ATP5J通過TOMM20調節線粒體功能并促進人肝細胞癌細胞轉移*

冷君志， 王根旺， 劉 迪， 柳科軍， 王 琦， 惠永峰

（寧夏醫科大學總醫院肝膽外科，寧夏 銀川 750004）

肝細胞癌是一種常見的原發性肝癌，是全球第六大常見腫瘤?，F階段，如何尋找特異性和敏感性的基因，已經成為研究的關鍵。肝癌的發生涉及多基因相互作用，尤其是負責線粒體能量代謝過程中的線粒體合酶相關蛋白［1］。在眾多線粒體合酶蛋白中，ATP 合成酶H+轉運線粒體F0 復合體亞基F6（ATP synthase mitochondrial F0 complex H+trans‐porting， subunit F6， ATP5J）是F1F0-ATP 合酶的脂溶性成分F0的一個亞基，主要供線粒體內能量轉化傳導信息［2］。ATP 合酶相關蛋白在腫瘤能量代謝過程中發揮著關鍵作用，ATP5J是催化線粒體ATP 合成的關鍵基因。在胃癌研究中，富集于線粒體氧化呼吸鏈的ATP5J 蛋白表達顯著上調，影響細胞線粒體的氧化磷酸化功能［3］。有文獻報道，ATP5J在結腸癌組織中顯著高表達，且與5-氟尿嘧啶耐藥有關［4］。線粒體外膜轉位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20， TOMM20）負責識別和運輸前體蛋白，在多種腫瘤中高表達，可作為靶向線粒體的關鍵蛋白［5］。研究表明，TOMM20過表達增強結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的生物學行為，而降低TOMM20表達顯著抑制結直腸癌細胞的生物學行為［6］。然而，ATP5J 在肝癌細胞能量轉化中的作用以及與TOMM20 在肝癌細胞中的作用關系尚不明確。基于此，本項工作旨在闡明ATP5J 在肝癌細胞能量轉化中的作用，以及是否通過TOMM20 影響肝癌細胞轉移，從而為肝癌靶向治療的進一步研究提供參考。

材料和方法

1 細胞系

人肝癌細胞株（Li-7；目錄號：SCSP-5062）購買自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（https：//www.cellbank.org.cn/），所有細胞都在含有10%的胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養液（Gib‐co）中，并放置于含5% CO2的恒溫培養箱中培養。

2 主要試劑

培養細胞用的胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、DMEM 培養液購自Gibco；ATP5J 抗體（貨號：14114-1-AP）、TOMM20 抗體（貨號：11802-1-AP）和β-actin抗體（貨號：20536-1-AP）均購自Proteintech；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（貨號：ZB-2301）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1；貨號： M8650） 購自北京索萊寶科技有限公司；pCMV-Mito-AT1.03（線粒體 ATP 熒光探針）檢測試劑盒（貨號：D2606）、Actin-Tracker Green-488 （微絲綠色熒光探針）檢測試劑盒（貨號：C2201S）和活性氧檢測試劑盒（貨號：S0033S）、Li‐po8000?轉染試劑（貨號： C0533）均購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell 細胞培養小室購自Corning；ATP5J 過表達質粒［ID：498；克隆載體：pcD‐NA3.1（+）］購自上海生工生物工程股份有限公司。

3 方法

3.1ATP5J過表達質粒、小干擾序列模型的構建和實驗分組 取生長狀態良好的Li-7 細胞以每孔3×105個接種于6 孔板，隨機分為4 組，siRNA 陰性對照（siRNA-NC）組，過表達（overexpression，OE）空載體陰性對照（OE-NC）組，ATP5J過表達（ATP5J-OE）組和ATP5J小干擾RNA（ATP5J-siRNA）組。將ATP5J全長克隆到pcDNA3.1載體上，空載體（OE-NC）作為對照；構建三條干擾序列，篩選最佳轉染效果的序列作為實驗序列（ATP5J-siRNA：Sense：5′-GAGGACCU‐GUUGAUGCUAGUUTT-3′；Antisense：5′-AACUAG‐CAUCAACAGGUCCUCTT-3′。SiRNA-NC：Sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′； Antisense： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）。按照上海碧云天生物技術有限公司的轉染說明，將細胞在37 ℃和5% CO2下培養，細胞融合度達到80%時，使用Lipo8000 轉染試劑將過表達質粒和siRNA 序列轉染到細胞中，培養48 h后收集細胞，提取蛋白進行驗證轉染效果，實驗重復3次。

3.2 線粒體膜電位實驗 各組完成相應干預后，加入1 mL 細胞培養液和1 mL 提前配制好的JC-1 染色工作液，并于細胞培養箱中在37 ℃下孵育20 min。孵育結束后，吸出上清，用配制好的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌細胞 2 次，根據試劑盒說明，CCCP 作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。將試劑盒中的CCCP 按照1∶1 000 加入到細胞培養液中，稀釋至10μmol/L，處理細胞20 min。最后在熒光顯微鏡下觀察，使用Image J 軟件對圖像進行分析，實驗重復3遍，進行統計［7］。

3.3 線粒體ATP 熒光探針實驗 將Li-7 細胞接種于6 孔板，在37 ℃和5% CO2下培養，當細胞融合度達到80% 時，根據Lipo8000 說明書將pCMV-Mi‐toAT1.03 質粒轉染到各組細胞，并用熒光顯微鏡觀察、拍照，通過Image J 軟件對圖像進行分析［8］，實驗重復3遍，進行統計。

3.4 微絲綠色熒光探針實驗 根據Actin-Tracker Green-488 試劑盒說明書對Li-7 細胞進行微絲熒光成像，將細胞用4%甲醛溶液在室溫下固定20 min，用0.1% Triton X-100 的PBS 洗滌細胞3 次，每次5 min， 然后使用Actin-Tracker Green 染色試劑在37 ℃下避光孵育60 min，最后用DAPI對細胞核復染5 min（藍色）。在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，實驗重復3遍，進行統計［9］。

3.5 Transwell 實驗 將Li-7 細胞無血清饑餓24 h，制備細胞懸液。取細胞懸液200 μL 加入預鋪Matri‐gel 的Transwell 小室中。在24 孔板的下室中加入600 μL 的完全培養液，在37 ℃、5% CO2常規培養48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗2 遍，用棉簽擦去上室內的細胞。隨機取中央及四周5 個視野，倒置顯微鏡觀察隨機拍照、計數和統計，實驗重復3遍［10］。

3.6 Western blot實驗 使用RIPA 裂解緩沖液將細胞在冰上裂解20 min，用BCA 檢測試劑盒提取蛋白濃度，經SDS-PAGE 分離后轉移到PVDF 膜上。用5%的脫脂奶粉溶液在室溫下阻斷2 h，加入對應的Ⅰ抗在4 ℃下過夜，所用Ⅰ抗為ATP5J（1∶1 000）、TOMM20（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）。之后再用TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗IgG（1∶5 000）孵育1 h，采用ELC 發光液，β-actin 作為內參照，采用ImageJ 軟件進行條帶分析［11］，實驗重復3遍。

3.7 細胞內活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測 用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）來評估細胞內ROS 水平。按照1∶1 000 的比例用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使最終濃度為10 μmol/L，將各組細胞與DCFH-DA 工作液在37 ℃下孵育20 min［12］，僅在陽性對照孔中加入Rosup 作為陽性對照。使用熒光顯微鏡觀察熒光強度，隨機拍照，實驗重復3遍。

4 統計學處理

使用SPSS 23.0進行數據分析，計量數據采用均值±標準差（mean±SD）表示，柱狀圖采用GraphPad Prism 8.0 軟件制作，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 構建和驗證ATP5J過表達、siRNA序列轉染效果及ATP5J 對肝癌細胞線粒體膜電位水平、線粒體ATP產生的影響

本實驗合成三條ATP5J-siRNA（ATP5J-siRNA1、ATP5J-siRNA2 和ATP5J-siRNA3）序列進行轉染，顯示ATP5J-siRNA3 轉染效果較為顯著（P<0.01），后續作為實驗序列，見圖1A。過表達質粒亦能顯著增加ATP5J蛋白的表達（P<0.01），轉染效果見圖1B。

Figure 1． Verification of ATP5J overexpression and knockdown efficiency using Western blot. A： the protein level of ATP5J was de‐tected by Western blot after knockdown of ATP5J； B： the protein level of ATP5J was detected by Western blot after ATP5J overexpression. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC.圖1 應用Western blot驗證ATP5J過表達、敲減轉染的效果

線粒體ATP 熒光探針實驗結果顯示，與OE-NC組相比，過表達ATP5J 顯著上調線粒體ATP 熒光強度（P<0.01），而敲減ATP5J與之相反（P<0.01），見圖2A。線粒體膜電位實驗結果顯示，與OE-NC 組相比，過表達ATP5J顯著上調線粒體膜電位水平（P<0.01），敲減ATP5J后，線粒體膜電位水平顯著降低（P<0.01），見圖2B。

Figure 2. Effects of ATP5J on mitochondrial membrane potential and mitochondrial ATP fluorescence intensity in hepatoma carcino‐ma cells. A： compared with OE-NC group， the fluorescence intensity of ATP in ATP5J-OE group was significantly in‐creased； ATP5J siRNA significantly decreased the fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20μm. B： compared with OE-NC group， the red fluorescence intensity in ATP5J-OE group was significantly increased；ATP5J siRNA significantly decreased the red fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC； △△P<0.01 vs positive control.圖2 ATP5J對肝癌細胞線粒體ATP熒光強度、線粒體膜電位水平的影響

2 ATP5J調節肝癌細胞ROS生成，并重塑細胞骨架

活性氧檢測結果顯示，與OE-NC組相比，過表達ATP5J可下調ROS 生成（P<0.01）；相比較于siRNANC 組，敲減ATP5J后，ROS 水平顯著升高（P<0.01），見圖3A。微絲綠色熒光探針檢測顯示，過表達ATP5J可促進肌動蛋白絲排布及空間構象重塑，驅動細胞膜前端形成突起（P<0.01）；敲減ATP5J可抑制肌動蛋白絲的重塑和細胞膜前端突起（P<0.01）。見圖3B。

Figure 3．ATP5J regulates ROS production and remodels the cytoskeleton in hepatoma carcinoma cells. A：compared with OE-NC group， the intensity of fluorescence in ATP5J-OE group was significantly decreased； ATP5J siRNA significantly increased the fluorescence intensity compared with siRNA-NC group， scale bar=20 μm. B： compared with OE-NC group， fluores‐cence intensity of microfilaments in ATP5J-OE group was significantly increased； ATP5J siRNA significantly decreased the fluorescence intensity of microfilaments compared with siRNA-NC group， scale bar=20 μm. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC； △△P<0.01 vs Rosup.圖3 ATP5J調節肝癌細胞ROS生成，并重塑細胞骨架

3 ATP5J 可調節肝癌細胞的侵襲能力，并調節TOMM20表達影響肝癌細胞線粒體功能

Transwell 實驗結果顯示，過表達ATP5J顯著促進Li-7 細胞的侵襲能力（P<0.01）。敲減ATP5J后，肝癌細胞侵襲能力減弱（P<0.01）。見圖4A。

Figure 4. ATP5J regulates the ability of invasion and the expression of TOMM20 in hepatoma carcinoma cells. A： compared with OENC group， the numbers of invasion cells in ATP5J-OE group were significantly increased， ATP5J siRNA significantly de‐creased the numbers of invasion cells compared with siRNA-NC group， scale bar=50 μm. B： compared with OE-NC group，Western blot results showed that TOMM20 protein expression in ATP5J-OE group was increased； ATP5J siRNA signifi‐cantly decreased TOMM20 protein expression compared with siRNA-NC group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC； ##P<0.01 vs siRNA-NC.圖4 ATP5J可調節肝癌細胞的侵襲能力，并調節TOMM20表達

Western blot 實驗結果顯示，過表達ATP5J后TOMM20 的表達增多（P<0.01），敲減ATP5J可顯著降低TOMM20蛋白的表達水平（P<0.01），見圖4B。

討 論

在肝癌發展過程中，低效的診斷策略和有限的治療靶點是臨床醫生面臨的主要困難。隨著研究的深入，觀察到線粒體能量代謝相關蛋白影響著肝癌的進展。線粒體ATP 合酶的異常表達在腫瘤能量代謝過程中起著重要作用［13］。本研究旨在探索線粒體ATP 合酶ATP5J 通過TOMM20 調節線粒體膜電位水平和線粒體ATP 產生介導細胞骨架重塑影響肝癌細胞轉移的作用機制。

有研究表明，結直腸癌細胞中ATP5J 表達上調可增強細胞遷移和5-氟尿嘧啶耐藥性，下調ATP5J可逆轉這一反應［2］。胃癌研究中，胃癌組織與癌旁組織相比差異顯著的基因（包括ATP5J等）主要富集于線粒體氧化呼吸鏈，線粒體膜電位水平高低介導胃癌細胞ROS 的生成，兩者相互作用影響細胞凋亡的發生［3］。研究顯示，通過調節ROS 水平可影響肺癌細胞的轉移能力［14］。本實驗觀察到ATP5J 可影響肝癌細胞ROS 的產生，此結果與上述的研究結果相似，這為了解ATP5J 在肝癌進展中的作用提供新參考。重要的是，實驗觀察到ATP5J 可調節線粒體膜電位水平，進一步表明ATP5J 是調節肝癌細胞線粒體功能的關鍵指標之一。綜上，推測ATP5J 是細胞能量代謝和ROS產生的重要介質。

在腫瘤轉移過程中，線粒體ATP 和線粒體膜電位水平的升高，可顯著增強腫瘤細胞能量轉換，這無疑給腫瘤的治療帶來了挑戰［15］。針對大量的線粒體功能蛋白，僅有少數的蛋白在腫瘤治療中有研究意義［16］。ATP5J 是ATPase 的一部分，在能量轉化過程中至關重要，有研究顯示ATP5J 表達水平的變化可控制肌肉中的能量代謝和線粒體表型［17］。在結直腸癌研究中，下調ATP5J 表達會減弱結腸癌細胞遷移，提示ATP5J 成為結直腸癌患者預后的一個重要因素［4］。敲低ATP5J表達可增強耐藥細胞對靶向藥物治療的敏感性［18］。Yang 等［19］研究表明，雌二醇通過抑制雌激素受體β （ERβ）與ATP5J 的相互作用，從而抑制JAK1-STAT6信號通路，抑制肝癌進展。本實驗結果顯示，過表達ATP5J可顯著上調線粒體膜電位水平、促進線粒體ATP 產生，介導細胞骨架重塑，增強肝癌細胞侵襲能力；然而，敲減ATP5J則出現相反的作用。總之，ATP5J 可能通過調節線粒體膜電位和線粒體ATP 產生重塑細胞骨架，影響肝癌細胞轉移。本研究結果與Lusby等［20］的觀點描述相似，也表現出ATP5J 在腫瘤細胞侵襲中的作用。但是與Yang 團隊闡述的角度不同，本實驗主要從線粒體功能、能量代謝到細胞骨架重塑的角度，揭示了ATP5J在肝癌細胞轉移中的作用。腫瘤細胞生物學行為離不開能量供應，本研究從細胞實驗中觀察到肝癌細胞能量代謝途徑的相關因子——ATP5J，這為研究肝癌發展和靶向治療方案提供參考依據。未來將深入開展ATP5J在肝癌細胞代謝中的作用。

TOMM20 在肝癌組織中高表達，可促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移［21］。在人軟骨肉瘤細胞中，過表達TOMM20 可誘導軟骨肉瘤腫瘤在體內生長，表明TOMM20 在軟骨肉瘤細胞增殖、細胞凋亡抵抗和化療抵抗中的作用［5］。本實驗結果顯示，ATP5J可調節肝癌細胞TOMM20 表達，ATP5J 具有介導肝癌細胞侵襲、調節線粒體膜電位和ROS的作用，而在這個過程中觀察到，ATP5J 可能通過TOMM20 調節線粒體功能和線粒體ATP 產生，介導細胞骨架重塑影響肝癌細胞轉移。ATP5J 對TOMM20 的調節作用為肝癌細胞能量代謝機制提供了新的參考，推測這種作用關系與肝癌進展有關。

綜上，ATP5J 可調節肝癌細胞線粒體能量轉化，其可能通過TOMM20 調節線粒體膜電位水平和線粒體ATP產生介導細胞骨架重塑影響肝癌細胞轉移。