姜黃素通過下調(diào)HO-1/NQO1保護肝癌模型小鼠*

牟海軍， 陳幸幸， 劉安安， 張 麗， 朱加興， 金 海

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院，遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是世界上第六大常見癌癥［1］。其發(fā)病率和死亡率占我國惡性腫瘤前5 位［2］。HCC 的發(fā)生發(fā)展是一個慢性多階段的病理過程，并且伴隨各種基因的改變。抗腫瘤藥物的作用機制也是多種多樣，中藥因其藥效多樣，副作用少，增強免疫力且不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點，在腫瘤治療方面一直是人們關(guān)注的熱點。姜黃素是中藥材姜黃中含有的一種天然抗氧化物質(zhì)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、清除氧自由基、抑制腫瘤生長，還具有較強的抗病毒和肝功能保護作用［3-4］。近期研究顯示，姜黃素可能同時作用于多條信號通路發(fā)揮抗癌作用。對前列腺癌［5］、結(jié)直腸癌［6］、肺癌［7］等疾病均有較好的作用，在腫瘤的防治具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，DEN）聯(lián)合四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）誘導(dǎo)C57BL/6J 小鼠肝癌模型，以觀察姜黃素對小鼠肝癌模型發(fā)生發(fā)展的影響，并探究其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠30 只（雌性20 只，雄性10只），5周齡，體重19～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。動物均飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物中心，環(huán)境溫度（22±2） ℃、濕度50%±10%、明暗周期 12 h/12 h，自由攝食和飲水。動物實驗經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品及主要試劑 姜黃素（純度≥75.0%； CAS：458-37-7； CB0346）購自上海生工生物工程股份有限公司；DEN（N0756）購自Sigma；CCl4（C11605036）購自上海麥克林生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AQ601）、熒光PCR 擴增酶（AE311）和β-actin 抗體（HC201）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、NAD（P）H-醌氧化還原酶1［NAD（P）H-quinone oxidoreductase 1，NQO1］和β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計及合成；HO-1 抗體（ab13248）購自Abcam；NQO1 抗體（BM4978）和Ki67 抗體（A00254）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 5849R 型高速冷凍離心機（Eppen‐dorff）；Icycler IQ 實時熒光定量PCR 儀、GelDoc 型電泳凝膠成像分析儀和DDY-10 型電泳儀（Bio-Rad）；IX53+DP73 倒置顯微鏡（Olympus）；AU680 全自動生化儀（Beckman）。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取233、466 和932 mg 姜黃素，分別加入17.5 mL 純凈水?dāng)嚢杌靹颍⑻沾裳欣彅嚢柩心セ靹驗榛鞈乙海? ℃冰箱保存，每周制備1次。

2.2 動物分組與模型建立 按雌雄比例為2∶1分籠飼養(yǎng)繁殖，取繁殖雄性幼鼠40只，出生后第14天一次性腹腔注射DEN（25 mg/kg），第4 周將小鼠斷乳飼養(yǎng)并隨機分為模型組和藥物組（低、中、高劑量分別為100、200和400 mg/kg），每組10只。另取同齡雄性小鼠10只作為正常對照。從第8周開始，模型組和藥物組灌胃給予CCl4（0.5 mL/kg），每周2 次；藥物組以灌胃方式給予不同劑量姜黃素，每天1次（10 mL/kg）。

2.3 標(biāo)本采集 第22 周末次給藥后小鼠禁食不禁水，24 h 后稱重，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后眼球取血，1 000×g離心15 min，分離血清?80 ℃保存，切取肝左葉部分組織用10%福爾馬林固定，其余肝臟組織?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 肝臟組織巨檢 小鼠肝臟取出后生理鹽水洗凈拍照，觀察小鼠肝臟表面，比較各組癌結(jié)節(jié)數(shù)量。

2.5 肝臟組織病理學(xué)觀察 福爾馬林固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋切片和HE 染色，光鏡下觀察并拍照，觀察小鼠肝臟組織病變。

2.6 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性的檢測 采用全自動生化儀測定血清中AST和ALT活性，按試劑盒說明書操作。

2.7 RT-qPCR 檢測HO-1 和NQO1 mRNA 表達 取相同部位肝臟組織約50 mg，加入1 mL Trizol UP 組織勻漿裂解，按照試劑盒說明書提取純化RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行PCR 擴增，擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參照，采用2?ΔΔCt法計算HO-1 和NQO1 的mRNA 相對表達水平。NQO1 的上游引物序列為5′-GCA GAT CCT GGA AGG ATG GA-3′，下游引物序列為5′-GGT TGT CAGC TGG AAT GGA C-3′；HO-1 的上游引物序列為5′-TGT CTG AGG CCT TGA AGG AG-3′，下游引物序列為5′-CAG GGC CGT GTA GAT ATG GT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG A-3′，下游引物序列為5′-GCC GGA CTC ATC GTA CTC C-3′。

2.8 Western blot 檢測HO-1 和NQO1 蛋白表達取相同部位肝臟組織約100 mg，將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，采用BCA 法測定蛋白含量，并定量為5 g/L，配置10% SDS-PAGE 凝膠，每個樣本點樣10 μL，分離組織總蛋白并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，分別與HO-1、NQO1 和β-actin 抗體（1∶1 000）孵育過夜，次日用TBST 洗膜（每次15 min，洗3 次）后，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶2 000）反應(yīng)，洗滌Ⅱ抗（每次15 min，洗3次），經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，ImageJ軟件測定條帶灰度值，計算目的蛋白與β-actin 條帶灰度值之比，即為目的蛋白的相對表達量。

2.9 免疫組化檢測Ki67 蛋白表達 取包埋組織切片，按照二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明進行操作。為定量分析Ki67 陽性細(xì)胞，每張染色切片在顯微鏡下隨機取5 個視野拍照并計數(shù)陽性細(xì)胞，觀察到呈現(xiàn)棕褐色的為Ki67 陽性細(xì)胞，采用陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比來表示表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 7.03 軟件進行統(tǒng)計。計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠一般情況比較

至實驗結(jié)束，模型及藥物干預(yù)組小鼠肝臟100%成瘤且均無中途死亡。實驗中后期模型及藥物干預(yù)組小鼠開始精神萎靡，進食減少，體重增加緩慢且小于正常對照組。與正常對照組比較，模型組小鼠體重及增重顯著降低（P<0.01），與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠體重及增重均顯著升高（P<0.01）；與正常對照組比較，模型組小鼠肝重及肝臟指數(shù)顯著升高（P<0.01），與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠肝重及肝臟指數(shù)均無顯著變化（P>0.05），見表1。

表1 小鼠體重、增重、肝重及肝臟指數(shù)的比較Table 1. Comparison of body weight， weight gain， liver weight and liver index of the mice （Mean±SD. n=10）

2 肝臟形態(tài)學(xué)變化

由圖1 可見，正常組小鼠肝臟表明光滑、色澤紅潤、質(zhì)地細(xì)膩，沒有出現(xiàn)增生結(jié)節(jié)；模型組小鼠肝臟色澤暗淡，邊緣不整齊，可見表面出現(xiàn)大小不一質(zhì)地較硬的白色圓形癌結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)切面有壞死及出血；給予姜黃素后，小鼠肝臟也可見白色癌結(jié)節(jié)，但與模型組相比，癌結(jié)節(jié)數(shù)量及大小明顯減小。

Figure 1. Macroscopic examination of mouse livers. A： control group； B： model group； C： curcumin（ 100 mg/kg） group； D： cur‐cumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖1 小鼠肝臟外觀

3 肝臟癌結(jié)節(jié)數(shù)量

通過圖片觀察肝臟，以直徑2 mm 和5 mm 為界，計數(shù)肝臟正反表面癌結(jié)節(jié)數(shù)量。由表2 可見，與模型組比較，給予姜黃素后小鼠肝臟癌結(jié)節(jié)總數(shù)及小于2 mm 癌結(jié)節(jié)數(shù)量均顯著減少（P<0.05 或P<0.01），大于2 mm癌結(jié)節(jié)數(shù)量均無顯著差異。

表2 小鼠肝臟癌結(jié)節(jié)數(shù)Table 2. The numbers of tumor nodules in mouse livers （Mean±SD. n=10）

4 血清ALT和AST活性

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT 和AST 活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量姜黃素組小鼠血清ALT 活性無顯著變化，而AST活性均顯著降低（P<0.01），見表3。

表3 小鼠血清ALT和AST水平Table 3. The serum levels of ALT and AST in mice （U/L. Mean±SD. n=10）

5 肝組織病理學(xué)

HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝索排列整齊；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，有多處壞死并伴有炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)大量大小、形狀不一不規(guī)則排列的細(xì)胞核；與模型組相比，各姜黃素組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞變性程度明顯減輕，肝癌細(xì)胞排列相對有序，見圖2。

Figure 2. HE staining results of paraffin sections of the mouse liver（ scale bar=20 μm）. A： control group； B： model group； C： cur‐cumin（ 100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖2 小鼠肝臟石蠟切片HE染色結(jié)果

6 肝組織中HO-1和NQO1的mRNA表達水平

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中HO-1和NQO1的mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中劑量姜黃素組小鼠肝組織中HO-1 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05），高劑量姜黃素組小鼠肝組織中NQO1 的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

Figure 3. The mRNA expression levels of HO-1（ A） and NQO1（ B） in mouse livers. Mean±SD. n=10. #P<0.05 vs control group； *P<0.05 vs model group.圖3 小鼠肝臟HO-1和NQO1的mRNA表達水平

7 肝組織中HO-1和NQO1蛋白表達水平

Western blot實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組HO-1 和NQO1 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，中劑量姜黃素組小鼠肝組織中HO-1 和NQO1 蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），高劑量姜黃素組小鼠肝組織中NQO1 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression levels of HO-1 and NQO1 in mouse livers. Mean±SD. n=10. ##P<0.01 vs control group； *P<0.05 vs model group.圖4 小鼠肝臟HO-1和NQO1蛋白表達水平

8 肝組織Ki67蛋白的免疫組化染色

免疫組化染色結(jié)果（圖5）顯示，正常對照組、模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組小鼠肝組織中Ki67陽性表達率分別為（1.55±0.05）%、（63.24±5.42）%、（38.32±2.98）%、（40.68±3.52）%和（35.46±3.79）%。低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中Ki67 陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），給藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

Figure 5. Immunohistochemical staining of Ki67 in mouse livers（ scale bar=50 μm）. A： control group； B： model group； C： curcumin（100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.圖5 小鼠肝臟Ki67免疫組化染色

討 論

本研究使用DEN 聯(lián)合CCl4誘發(fā)的肝癌模型，100%的小鼠在5 個月大時出現(xiàn)肝臟腫瘤，且對肝臟致癌有較好的專一性。肝臟是藥物代謝的主要器官，DEN 具有較強的肝毒性，可誘導(dǎo)急性肝毒性和肝細(xì)胞DNA 損傷［8］，可誘導(dǎo)肝內(nèi)炎癥發(fā)生，損傷肝細(xì)胞，造成肝組織纖維化，繼而發(fā)生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性增生及肝硬化，最后誘發(fā)肝癌。將DEN 與CCl4聯(lián)合使用誘導(dǎo)肝癌，可縮短造模時間，降低小鼠死亡率，其病變過程與人類肝癌病程相似，因而被廣泛用于肝癌的臨床及基礎(chǔ)研究中。

Ki67是惡性腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，表達越高，說明腫瘤細(xì)胞處于快速分裂期，增殖快，惡性程度較高。血清ALT 和AST 水平是評價肝功能損害的重要指標(biāo)。當(dāng)肝功能損害發(fā)生時血清ALT 和AST 活性也會大幅升高。本研究結(jié)果提示DEN 聯(lián)合CCl4可明顯誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生，給與姜黃素干預(yù)后，小鼠肝臟Ki67表達顯著降低，同時血清AST 活性也顯著降低，提示姜黃素對DEN 聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)的肝癌模型小鼠有保護作用。

大多數(shù)HCC在慢性肝臟炎癥的背景下發(fā)展。氧化應(yīng)激被認(rèn)為在HCC 發(fā)展的發(fā)病機制中起主要作用［9-10］。Nrf2-Keap1信號通路被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激機制之一。當(dāng)細(xì)胞受毒物刺激時，Nrf2從Keap1中解偶聯(lián)進入細(xì)胞核內(nèi)，通過調(diào)控下游抗氧化分子如HO-1、NQO1 等的表達，從而抵抗氧化應(yīng)激損傷［11-13］。本研究顯示DEN 聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)小鼠肝癌形成，小鼠機體快速啟動氧化應(yīng)激形成自我保護，導(dǎo)致模型組小鼠肝臟HO-1 和NQO1 蛋白表達大幅度增加，但HO-1 和NQO1 過度表達將產(chǎn)生過多的Fe2+和CO，過多的Fe2+和CO 會一定程度地加大細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力，損傷線粒體［14］，破壞細(xì)胞完整性［15］，因此過度表達的HO-1 和NQO1 反而有細(xì)胞毒性作用。而給予姜黃素后，小鼠肝臟HO-1 和NQO1 蛋白表達較模型組顯著降低，將細(xì)胞內(nèi)HO-1 和NQO1 蛋白表達控制在一定范圍內(nèi)，保障了Nrf2-Keap1 信號通路更好地發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，因此姜黃素對于肝癌小鼠Nrf2-Keap1 信號通路平衡的調(diào)節(jié)值得進一步研究。