著絲粒蛋白H在腎上腺皮質(zhì)癌的表達(dá)及對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞活力和遷移的影響*

鄒存茹， 王 丹， 張 玉， 劉呈悅， 蔣荷坪， 何文璽， 張鑫源， 蘇文霞△

（1山東第二醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2山東第二醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261031；3山東第二醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma， ACC）是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的罕見惡性內(nèi)分泌腫瘤，具有高度侵襲性。50%～60%的患者伴有類固醇激素分泌增加，表現(xiàn)為庫欣綜合征或男性化［1］。該病預(yù)后差，5 年總生存率約50%［2］。盡管ACC 是一種罕見腫瘤，發(fā)病率低，但由于疾病診斷時(shí)多為晚期，已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，因此仍是一種嚴(yán)重威脅人們健康的惡性腫瘤。

著絲粒蛋白（centromere protein， CENP）是在細(xì)胞分裂過程中起重要作用的一組蛋白。在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，CENP 銜接染色體與紡錘體微管的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控姐妹染色單體的準(zhǔn)確分離，保證細(xì)胞的精確復(fù)制［3］。CENP 表達(dá)異常或功能缺損會(huì)造成染色體丟失、易位，導(dǎo)致細(xì)胞核型異常和染色體不穩(wěn)定，從而使細(xì)胞生長失控，促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展［4-5］。

CENP-H 是CENP 家族的重要的成員之一，是活性著絲粒復(fù)合體的重要組成部分，與CENP-A 和CENP-C 一起定位于內(nèi)板，負(fù)責(zé)將著絲粒與紡錘體微管連接起來［6-7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CENP-H 在腫瘤中高表達(dá)，并與疾病進(jìn)展和預(yù)后顯著相關(guān)，靶向沉默CENP-H導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖抑制［8-13］。然而，目前CENP-H 在ACC 的表達(dá)水平、與疾病進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系以及沉默CENP-H對(duì)ACC 細(xì)胞活力和遷移的影響尚不清楚，本文旨在研究這些問題。

材料和方法

1 主要材料

胎牛血清購自HyClone；siRNA 及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；兔抗人CENP-H單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人GAPDH、p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-P38、t-P38、p-JNK1/2 和t-JNK1/2 單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 GEPIA2 數(shù)據(jù)庫 運(yùn)用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2. cancer-pku. cn/）［14］，分 析CENP-H 在76 例ACC患者和128例健康對(duì)照中的mRNA表達(dá)水平，分析其在不同TNM 分期ACC 患者中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其與ACC患者總體生存率（overall survival）之間的相關(guān)性。

2.2 UALCAN 數(shù)據(jù)庫 應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）［15］中的數(shù)據(jù)分析CENP-H 在不同TNM 分期ACC 患者的表達(dá)和預(yù)后。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 4 例ACC 和4 例正常腎上腺石蠟組織切片脫蠟，檸檬酸鈉沸液中抗原修復(fù)10 min，加入3%過氧化氫室溫孵育12 min，5%牛血清白蛋白封閉35 min，倒出封閉液后加入兔抗人CENP-H 單克隆抗體（1∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，顯微鏡下觀察二氨基聯(lián)苯胺顯色情況。蘇木精復(fù)染，分化、脫水、封片，采用綜合計(jì)分法進(jìn)行半定量分析。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人ACC 細(xì)胞系H295R 用含10%胎牛血清和1% Gibco? Insulin-Transferrin-Sele‐nium （ITS-G）的DMEM/F12 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的H295R細(xì)胞調(diào)整密度為1×105/mL，取2 mL 種于六孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度為30%～50%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑將終濃度為50 nmol/L 的CENP-HsiRNA （siCENP-H）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為si‐CENP-H 組和陰性對(duì)照（siNC）組。siCENP-H 的序列為5′-AACAAUUUCCUUAAGGGCAGGAUCC-3′；siNC的序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的H295R 細(xì)胞種于96孔板內(nèi)，每孔5 000個(gè)，siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（方法同前），于0、24、48、72 和96 h 檢測細(xì)胞活力。收獲前2 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)。置于搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長處測量各孔的吸光度（A）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后72 h 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，取2 mL 種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)進(jìn)行劃痕并更換培養(yǎng)液，用含1%胎牛血清和1% ITS-G的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24、48和72 h觀察細(xì)胞遷移情況并拍照記錄。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 收獲轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；經(jīng)10% SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入Ⅰ抗（GAPDH 和CENP-H 抗體，1∶1 000；p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-P38、t-P38、p-JNK1/2 和t-JNK1/2 抗體，1∶2 000），4 ℃孵育過夜；孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）；ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白的表達(dá)，掃描后用Gel-Pro Analyzer 軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照條帶灰度的比值，以及磷酸化MAPK 與總MAPK 條帶灰度的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GEPIA2 數(shù)據(jù)庫和UALCAN 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出的箱線圖、小提琴圖及生存曲線采用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中的統(tǒng)計(jì)分析方法，其中箱線圖數(shù)據(jù)的表達(dá)格式為中位數(shù)。使用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組定量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CENP-H mRNA 在ACC 中高表達(dá)且隨腫瘤分期表達(dá)升高

GEPIA2 數(shù)據(jù)庫 分 析了CENP-H 在76 例ACC 患者和128 例健康對(duì)照中RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)的差異（以TPM值衡量mRNA表達(dá)水平），發(fā)現(xiàn)CENP-H在ACC 中高表達(dá)（P<0.05），見圖1A、B。GEPIA2 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步檢測了CENP-H 在腫瘤不同TNM 分期患者中的表達(dá)，通過方差分析，發(fā)現(xiàn)CENP-H 在I、II、III和IV 期ACC 患者的表達(dá)存在顯著差異（F=5.82，P<0.01），見圖1C。UALCAN 數(shù)據(jù)庫顯示，CENP-H 在IV 期ACC 的表達(dá)顯著高于I、II 和III 期（P<0.05），見圖1D。以上結(jié)果表明，CENP-H mRNA 在ACC 中高表達(dá)且隨腫瘤分期表達(dá)升高。

Figure 1. The mRNA expression of CENP-H in adrenocortical carcinoma （ACC）. A and B： the mRNA expression of CENP-H in ACC patients（ n=77） and normal controls（ n=128） from GEPIA2 database； C： violin plots of CENP-H mRNA in different TNM stages of ACC patients from GEPIA2 database； D： the mRNA expression levels of CENP-H in different TNM stages of ACC patients from UALCAN database. TPM： transcripts per million. *P<0.05 vs normal； #P<0.05， ##P<0.01 vs stage IV.圖1 在ACC中CENP-H的mRNA表達(dá)

2 CENP-H高表達(dá)與ACC患者不良預(yù)后相關(guān)

GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析了CENP-H的mRNA 表達(dá)與ACC 患者總體生存率之間的相關(guān)性。CENP-H 高表達(dá)組患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)組（HR=4，P<0.01），見圖2A。UALCAN數(shù)據(jù)庫也顯示，與CENPH 低表達(dá)組相比，CENP-H 高表達(dá)組患者的總體生存率顯著降低（P<0.000 1），見圖2B。以上結(jié)果表明，CENP-H高表達(dá)與ACC患者不良預(yù)后相關(guān)。

Figure 2. Correlation of between CENP-H expression and prognosis of adrenocortical carcinoma（ ACC） patients. A： impact of CENPH expression on the overall survival of ACC patients in GEPIA2 database（ n=38）； B： impact of CENP-H expression on the survival probability of ACC patients in UALCAN database.圖2 CENP-H表達(dá)與ACC預(yù)后的相關(guān)性

3 CENP-H 蛋白在ACC 組織的表達(dá)水平高于正常腎上腺

CENP-H 為核內(nèi)蛋白，在4 例ACC 組織的陽性率為（4.7±0.5）%，在4例正常腎上腺的陽性率為（0.9±0.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3。這表明CENP-H 蛋白在ACC 組織的表達(dá)水平高于正常腎上腺。

Figure 3. The expression of CENP-H protein in adrenocortical carcinoma（ ACC） tissues. Immunohistochemical staining of paraffinembedded ACC and normal adrenal gland specimens was performed. Scale bar=20 μm. Red arrows indicate CENP-H posi‐tive cells. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normal group.圖3 CENP-H蛋白在ACC石蠟切片的表達(dá)

4 敲減CENP-H表達(dá)抑制H295R細(xì)胞活力和遷移

H295R細(xì)胞轉(zhuǎn)染siCENP-H后CENP-H蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.01），表明成功敲減H295R 細(xì)胞中CENP-H表達(dá)，見圖4。轉(zhuǎn)染siCENP-H 后24 h，H295R 細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著降低，隨著時(shí)間延長，在轉(zhuǎn)染后48、72 和96 h，與對(duì)照組的差距逐漸加大（均P<0.01），見圖5A。siCENP-H 組H295R 細(xì)胞的遷移率也較siNC 組顯著降低，隨著時(shí)間延長兩組的差距逐漸增大（均P<0.01），見圖5B。以上結(jié)果表明，敲減CENP-H表達(dá)可以抑制H295R 細(xì)胞活力和遷移能力。

Figure 4. The expression of CENP-H protein in H295R cells transfected with siCENP-H. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs siNC group.圖4 H295R細(xì)胞轉(zhuǎn)染siCENP-H后CENP-H蛋白的表達(dá)

Figure 5. Impact of CENP-H knockdown on the viability （A； CCK-8 assay） and migration （B； wound-healing assay） of H295R cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siNC group.圖5 敲減CENP-H表達(dá)對(duì)H295R細(xì)胞活力和遷移的影響

5 敲減CENP-H表達(dá)抑制MAPK信號(hào)通路的活化

H295R 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siCENP-H 后72 h，p-ERK1/2 與t-ERK1/2 的比值在siNC 組為0.64±0.13，在siCENPH 組為0.88±0.57，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.05）；p-P38 與t-P38 的比值在siNC 組 為0.90±0.02，在si‐CENP-H 組為0.75±0.06，siCENP-H 組顯著低于siNC組（P=0.02）；p-JNK1 與t-JNK1 的比值在siNC 組為0.92±0.04，在siCENP-H 組為0.52±0.20，siCENP-H組顯著低于siNC 組（P=0.03）；p-JNK2與t-JNK2的比值在siNC 組為0.81±0.17，在siCENP-H 組為0.36±0.16，siCENP-H 組顯著低于siNC 組（P=0.03），見圖6。這表明敲減CENP-H表達(dá)抑制P38 和JNK 信號(hào)通路的活化，其中抑制JNK 信號(hào)通路活化的效應(yīng)尤為顯著。

Figure 6. Impact of CENP-H knockdown on the activation of MAPK signaling pathways in H295R cells. The protein levels of p-ERK1/2， t-ERK1/2， p-P38， t-P38， p-JNK1/2 and t-JNK1/2 were detected by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs siNC group.圖6 敲減CENP-H表達(dá)對(duì)H295R細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響

討 論

已有研究發(fā)現(xiàn)CENP-H 在鼻咽癌、舌癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌和肝癌中高表達(dá)，且腫瘤體積越大、病理分級(jí)分期越高CENP-H 的表達(dá)也越高，CENP-H高表達(dá)的患者較低表達(dá)患者總體生存率降低。CENP-H是評(píng)估鼻咽癌、舌癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌和肝癌預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物［8-12］。我們研究發(fā)現(xiàn)ACC患者中CENP-H 的mRNA 和蛋白表達(dá)均高于健康對(duì)照，CENP-H mRNA隨腫瘤分期表達(dá)升高，CENP-H高表達(dá)患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)患者，提示CENP-H 高表達(dá)與ACC 患者不良預(yù)后相關(guān)，CENP-H是評(píng)估ACC患者預(yù)后的可靠標(biāo)志物。

CENP-H 在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的IV 期ACC 患者表達(dá)水平較腫瘤局限在腎上腺的I 期、II 期和近處轉(zhuǎn)移的III 期患者明顯升高，且CENP-H 高表達(dá)患者的生存率顯著降低，提示CENP-H 在ACC 腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。在肝癌細(xì)胞中，敲減CENP-H導(dǎo)致了細(xì)胞增殖抑制和集落形成能力降低，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡［13］。那么，CENP-H 對(duì)ACC 細(xì)胞生物學(xué)功能具有怎樣的影響呢？我們發(fā)現(xiàn)敲減ACC 細(xì)胞CENP-H的表達(dá)后細(xì)胞活力和遷移受到抑制，說明CENP-H 在增強(qiáng)ACC 細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞遷移中具有重要作用。

MAPK 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、發(fā)育、遷移等關(guān)鍵的信號(hào)通路。MAPK 分子包括ERK1/2、JNK1/2/3、P38 和ERK5，磷酸化的MAPK 分子具有活性，能夠進(jìn)一步激活與細(xì)胞生長、分化、發(fā)育、遷移等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為［16］。此外，MAPK 信號(hào)通路還參與了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。在前列腺癌細(xì)胞中敲減DLL3的表達(dá)可導(dǎo)致p-ERK1/2、p-JNK1 和p-P38 蛋白水平下降，而過表達(dá)DLL3導(dǎo)致p-ERK1/2、p-JNK1 和p-P38 蛋白水平升高，DLL3通過MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)了前列腺癌的增殖、遷移和侵襲［17］。在肺癌細(xì)胞中敲減CENP-H表達(dá)可導(dǎo)致p-ERK1/2 和p-P38 蛋白水平下降，其中p-P38 蛋白的下降尤為明顯，CENP-H通過ERK/P38信號(hào)通路調(diào)控肺癌的進(jìn)展和順鉑耐藥［18］。在本研究中，敲減ACC細(xì)胞CENP-H表達(dá)后p-ERK1/2 蛋白無明顯變化，p-P38 和p-JNK1/2 蛋白水平降低，以p-JNK1/2 蛋白的降低尤為顯著，表明敲減ACC 細(xì)胞CENP-H表達(dá)抑制了P38 和JNK 信號(hào)通路。在生理狀態(tài)下，P38 和JNK 信號(hào)通路主要參與炎癥、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)［19］。P38 和JNK 信號(hào)通路根據(jù)細(xì)胞類型的不同可能發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、分化、遷移等截然相反的生物學(xué)效應(yīng)，而在腫瘤細(xì)胞中，兩者可能通過促進(jìn)炎癥因子的釋放促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［20］。P38δ缺失抑制了小鼠皮膚癌細(xì)胞的增殖，因而P38 信號(hào)通路在小鼠皮膚癌進(jìn)展中具有重要作用［21］。我們的研究結(jié)果提示CENP-H 可能通過P38 和JNK 信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控ACC 細(xì)胞活力和遷移的作用，下一步需要在敲減CENP-H表達(dá)的同時(shí)加入P38 或JNK 激動(dòng)劑檢測細(xì)胞活力和遷移的改變，來明確CENP-H 是否經(jīng)由P38和JNK信號(hào)通路影響ACC細(xì)胞活力和遷移。

綜上所述，本研究通過分析ACC 患者和健康對(duì)照CENP-H mRNA 和蛋白水平的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)CENP-H 在ACC 患者高表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)CENP-H mRNA 隨腫瘤分期增加而表達(dá)升高，CENPH 高表達(dá)患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)患者。敲減ACC 細(xì)胞CENP-H表達(dá)，可減弱細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞遷移，并抑制P38 和JNK 信號(hào)通路的活化。本研究為評(píng)估ACC患者的預(yù)后提供了可靠的生物標(biāo)志物，并為ACC患者的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。