冰片通過TRPM8減輕小鼠心肌梗死后炎癥反應并抑制心臟重構*

何瀅蓉， 胡 陶， 王武帥， 楊 曦， 段清華， 杜 萱，3， 王 強△

（1西南醫科大學臨床醫學院心血管內科，四川 瀘州 646000；2西部戰區總醫院心血管內科，四川 成都 610083；3成都醫學院，四川 成都 610500）

冠心病和心肌梗死（myocardial infarction， MI）是威脅國人健康的重大疾病，傳統醫學在治療冠心病方面也有一定的經驗積累，我國有相當一部分冠心病患者在接受中藥復方制劑的治療，如速效救心丸、復方丹參滴丸、通心絡膠囊、銀丹心腦通和麝香保心丸等，以上中藥復方制劑在治療冠心病方面顯示出較好的療效［1-2］。冰片（borneol）是上述中藥復方制劑的共有成分，既往研究發現冰片具有心肌保護作用，冰片可縮小大鼠MI 面積和減輕病理損傷［3］，然而冰片的作用靶點和心肌保護作用機制尚不清楚。近期研究發現，冰片通過直接激活外周感覺神經元上的瞬時受體電位陽離子通道M 亞家族成員8（transient receptor potential cation channel subfamily M member 8， TRPM8）發揮鎮痛作用，隨機對照雙盲臨床實驗證實外用冰片對術后患者的傷口疼痛有良好的鎮痛作用［4-5］。本課題組前期研究發現，TRPM8 參與調控MI 后心臟重構（cardiac remodeling）過程［6］，因此我們推測TRPM8 可能也是冰片在心臟的作用靶點，冰片可能通過激活TRPM8縮小MI面積，從而發揮心肌保護作用。

本研究擬采用TRPM8基因敲除（TRPM8gene knockout，TRPM8?/?）小鼠為研究對象，構建小鼠MI模型，研究冰片對MI 后炎癥反應和心臟重構的作用，探討冰片是否通過TRPM8 發揮心肌保護作用，為中醫藥治療冠心病提供理論依據。

材料和方法

1 動物

8 周齡雄性SPF 級野生型（wild-type， WT）C57BL/6小鼠，體重20～25 g，購自成都達碩實驗動物有限公司；8周齡雄性TRPM8基因敲除（TRPM8?/?）小鼠，體重20～25 g，購自美國Jackson 實驗室。嚴格按照實驗動物3R原則給予人道的關懷。

2 主要試劑

冰片購于Sigma Chemical；TRPM8 抗體、GAPDH抗體、中性粒細胞標志物抗Ly6g 抗體和巨噬細胞標志物Anti-Monocyte+Macrophage antibody（MOMA-2）購自Abcam；白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNFα）和單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic pro‐tein-1， MCP-1）ELISA 試劑盒購于eBioscience；Mas‐son 三色（膠原染色）試劑和蘇木精-伊紅（hematoxy‐lin-eosin， HE）染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 動物的分組及干預 WT 小鼠和TRPM8?/?小鼠各自隨機分為4組：假手術（sham）+對照（control）組、sham+冰片組、MI+control 組（結扎冠狀動脈左前降支）和MI+冰片組（結扎冠狀動脈左前降支并接受冰片治療），共8 組，每組30 只小鼠。按照本課題組前期實驗方法建立小鼠MI模型［6］，簡要步驟如下：腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定小鼠，胸骨左側第3、4 肋間隙將心臟擠出，于左心耳下緣2 mm 處使用0/6 號縫線結扎冠狀動脈左前降支，復位心臟，排除胸腔氣體后縫合創口，以此建立小鼠MI 模型；假手術組小鼠縫線僅穿過冠狀動脈左前降支周圍而不結扎。小鼠MI 建模術前5 d 開始，冰片組給予冰片灌胃（100 mg·kg?1·d?1），對照小鼠給予生理鹽水灌胃，每天1次，連續灌胃至術后第28天。記錄各組小鼠死亡時間和數量，繪制小鼠生存曲線。

3.2 心臟功能及血流動力學的檢測 按照課題組前期的方法［7］，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取仰臥位進行消毒、鋪巾，使用VisualSonics 高分辨率小動物超聲成像系統分別測定小鼠左心室射血分數（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。將壓力導管經小鼠右側頸總動脈插入左心室，使用PowerLab 生理多導儀記錄小鼠左心室壓力曲線，使用Chart 5 軟件分別對等容收縮期左室內壓力上升最大速率（dP/dtmax）和等容舒張期左室壓力下降最大速率（dP/dtmin）進行測量。測量結束后將小鼠安樂死，摘取心臟標本，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline， PBS）反復進行沖洗，置于多聚甲醛固定和-80 ℃冰箱凍存。

3.3 RT-qPCR 檢測TRPM8 的mRNA 表達 分別取各組小鼠梗死交界區（peri-infarct zone）和非梗死區（remote area）心肌組織，提取RNA，測定RNA 濃度，逆轉錄成cDNA。PCR 儀進行real-time PCR 檢測，反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，64 ℃退火30 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參照，采用2?ΔΔCt法對各組TRPM8的mRNA表達進行相對定量分析。TRPM8 的上游引物序列為5′-AACCCATT‐GACAAGCACAAGAAG-3′，下游引物序列為5′-CAGGAGGAAGGCGATGTAGAAGA-3′，產物長度為107 bp；GAPDH 的上游引物序列為5′-GAAGGTG‐GAAGAGTGGGAGTT-3′，下游引物序列為5′-GA‐CATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3′，產物長度為117 bp。

3.4 Western blot 檢測TRPM8 蛋白表達 分別取各組小鼠梗死交界區和非梗死區心肌組織，提取蛋白質和測量蛋白濃度，SDS-PAGE 分離等量的蛋白，將其轉移到PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白溶液封閉1 h，滴加Ⅰ抗（TRPM8 抗體，1∶1 000 稀釋；GAPDH 抗體，1∶2 000 稀釋）孵育，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，Ⅱ抗孵育1 h 后再次洗膜，發光液下顯影，Image-Pro Plus軟件測量蛋白灰度。

3.5 中性粒細胞和巨噬細胞數量的測定 免疫組化參照課題組前期方法［8］，4%多聚甲醛固定心臟標本，經脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，抗原修復后滴加山羊血清封閉液封閉20 min，滴加Ⅰ抗（抗Ly6g抗體和MOMA-2，均1∶100 稀釋）孵育，4 ℃過夜后PBS 洗滌，滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min 后再次PBS 洗滌，滴加DAB 顯色液，室溫顯色，蒸餾水洗滌切片，終止顯色，測量梗死交界區巨噬細胞和中性粒細胞的數量。

3.6 ELISA 法檢測心肌組織中炎癥因子水平 切下部分梗死交界區心肌組織，用PBS 反復沖洗，吸除多余的PBS，在冰浴環境中使用組織勻漿器進行勻漿，經3 000 r/min 離心5 min 后取上清液。采用ELI‐SA 法分析TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 含量，按照試劑盒說明書進行操作。

3.7 心肌組織病理檢測 將心臟逆行灌流PBS 緩沖液后，使用4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，常規切片后行HE 和Masson 染色。使用Image-Pro Plus軟件測量心肌細胞面積和心肌纖維化面積，計算非梗死區心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）。CVF（%）=膠原面積/總面積×100%。計算方法參照本課題組文獻［9］。每張切片隨機取5個視野，計算取其平均值。

4 統計學處理

使用SPSS 26.0 軟件進行數據統計分析。各組小鼠生存率采用log-rank 檢驗進行統計分析，并繪制生存曲線。所有計量資料以采用均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 冰片對小鼠心臟中TRPM8表達的影響

WT 小鼠MI 后第5 天，梗死交界區心肌組織中TRPM8 mRNA 和蛋白表達增加（P<0.01），提示TRPM8 可能參與MI 后心臟重構的調控過程；而在sham 組和MI 組中，冰片干預后TRPM8 mRNA 和蛋白表達未見明顯變化（P>0.05），提示冰片不影響心臟中TRPM8的表達，見圖1。

Figure 1. Effect of borneol on TRPM8 mRNA（A） and protein（B） expression in the peri-infarct zone and remote area of the heart from wild-type mice after myocardial infarction （MI） on day 5. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs sham+control group.圖1 冰片對心肌梗死后野生型小鼠心臟中TRPM8表達的影響

2 冰片對小鼠生存率和心臟功能的影響

記錄MI 模型建立至術后28 d 各組小鼠死亡時間和數量，繪制生存曲線。在WT小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片干預后小鼠生存率提高（P<0.05）；而在TRPM8?/?小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片干預后小鼠生存率未見明顯變化（P>0.05），見圖2A、B。MI后第28天進行小鼠心臟功能及血流動力學檢測，結果顯示，小鼠左心室腔擴大，LVEF 和LVFS 顯著減小，dP/dtmax顯著降低，同時dP/dtmin顯著升高（P<0.01），提示小鼠MI 模型成功建立；在WT 小鼠MI 模型中，與對照組相比，冰片干預后小鼠的LVEF、LVFS 和dP/dtmax顯著增加，dP/dtmin顯著減小（P<0.05）；而在TRPM8?/?小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片干預的MI 小鼠LVEF、LVFS、dP/dtmax和dP/dtmin未見顯著差異（P>0.05），見圖2C～F。這提示冰片可能通過TRPM8增加小鼠MI后生存率，并改善心臟收縮和舒張功能。

Figure 2. Effect of borneol on the survival rate and cardiac function of wild-type（ WT） and TRPM8?/? mice after myocardial infarction（MI）. The survival curves were plotted for WT（ A） and TRPM8?/?（ B） mice after MI with or without borneol， and the values of LVEF（ C）， LVFS（ D）， dP/dtmax（ E） and dP/dtmin（ F） in each group were determined. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham+control group； #P<0.05 vs MI+control group.圖2 冰片對心肌梗死后小鼠生存率和心臟功能的影響

3 冰片對小鼠MI后炎癥細胞浸潤的影響

MI 后第5 天，梗死交界區心肌組織中性粒細胞和巨噬細胞數量均顯著增加（P<0.01）；在WT 小鼠MI模型中，與對照組比較，冰片組梗死交界區中性粒細胞和巨噬細胞數量均顯著減少（P<0.01）；而在TRPM8?/?小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片干預后梗死交界區中性粒細胞和巨噬細胞浸潤未見明顯變化（P>0.05），見圖3。這提示冰片可以減輕小鼠MI后炎癥細胞浸潤，TRPM8 可能是冰片在心臟的作用靶點。

Figure 3. Effect of borneol on the infiltration of neutrophils（ A） and macrophages（ B） in the peri-infarct zone of the heart from wildtype（ WT） and TRPM8?/? mice with myocardial infarction（ MI） on day 5（ scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham+control group； ##P<0.01 vs MI+control group.圖3 冰片對小鼠心肌梗死交界區炎癥細胞浸潤的影響

4 冰片對小鼠MI后心肌炎癥因子表達的影響

通過測量梗死交界區炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 的含量來評估心肌組織炎癥反應，結果顯示，MI 后第5 天，梗死交界區TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 的表達顯著增加（P<0.01）；在WT 小鼠MI模型中，與對照組比較，冰片組梗死交界區TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 的表達顯著減少（P<0.05 或P<0.01）；而在TRPM8?/?小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片組梗死交界區TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 的表達未見明顯變化（P>0.05），見圖4。這提示冰片可能通過TRPM8降低小鼠MI后心肌炎癥因子的表達，從而抑制MI后心肌炎癥反應。

Figure 4. Effect of borneol on the expression of inflammatory factors in the peri-infarct zone of wild-type（WT） and TRPM8?/? mice with myocardial infarction（MI）. The TNF-α（ A）， IL-1β（ B）， IL-6（ C） and MCP-1（D） levels in the peri-infarct zone were detected by ELISA. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham+control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs MI+control group.圖4 冰片對小鼠心肌梗死交界區心肌炎癥因子表達的影響

5 冰片對小鼠MI面積和心肌纖維化的影響

MI 術后第28 天，通過Masson 染色評估MI 面積及心肌纖維化，結果顯示，在WT 小鼠MI 模型中，與對照組比較，冰片組小鼠MI 面積顯著減小（P<0.01），非梗死區心肌間質和血管周圍膠原含量減少，心肌纖維化程度顯著減輕（P<0.05）；但在TRPM8?/?小鼠MI模型中，與對照組相比，冰片組小鼠MI面積大小及心肌間質和血管周圍纖維化未見明顯改善（P>0.05），見圖5。這提示冰片可能通過TRPM8縮小小鼠MI面積和抑制MI后心肌纖維化。

Figure 5. Effect of borneol on the infarct size（ A； scale bar=2 mm） and collagen deposition（ B； scale bar=50 or 100 μm） in wild-type（WT） and TRPM8?/? mice after myocardial infarction （MI） on day 28（Masson staining）. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham+control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs MI+control group.圖5 冰片對小鼠心肌梗死面積和心肌纖維化的影響

6 冰片對小鼠MI后心肌肥大的影響

MI 術后第28 天，HE 染色檢測小鼠心肌肥大情況，結果顯示，在WT 小鼠MI 模型中，對照組小鼠心臟非梗死區出現明顯心肌細胞肥大［心肌細胞面積（415.7±23.6） μm2vs（234.1±12.5） μm2，P<0.01］；與對照組相比，冰片組非梗死區心肌細胞面積顯著減小［心肌細胞面積（336.3±21.7） μm2vs（415.7±23.6） μm2，P<0.01］；而TRPM8?/?小鼠MI 模型中，與對照組比較，冰片組小鼠非梗死區心肌細胞面積未見明顯差異（P>0.05），見圖6。這提示冰片可能通過TRPM8減輕小鼠心肌肥大，抑制MI后心臟重構。

Figure 6. Effect of borneol on cardiomyocyte hypertrophy in wild-type（ WT） and TRPM8?/? mice after myocardial infarction（ MI） on day 28 （HE staining， scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham+control group； ##P<0.01 vs MI+control group.圖6 冰片對小鼠心梗后心肌細胞肥大的影響

討 論

冠心病和MI 的發病率逐年升高，嚴重威脅人民的健康，隨著各級胸痛中心的廣泛建設、溶栓治療和急診冠脈介入治療技術的普及，近年來MI 的再灌注治療率增加，死亡率有所下降。然而，有部分患者的心肌缺血后不能得到及時、有效的再灌注，尤其是缺醫少藥的廣大農村地區；根據《中國心血管健康與疾病報告2022》，近年來農村地區的冠心病和MI 的死亡率已明顯超過城鎮地區［10］。MI 后啟動心臟重構，主要表現為梗死區擴展、心肌細胞肥大和心肌纖維化，并最終進展為心力衰竭［11］。中藥復方制劑（如速效救心丸、復方丹參滴丸、通心絡膠囊、銀丹心腦通和麝香保心丸等）在我國用于冠心病的治療十分普遍，尤其是廣大基層地區，并顯示出較好療效；速效救心丸和復方丹參滴丸深得民心，已成為家庭常備心腦血管藥品［1-2］。前期的一些動物實驗證實，速效救心丸和麝香保心丸等中藥復方制劑具有減輕心肌缺血缺氧損傷和抑制心臟重構的作用［12-15］。前期也有動物實驗發現，作為上述中藥復方制劑的共有成分，冰片可促進血管生成，縮小大鼠MI 面積，減輕心肌損傷［3，16］。然而冰片的具體作用靶點和心肌保護作用機制目前尚不清楚。

TRPM8 是TRP 家族成員，可以被低溫刺激和清涼化合物（如薄荷醇）激活，通過介導鈣離子內流發揮生物學效應［17］。我們和其他課題組先后發現，TRPM8 可通過拮抗RhoA/Rho 激酶途徑和抑制心肌炎癥反應，縮小MI 面積，抑制心臟重構，改善心臟功能［6，18］。有研究證實，冰片通過直接激活外周感覺神經元上的TRPM8，對術后患者的傷口疼痛有良好的鎮痛作用［4-5］。本實驗中，我們發現：在WT 小鼠中，TRPM8 在梗死交界區心肌組織中表達增加，冰片可以提高MI小鼠的生存率，縮小MI面積，抑制MI后心臟重構，改善心臟功能；而在TRPM8?/?小鼠MI 模型中，冰片對小鼠生存率、MI面積、心肌肥大、心肌纖維化和心臟功能未見明顯影響。這提示TRPM8 可能是冰片在心臟的關鍵作用靶點，冰片可能通過TRPM8抑制小鼠MI后心臟重構，改善心臟功能。

炎癥反應在MI 后心臟重構中發揮重要作用，MI可迅速激活固有免疫，進而促進炎癥反應以清除細胞外基質碎片和死亡的心肌細胞；可是過度的炎癥反應也給心肌帶來了一系列不良影響，如心肌細胞的壞死，進一步加劇梗死范圍，同時還促進心臟重構，加速心力衰竭發展。既往研究發現，TRPM8通過調節CGRP 和炎癥介質（IL-1β 和IL-6）抑制結腸炎的慢性炎癥反應［19-20］，提示TRPM8 可能是調節炎癥反應的重要分子。我們前期發現TRPM8 可抑制心肌炎癥反應，縮小MI面積［6］。另有實驗證實，復方丹參滴丸等可抑制MI 后炎癥反應，減輕心肌缺血性損傷［15］。本實驗中，我們發現：在WT小鼠中，冰片可減少中性粒細胞和巨噬細胞在梗死交界區的浸潤，抑制炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1）的過度表達；而在TRPM8?/?小鼠MI模型中，冰片對炎癥細胞和炎癥因子的表達未見明顯影響。這提示冰片可能通過TRPM8 下調MI 后炎癥反應，進而抑制心臟重構，緩解心力衰竭。

冰片通過TRPM8 調控MI 后炎癥因子表達和炎癥細胞浸潤的具體機制，是通過心肌發揮作用，或者作用于炎癥細胞［19-20］，目前尚不清楚。我們實驗中觀察到冰片對心臟中TRPM8 表達無影響，結合前期研究［4-5］，推測冰片通過激活TRPM8 發揮作用，我們擬在后續實驗中探討冰片對心肌細胞和炎癥細胞中TRPM8 活性影響，并在細胞和動物水平通過TRPM8基因過表達觀察其對冰片所致心肌細胞和心臟重構的影響。此外，冰片對人類MI 后心臟重構和心力衰竭的防治效果仍需要進一步的深入研究。

綜上所述，本研究提示TRPM8 可能是冰片在心臟的重要作用靶點，冰片可能通過TRPM8減輕MI后炎癥反應，抑制心臟重構，改善小鼠MI 后的心臟功能。本研究結果將為冠心病和MI 患者的中醫藥治療提供理論依據。