與TMZ配伍作用于膠質瘤細胞探討其提高膠質瘤化療敏感性的可行性。同時，為了明確該聯合給藥法是否對膠質瘤具有廣譜性，本研究選用人星形細胞瘤U251 細胞、人膠質母細胞瘤LN-428 細胞和大鼠惡性膠質瘤RG-2 細胞3種膠質瘤細胞作為實驗對象，利用細胞活力分析和病理形態學觀察檢測膠質瘤細胞系對TMZ的化療敏感性差異。采用低、高兩種濃度的hUMSC-CM 與低、中、高三種濃度的TMZ 配伍，作用于膠質瘤細胞，探討聯合給藥的有效性。結果顯示，利用3 和9 g/L hUMSC-CM 與50、100 和200 μmol/L TMZ 配伍給藥，可顯著抑制膠質瘤細胞活力且呈現劑量依賴性，其中RG-2細胞最敏感，其次是U251和LN-428細胞，進而篩選出C9+T50 作為有效配伍給藥濃度。流式細胞術與TUNEL凋亡形態學結果表明，C9+T50可引起膠質瘤細胞周期阻滯并誘導凋亡發生。

近年來，關于GBM 的發病機制存在多種學說，如凋亡抑制［18-19］、細胞過度增殖等［20-21］。通過靶向調控GBM 細胞增殖和凋亡通路中的關鍵蛋白將有助于進一步發現治療新靶點［22-23］。caspase-8/caspase-3/PARP1 通路被發現是影響多種腫瘤細胞增殖、凋亡及DNA 修復的重要信號轉導通路之一［24-25］。其中，caspase-8 作為細胞凋亡發生的關鍵因子在人類膠質瘤中呈低表達，通過靶向上調caspase-8表達，或將成為治療膠質瘤的新方向，且已有部分靶向藥物取得了積極的效果［26］。而caspase-3 是caspase 家族中的核心蛋白，且被認為是細胞凋亡中最后的共同通道，在介導膠質瘤細胞凋亡的調控中也起到了重要作用［27］。PARP1 作為caspase-3 的底物與DNA 修復等有關。此外，自噬也參與了膠質瘤病理生理的重要調節過程。而關于自噬及其與hUMSC-CM 對膠質瘤細胞體外或體內敏感性的相關報道較少。為了探索hUMSC-CM 與TMZ 聯合用藥提高膠質瘤化療敏感度的分子機制，本研究探討了caspase-8/caspase-3/PARP1 信號通路及自噬蛋白beclin-1 和LC3 在其中的作用。結果表明，與單純化療組相比，C9+T50 可顯著上調膠質瘤細胞內凋亡啟動蛋白和凋亡執行蛋白的表達，增加PARP1 的剪切，誘導細胞凋亡，并通過上調自噬蛋白beclin-1 和LC3-II 的表達介導細胞發生自噬。后續研究需進一步分析hUMSC-CM 中細胞外囊泡中所含有的外泌體以及不同類型的細胞因子含量，探討各種活性成分在調控具有不同病理生理學特征的膠質瘤增殖及誘導膠質瘤細胞凋亡和自噬中分別起到何種作用。

綜上所述，hUMSC-CM 與TMZ 聯用可能通過caspase-8/caspase-3/PARP1 信號通路抑制膠質瘤細胞活力，誘導細胞凋亡，并可促進細胞自噬發生，達到協同增敏式互作效應。后續需結合動物體內實驗以深入探討聯合給藥對GBM 生物學行為的影響。在多層次的實驗基礎上hUMSC-CM 聯合化療的綜合方案將有潛力成為GBM治療中重要的補充手段。