茯苓多糖通過SQLE/NLRP3/GSDMD信號通路調控肝癌細胞焦亡*

楊 瑩， 曹 媛， 趙 佼， 李 政， 王 群， 高 浩，孫小扉， 袁明殿， 宋 囡△

（1遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽 110801；3遼寧省中醫(yī)院，遼寧 沈陽 110033）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，全世界約55%的肝癌病例來自中國，致死率在惡性腫瘤中排名第二，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害患者生命健康［1-4］。《局方發(fā)揮》：云“自積成痰。”《外科正宗·癭瘤論》指出，瘤的病因“全是痰氣凝結而成”。現(xiàn)代病機研究從宏觀視角和微觀角度明確了“痰”是肝癌產(chǎn)生的物質基礎，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，痰濁和血脂的代謝異常之間亦含有一定關系。《證治匯補》有云，“脾虛不運清濁，停留津液而痰生”，說明肥甘不節(jié)飲食會導致脾運化失常，攝入的水谷不能正常吸收，轉輸，布散化為精微，痰濁內生，故脾失運化為血脂異常的根本原因。故治療上，從肝、脾入手，以條達肝之疏泄，健運脾之水谷精微，化痰祛瘀等法為主。

茯苓是我國傳統(tǒng)中藥材，具有健脾益中，化痰燥濕之功效［5］。余靜芳等［6］應用茯苓四逆湯聯(lián)合索拉菲尼治療晚期原發(fā)性肝癌的結果顯示，茯苓益氣健脾，配伍方劑中其他中藥治療可改善患者的免疫功能從而提高患者自身的抗腫瘤作用。溫曉麗等［7］認為黃芪四君子湯中茯苓化痰燥濕，健脾和胃，提升正氣效果進一步增強，可改善HCC 肝切除術后肝功能和免疫功能，提高治療效果。茯苓多糖是茯苓的主要成分，占茯苓干重的80%，具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調節(jié)等藥理作用［8-9］，但目前有關茯苓及其有效成分治療肝癌的具體機制鮮有報道。同時脂代謝異常與細胞焦亡存在聯(lián)系。文獻表明，過量膽固醇在胞質內形成結晶可直接活化核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligo‐merization domain-like receptor protein 3， NLRP3），調控細胞焦亡［10］；膽固醇代謝通路中的SCAP-SREBP2與NLRP3 炎癥小體活化間亦存在相互調控關系［11］。故本研究欲以脂代謝為切入點，探討茯苓多糖調控肝癌細胞焦亡的作用機制。

材料和方法

1 主要儀器和試劑

NanoQuant Infinite M200 Pro 酶標儀（TECAN）；ND5000 超微量紫外分光光度計（BioTeke）；T100?PCR 儀（Bio-Rad）；QuantStudio 3 PCR 擴增儀（Ther‐mo Fisher）；Tanon 5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

茯苓多糖（C25F7Y10033）購自上海源葉生物科技有限公司；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；HiFi-Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit（CW2582）和UltraSYBR Mixture（CW2601）購自康為世紀生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（20220829）購自杭州弗德生物科技有限公司；角鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase， SQLE）抗體（22915-1-AP）和caspase-1 抗體（12544-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；消皮素D N 端片段（gasdermin D Nterminal fragment， GSDMD-N）抗體（DF12275）購自Affinity；NLRP3 抗體（bs-23723R）購自博奧森生物技術有限公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑（20211007）、CCK-8 試劑盒（508E011）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活性檢測試劑盒（BC0685）、人白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA 試劑盒（SKEH-0002）和人IL-18 ELISA 試劑盒（SKEH-0028）購自北京索萊寶生命科技有限公司。

2 實驗標本

收集2020 年6 月～2021 年4 月期間在遼寧省腫瘤醫(yī)院肝膽普外科確診并接受外科手術治療的HCC患者9 例，得到HCC 組織和對應癌旁組織（距腫瘤2 cm）新鮮樣本9對，置于液氮保存。其中男性5例，女性4 例，年齡42～71 歲，中位年齡56 歲，按照Edmond‐son-Steiner標準，Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ級分別有4和5例，所有患者術前均未接受放、化療等抗腫瘤治療。本研究通過遼寧省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，采集樣本的受試者均已簽署書面知情同意書。人HCC細胞系HepG2購于中國科學院上海生命科學院細胞庫。

3 主要方法

3.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載基因芯片GSE84402 數(shù)據(jù)集，并用其分析工具GEO2R analysis對數(shù)據(jù)進行初步分析并篩選肝癌差異表達基因（dif‐ferentially expressed genes， DEGs；篩選標準為Padj<0.05，|log2FC|>2）。

3.2 脂代謝DEGs 篩選 （1）利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對HCC 的DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析。KEGG 確定其通路功能，GO 分析生物學過程。（2）同時利用GSEA 數(shù)據(jù)庫逐條篩選脂代謝相關基因，并與GEO篩選出的肝癌DEGs進行交集。

3.3 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建 將篩選出的脂代謝DEGs 放入韋恩圖中取交集，再輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中，以combined score>0.4 為PPI 顯著，構建出PPI 網(wǎng)絡圖，再用Cyto‐scape軟件進行可視化分析。

3.4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫驗證DEGs 使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫驗證上述膽固醇代謝通路上DEGs 的表達情況。該數(shù)據(jù)庫包含TCGA 和GETx 數(shù)據(jù)庫常見惡性腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)。將DEGs放入其中，在“Boxplot”模塊中設置∣log2FC∣=1，Pvalue=0.01。

3.5 DEGs 預后生存分析 應用GEPIA 和KM-plot‐ter數(shù)據(jù)庫分別對上述篩選出的基因表達水平與肝癌患者總體生存率之間進行分析。進入GEPIA 數(shù)據(jù)庫后，在survival analysis 界面設置Gene 為篩選出的DEGs，Datasets 為LIHC，輸出即可。進入KM-plotter數(shù)據(jù)庫后，在liver cancer RNA-seq 界面設置Gene symbol 為篩選出的DEGs，其他檢索條件設置為默認狀態(tài)即可。

3.6 RT-qPCR 檢測mRNA 表達水平 HepG2 細胞、HCC 組織及癌旁組織加入TriQuick 試劑裂解，提取總RNA 并檢測濃度和純度。按照反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，反應條件為：50 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min。使用2× SYBR Green qPCR Master Mix進行qPCR 擴增，反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH 為內參照，通過2?ΔΔCt法分析mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.7 藥物配制 稱取茯苓多糖0.16 g 融于100 μL DMSO，加入10 mL 培養(yǎng)液配制成濃度為16 g/L 的母液并過細胞濾器，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.8 細胞培養(yǎng) HepG2 細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長至90%后取出，棄去培養(yǎng)液，4 mL PBS 清洗3次，1 mL 胰酶消化，2 mL 培養(yǎng)液終止消化，250×g離心3 min，棄上清，傳代。

3.9 CCK-8 法檢測細胞活力 每孔1×105個細胞接種于96 孔板，待細胞貼壁后，加入茯苓多糖濃度為0、25、50、100、200、400、800 和1 600 mg/L 的培養(yǎng)液，每組設置5個平行孔，分別在24、48和72 h向各孔加入10 μL 的CCK-8 檢測液，37 ℃孵育顯色，酶標儀檢測OD值，計算抑制活力。

3.10 劃痕實驗測各組細胞遷移能力 將HepG2細胞接種于6 孔板中，細胞貼壁后，用移液槍頭尖端在孔板底部劃出一條細痕，PBS 清洗后不同條件繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度。運用ImageJ軟件計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=（0 h 劃痕面積?培養(yǎng)后劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

3.11 細胞轉染 6 孔板中每孔接種1×105個細胞，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，根據(jù)MOI=50來計算所需病毒體積，將其溶于1 mL 完全培養(yǎng)液中，加入6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)并注意觀察細胞形態(tài)；在細胞感染后48～72 h，細胞密度達到60%～80%，更換培養(yǎng)液為含嘌呤霉素的培養(yǎng)液，使終濃度為0.5 mg/L，12 h 后半量換液，24 h 后全量換液，期間觀察細胞篩選情況，可適當調整篩選時間；熒光顯微鏡下觀察感染效率，達到80%以上可用于后續(xù)實驗。

3.12 Western blot檢測蛋白表達水平 樣本加入蛋白裂解液提取蛋白，根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1h，洗膜。裁剪目的條帶，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，曝光，保存條帶并用ImageJ軟件對灰度值進行分析。

3.13 比色法檢測LDH活性 先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）∶提取液體積（mL）為（500～1 000）∶1的比例，超聲波破碎細胞，在4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清。對照管、測定管和標準管按照試劑說明書加入待測樣本、標準液、試劑一、試劑二、試劑三、試劑四及蒸餾水，37 ℃水浴15 min。450 nm下測定吸光度并計算。

3.14 ELISA 法檢測細胞上清中IL-1β 和IL-18 釋放情況 將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，4 ℃、1 000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP 管內，按照相應試劑說明書分別設定標準孔、調零孔和樣本孔，加入樣本或標準品后，孵育、洗滌、加生物素化檢測抗體、孵育、洗滌、加酶結合物、孵育、洗滌、加底物顯色及終止液。450 nm下測定吸光度并計算。

3.15 流式細胞術 將各組細胞500×g離心5 min后收集，小心吸除上清，用PBS 洗滌細胞2 次，500×g離心5 min收集細胞，小心吸除上清，殘留約50 μL左右的PBS，每管細胞樣品中加入500 μL 染色緩沖液輕輕重懸細胞；加入5 μL annexinV-FITC 混勻后，加入5 μL PI，混勻；室溫避光孵育15 min；隨即進行流式檢測。

4 統(tǒng)計學分析

各組實驗均取重復3 次的平均值。采用Graph‐Pad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 生信分析篩選DEGs

1.1 DEGs 的篩選 使用GEO 數(shù)據(jù)庫獲取HCC 基因數(shù)據(jù)集GSE84402，其中包括上調基因（紅色）238個，下調基因（藍色）380 個，黑色為其中表達不顯著的基因（圖1A）；圖1B為前40個DEGs的表達熱圖。

Figure 1. Volcano plot and heatmap of differentially expressed genes in liver cancer. A： volcano plot showed differentially expressed genes； B： heatmap showed top 40 differentially expressed genes.圖1 差異表達基因的火山圖和熱圖

1.2 DEGs 的GO 和KEGG 富集分析 使用DAVID軟件對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示，這些DEGs主要參與脂質、膽固醇、類固醇等代謝過程。KEGG通路分析顯示，這些差異基因主要參與代謝、細胞周期等信號通路。根據(jù)GO 分析中的生物學過程結果找出脂代謝相關通路（圖2A），整理得到脂代謝相關基因37 個，同時KEGG 結果顯示其主要富集在細胞周期和代謝途徑等信號通路（圖2B）。GSEA 逐條篩出肝癌脂代謝相關DEGs 有50個。

1.3 PPI網(wǎng)絡構建及關鍵基因的篩選 為了進一步篩選核心的DEGs，使用STRING 在線數(shù)據(jù)庫分別對DAVID 和GSEA 數(shù)據(jù)庫篩出的基因構建PPI 網(wǎng)絡進行分析，使用韋恩圖做出2 個數(shù)據(jù)庫脂代謝相關肝癌差異基因的交集，得到22 個DEGs（圖3A）。通過Cytoscape 軟件做出PPI網(wǎng)絡圖（圖3B）。其中與膽固醇代謝相關核心DEGs 有6 個：EPHX2、ApoC2、ApoA5、PON1、SQLE和SOAT2（表2），其中上調表達的基因為SQLE和SOAT2，下調表達的基因為ApoA5、EPHX2、ApoC2和PON1。

Figure 3. Screening of differentially expressed genes（ DEGs）. A： Venn diagram identified 22 DEGs. B： Cytoscape mapped protein interaction networks.圖3 差異表達基因的篩選

表2 膽固醇代謝相關的6個肝癌差異表達基因Table 2. Six differentially expressed genes related to cholesterol metabolism in hepatocellular carcinoma

1.4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫驗證DEGs 通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫驗證DEGs 在HCC 樣本（369 例）和正常樣本（160 例）中mRNA 表達差異數(shù)據(jù)。如圖4 和表3 所示，6 個DEGs 中，ApoA5和EPHX2在HCC 組織中的表達水平顯著低于正常肝臟組織（P<0.05），SQLE和ApoC2表達水平在HCC 組織中顯著升高（P<0.05），而PON1和SOAT2表達無顯著差異（P>0.05）。與前期篩選結果比較，得到ApoA5和SQLE兩個基因。

Figure 4. Box plots of the 6 differentially expressed genes in GEPIA database. A： ApoA5； B： SQLE； C： EPHX2； D： ApoC2； E：PON1； F： SOAT2. *P<0.05 vs normal group.圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫中差異表達基因的箱圖

表3 差異表達基因在肝癌組織和正常肝組織的表達Table 3. The expression of differentially expressed genes between HCC and normal liver tissues

1.5 預后生存分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫顯示，SQLE mRNA 高表達肝癌患者總體生存率顯著降低，低表達肝癌患者預后較好（P<0.05），見圖5A。KM-plot‐ter 數(shù)據(jù)庫的生存分析數(shù)據(jù)與GEPIA 數(shù)據(jù)庫表達趨勢相同，見圖5B。

Figure 5. Survival analysis of the HCC patients with low and high expression of SQLE in GEPIA database and KM-plotter database.A： GEPIA database（ n=91 in low SQLE group； n=90 in high SQLE group）； B： KM-plotter database（ n=168 in low SQLE group； n=196 in high SQLE group）.圖5 預后生存分析

1.6 肝癌組織中SQLE 的mRNA 表達水平 如圖6所示，與癌旁組相比，SQLE 的mRNA 表達水平在肝癌組織中顯著升高（P<0.01）。

Figure 6. RT-qPCR analysis of SQLE in liver cancer patients.The SQLE mRNA level in tumor tissues was higher than that in adjacent normal tissues. Mean±SD. n=9.**P<0.01 vs normal group.圖6 人肝癌組織中SQLE的mRNA表達水平

2 茯苓多糖通過SQLE/細胞焦亡途徑對HepG2 細胞的影響

2.1 不同濃度茯苓多糖對HepG2 細胞活力的影響 經(jīng)過不同濃度的茯苓多糖干預24、48 和72 h，HepG2 細胞活力被顯著抑制，其中800 mg/L 茯苓多糖干預48 h對細胞活力的抑制效果最好，見圖7。

Figure 7. Effect of pachymaran on the viability of HepG2 cells.The HepG2 cells were treated with different concentra‐tions of pachymaran for 24， 48 and 72 h， and the cell viability was assessed by CCK-8 assay. A： the line chart； B： the bar chart. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs control（ 0 mg/L） group.圖7 茯苓多糖對HepG2細胞活力的影響

2.2 茯苓多糖對HepG2 生長形態(tài)的影響 如圖8所示，與對照組相比，800 mg/L 茯苓多糖干預48 h后，HepG2 細胞梭形逐漸消失，開始出現(xiàn)類圓形，且細胞出現(xiàn)脫落、聚集生長現(xiàn)象。

Figure 8. Effect of pachymaran on the morphological changes of HepG2 cells（ scale bar=100 μm）. A： control group；B： pachymaran group （the spindle shape of the cells gradually disappeared， and the circular shape began to appear， with cell shedding and aggregating for growth）.圖8 茯苓多糖干預后肝癌細胞的形態(tài)變化

2.3 茯苓多糖對HepG2 細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結果表明，與對照組相比，茯苓多糖對HepG2細胞的遷移能力有顯著抑制作用，見圖9。

Figure 9. Effect of pachymaran on the migration of HepG2 cells was detected by wound-healing assay （scale bar=100μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.圖9 劃痕實驗檢測茯苓多糖對HepG2細胞遷移能力的影響

2.4 熒光顯微鏡觀察攜帶SQLE病毒感染情況 如圖10 所示，熒光顯微鏡下可清晰看到有帶綠色標簽的過表達質粒，感染效率在80%。

Figure 10. Observation of infection of virus carrying SQLE gene under fluorescence microscope（scale bar=100 μm）.A： phase-contrast； B： fluorescence； C： merged.The infection rate was about 80%.圖10 熒光顯微鏡下觀察攜帶SQLE基因病毒的感染情況

2.4 茯苓多糖對HepG2細胞中SQLE mRNA 表達水平的影響 如圖11 所示，與對照組相比，茯苓多糖干預后HepG2 細胞中SQLE mRNA 表達水平顯著下降（P<0.01）。

Figure 11. The mRNA expression level of SQLE in HepG2 cells was detected by RT-qPCR. The HepG2 cells were treated with pachymaran （800 mg/L） for 48 h. The SQLE mRNA level in pachymaran group was lower than that in control group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.圖11 HepG2細胞中SQLE的mRNA表達水平

2.5 茯苓多糖對HepG2 細胞中焦亡相關因子mRNA 表達水平的影響 如圖12 所示，與對照組相比，OE-NC 組SQLE、NLRP3 和caspase-1 的表達均無顯著差異（P>0.05）；與OE-NC 組相比，OE-SQLE 組SQLE 的mRNA 表達水平顯著升高（P<0.01），NLRP3和caspase-1 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.01），OE-NC+茯苓多糖組SQLE 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.01），NLRP3 和caspase-1 的mRNA 表達水平顯著升高（P<0.01）；與OE-SQLE 組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組SQLE 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.01），NLRP3和caspase-1的mRNA 表達水平顯著升高（P<0.01）；與OE-NC+茯苓多糖組相比，SQLE 的mRNA 表達水平顯著升高（P<0.01），NLRP3 和cas‐pase-1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）。

Figure 12. The mRNA expression levels of SQLE（ A）， NLRP3（ B） and caspase-1（ C） in HepG2 cells were detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC group； ▲▲P<0.01 vs OE-SQLE group； ##P<0.01 vsOE-NC+pachymaran group.圖12 RT-qPCR檢測HepG2細胞中SQLE、NLRP3和caspase-1的mRNA表達水平

2.6 茯苓多糖對HepG2 細胞中焦亡相關蛋白表達水平的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，OE-NC 組SQLE、NLRP3、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表達水平均無顯著差異（P>0.05）；與OE-NC 組相比，OE-SQLE 組SQLE 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），NLRP3、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），OE-NC+茯苓多糖組SQLE 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），NLRP3、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與OESQLE 組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組SQLE 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），NLRP3、caspase-1和GSDMDN 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與OE-NC+茯苓多糖組相比，SQLE 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），NLRP3、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），見圖13。

Figure 13. The protein expression levels of SQLE， NLRP3， GSDMD-N and caspase-1 in HepG2 cells were detected by Western blot.Mean±SD. n=3. **P<0.01vs OE-NC group； ▲▲P<0.01 vs OE-SQLE group； ##P<0.01 vs OE-NC+pachymaran group.圖13 Western blot檢測SQLE、NLRP3、GSDMD-N和caspase-1蛋白表達水平

2.7 茯苓多糖對HepG2 細胞壞死水平的影響 如圖14 所示，與OE-NC 組相比，OE-SQLE 組細胞壞死水平降低，OE-NC+茯苓多糖組細胞壞死水平升高；與OE-SQLE組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組細胞壞死水平升高；與OE-NC+茯苓多糖組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組細胞壞死水平升高。

Figure 14. The necrosis of HepG2 cells was determined by flow cytometry.圖14 流式細胞術檢測HepG2細胞壞死水平

2.8 茯苓多糖對HepG2 細胞LDH 釋放水平的影響 經(jīng)過不同處理后，細胞釋放LDH 的檢測結果如圖15 所示。與對照組相比，OE-NC 組LDH 釋放量無顯著差異（P>0.05）；與OE-NC 組比較，OE-SQLE 組LDH釋放量顯著減少（P<0.01），OE-NC+茯苓多糖組LDH 釋放量顯著增多（P<0.01）；與OE-SQLE 組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組LDH 釋放量增多（P<0.01）；與OE-NC+茯苓多糖組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組LDH釋放量減少（P<0.01）。

Figure 15. The activity of LDH was measured by colorimetry.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC group； ▲▲P<0.01 vs OE-SQLE group； ##P<0.01 vs OE-NC+pachymaran group.圖15 比色法檢測LDH活性

2.9 茯苓多糖對HepG2 細胞IL-18 和IL-1β 釋放水平的影響 如圖16 所示，與對照組相比，OE-NC 組IL-18 和IL-1β 釋放量無顯著差異（P>0.05）；與OENC 組比較，OE-SQLE 組IL-18 和IL-1β 釋放量顯著減少（P<0.01），OE-NC+茯苓多糖組IL-18和IL-1β釋放量顯著增多（P<0.01）；與OE-SQLE 組相比，OESQLE+茯苓多糖組IL-18 和IL-1β 釋放量增多（P<0.01）；與OE-NC+茯苓多糖組相比，OE-SQLE+茯苓多糖組IL-18和IL-1β釋放量減少（P<0.01）。

Figure 16. Release levels of IL-18（ A） and IL-1β（ B） were measured by ELISA. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs OE-NC group； ▲▲P<0.01 vs OE-SQLE group； ##P<0.01 vs OE-NC+pachymaran group.圖16 ELISA法測定IL-18和IL-1β的釋放水平

討 論

本研究根據(jù)生物信息學數(shù)據(jù)，在臨床組織驗證SQLE 差異表達，并在細胞實驗中探究SQLE 在肝癌中的分子機制。相關研究表明，SQLE 可以通過P53調控PTEN/AKT/GSK3β 信號通路而影響膀胱癌進展［12］，同時也與肺癌［13］、胰腺癌［14］和鼻咽癌［15］相關。本研究也提出SQLE 在肝癌中表達的確異常升高，這與既往其他腫瘤研究結果一致。同時，SQLE 通過調控脂代謝影響相關疾病也有相關報道。SQLE 可以誘導脂質新生，活化促炎通路（NF-κB），影響非酒精性脂肪性肝炎［16］；也可以影響膽固醇酯的積累，激活PI3K/AKT 通路，抑制細胞凋亡，影響腫瘤細胞增殖［17］。而本研究在生信分析中也建立SQLE 與肝癌之間的聯(lián)系，并在細胞實驗中探討相關機制。結果顯示，在肝癌組織中，SQLE的確顯著上調，過表達SQLE可以顯著降低肝癌細胞凋亡率，細胞遷移能力也明顯增強。

早期肝癌患者無明顯臨床癥狀，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，術后愈后效果不佳。中醫(yī)從整體觀念出發(fā)，采用辨證論治的方法對原發(fā)性肝癌的治療在減毒增效上具有很大優(yōu)勢。茯苓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。自20世紀70～80年代報道茯苓多糖抗腫瘤作用以來，茯苓多糖的功效報道集中于免疫活性調節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用［18］。本課題組前期研究顯示，茯苓多糖可以促進NLRP3、cas‐pase-1、GSDMD 等的mRNA 和蛋白表達，激活細胞焦亡途徑，影響肝癌細胞形態(tài)，抑制HepG2細胞遷移能力，起到抗肝癌作用［19］。相關研究表明，茯苓多糖可誘導鐵死亡以抗卵巢癌［20］；還可通過線粒體途徑誘導HepG2 細胞凋亡發(fā)生，也可通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡的發(fā)生［21］。因此，本研究探討茯苓多糖通過SQLE 調控肝癌細胞焦亡的分子機制。結果顯示，過表達SQLE能減少NLRP3、caspase-1、GSDMD等細胞焦亡相關因子的表達，抑制LDH、IL-18、IL-1β等細胞損傷和炎癥因子的釋放，抑制細胞焦亡途徑及壞死水平，而茯苓多糖干預會部分逆轉此趨勢，促進肝癌細胞發(fā)生焦亡。這揭示SQLE 在肝癌進展中具有重要作用，為肝癌的治療提供了參考資料。

綜上所述，本研究應用生物信息學分析結合細胞實驗，結果顯示茯苓多糖可以通過抑制SQLE 促進NLRP3/GSDMD細胞焦亡途徑，從而延緩肝癌進展。