大鼠心肌成纖維細胞通過增加基質金屬蛋白酶2活性抑制心肌細胞縫隙連接功能*

柏 雪， 高 鴻，2，△， 黃 祥， 嚴 旭， 胡廷菊， 陳 銳， 安 麗， 宋雨婷

（1貴州醫科大學麻醉學院，貴州 貴陽 550002；2中山大學附屬第一醫院貴州醫院，貴州 貴陽 550025；3貴州醫科大學附屬醫院麻醉科，貴州 貴陽 550002）

縫隙連接蛋白43（connexin 43， Cx43）是心臟細胞中表達豐富的一類縫隙連接蛋白，主要定位于心肌縫隙連接處［1-2］。心臟缺血-再灌注（ischemia-reper‐fusion， I/R）后Cx43 的下調和細胞外基質（extracellu‐lar matrix， ECM）蛋白的上調可能導致心律失常的發生［3］。心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts， CFs）是心臟中主要的細胞類型之一［4］，既往研究表明，它們可通過旁分泌將功能元件（包括DNA、RNA、蛋白質和其他代謝物）傳遞給鄰近的心肌細胞，通過協同或拮抗作用改變心臟微環境［5］；或者通過與心肌細胞的電偶聯直接影響心臟電生理［6］。此外，CFs 不僅能合成富含膠原的ECM，也是基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的主要來源［7］。大鼠心肌I/R 時MMP2 顯著激活，可水解SERCA2a 蛋白，引起心功能改變［8］。缺氧復氧（hypoxia/reoxygenation， H/R）后CFs 條件培養液可下調大鼠心肌細胞中Cx43的表達水平［9］，但目前關于CFs條件培養液影響大鼠心肌細胞中Cx43 蛋白的機制研究尚不充分，MMPs是否參與該過程仍不清楚，本項工作擬評價MMPs在大鼠CFs條件培養液影響大鼠心肌細胞中Cx43蛋白及縫隙連接功能中的作用，并利用大鼠離體全心I/R模型進行驗證，為明確其機制提供參考。

材料和方法

1 細胞和動物

SPF 級雄性SD 大鼠32 只，6～8 周齡，體重260～290 g，由貴州醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證編號為SYXK（貴）2023-0002。大鼠心肌細胞（H9c2）購自上海賽百慷生物技術股份有限公司，大鼠心肌成纖維細胞購自上海弘順生物科技有限公司，所有重復實驗均使用3～10代內的細胞進行。

2 主要試劑

特級胎牛血清（貨號：04-001-1ACS）購自Biologi‐cal Industries；高糖DMEM 培養液（貨號：L110KJ）和0.25%胰酶EDTA 溶液（貨號：S310JV）均購自上海源培生物有限公司；青霉素-鏈霉素（貨號：C3421-0100）購自上海逍鵬生物科技有限公司；RIPA 裂解液（貨號：P0013B）、蛋白酶抑制劑混合物（貨號：P1005）、磷酸酶抑制劑混合物A（貨號：P1081）和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）均購自上海碧云天生物技術有限公司；Cx43 抗體（貨號：ab217676）購自Abcam；p-Cx43 抗體（貨號：370317）購自成都正能生物技術有限責任公司；GAPDH 抗體（貨號：PMK042S）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（貨號：PMK-014-090M）購自武漢普美克生物技術有限公司；Lucifer Yellow CH（Potassium salt）熒光黃CH 鉀鹽（貨號MX4476-25MG）購于上海懋康生物有限公司；膠原蛋白酶2，9 檢測試劑盒（貨號：P1700）購于北京普利萊基因技術有限公司；ARP-100（貨號：A4432）購自APExBIO；封閉山羊血清（貨號：SL038）購自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠CFs條件培養液制備 CFs隨機分為4組：常氧條件下培養組（normal 組）、常氧條件下加ARP-100 組（ARP 組）、H/R 處理組（H/R 組）和H/R 處理加ARP-100 組（H/R+ARP 組）。待細胞融合至80%，吸去原培養液，PBS 清洗2 次后更換新的完全培養液，normal組細胞置于37 ℃、5% CO2+95%空氣條件下的培養箱中培養5 h；ARP 組加入ARP-100（0.03 mol/L）于37 ℃、5% CO2+95%空氣條件下培養5 h；H/R 組細胞置于缺氧裝置中，以5 L/min 的速度持續吹入體積分數為95% N2和體積分數為5% CO2的混合氣體15 min，關閉進出氣口缺氧培養1 h 后，從缺氧裝置中取出細胞培養瓶放入培養箱中繼續培養4 h；H/R+ARP 組在更換完全培養液后加入ARP-100（0.03 mol/L），后續處理同H/R 條件組；收集各組細胞培養上清液，于4 ℃下1 417×g離心5 min，0.45 μm 濾器過濾去除死細胞及細胞碎片等雜質，?20 ℃保存或即刻用于H9c2細胞干預實驗。

3.2 H9c2 細胞培養與分組 使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的完全培養液培養H9c2細胞，細胞放置于37 ℃、5% CO2+95%空氣條件下的培養箱中，當細胞密度達90%以上時，用0.25%胰酶消化后按照1∶2 或1∶3 傳代，取對數生長期細胞用于實驗。對H9c2 采用隨機數字表法分為5 組：control 組、normal 組、ARP 組、H/R 組和H/R+ARP 組，待H9c2 細胞密度達到70%以上，control 組更換完全培養液，normal 組、ARP 組、H/R 組和H/R+ARP 組中分別加入等體積上述對應的條件培養液，在37 ℃、5% CO2+95%空氣條件下的培養箱中繼續培養。

3.3 細胞Western blot 實驗 取各組對數生長期細胞，將RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物A按100∶1∶1比例配制，取適量加入培養皿中冰上搖勻，15 min 后細胞刮刮取裂解后的細胞，在4 ℃冷凍離心機14 170×g離心15 min，收集上清液并使用BCA 蛋白濃度試劑盒對總蛋白進行定量。配制5%積層膠和10%分離膠后進行電泳。起始電壓為80 V，待染料進入分離膠后，將電壓增為120 V 直至染料到達分離膠底部后停止電泳，在4 ℃條件下，300 mA 穩流進行90 min 轉膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫下振蕩封閉2 h，加入Ⅰ抗（Cx43 抗體、p-Cx43 和GAPDH 抗體，分別按1∶6 000、1∶1 000 和1∶5 000 稀釋），置入4 ℃冰箱振蕩過夜，1×TBST 洗膜3次后加入Ⅱ抗（1∶5 000）室溫下振蕩孵育1 h。使用ECL 顯色后曝光顯影。用內參照GAPDH 蛋白條帶作為標準灰度值，用 ImageJ 軟件計算相應蛋白的相對含量。

3.4 熒光劃痕示蹤技術 熒光黃染液在心肌細胞中通過縫隙連接擴散的距離，被用以評估心肌細胞間縫隙連接的功能［10］。H9c2 細胞以每孔2×105個接種于6 孔板，細胞融合至80%時吸出原培養液，使用鈣鎂PBS（CaMg-PBS）清洗3 次，按照分組加入完全培養液或條件培養液繼續培養至密度為90%～100%。吸出培養液后使用CaMg-PBS清洗3次，然后每孔加入提前配制并預熱的0.05%熒光黃染液1 mL，用手術刀在板底部劃三條劃痕。細胞膜因機械刺激而通透性改變，使熒光黃染液進入細胞中。然后將6 孔板放入37℃，95% N2+5% CO2空氣條件下培養箱孵育10 min。隨著細胞膜通透性的恢復，染料困于細胞質中。然后用CaMg-PBS 清洗5～6 次，洗去細胞外的熒光黃染液，而細胞質中的染液可通過縫隙連接通道擴散至相鄰的細胞，并用以評估細胞間的縫隙連接功能。最后每孔用4%多聚甲醛（2 mL）固定20 min，取出6孔板置于倒置熒光顯微鏡下觀察（LY：激發波長為428 nm，發射波長為536 nm）。

3.5 明膠酶譜法 本實驗根據之前報道的實驗方法及膠原蛋白酶MMP2 和MMP9 檢測試劑盒說明書進行操作［11］。在制備SDS-PAGE 凝膠時額外加入MMP 底物蛋白，并使之稀釋10 倍。條件培養液使用分光光度計定量后，按照1∶1 稀釋于SDS-PAGE 非還原性緩沖液，20 mA 恒流低電流電泳，溴酚藍染色劑跑至凝膠底部時切斷電源，室溫加入10 mL緩沖液A洗滌凝膠18 h，棄掉緩沖液A 并重復一次。加入10 mL 緩沖液B，室溫孵育過夜，倒掉緩沖液B 后加入考馬斯亮藍工作液以覆蓋凝膠，快速振蕩2 h，使用脫色液（甲醇∶冰醋酸：水=5∶7∶88）清洗2 次，每次2 h。然后置于掃描儀上掃描。

3.6 大鼠離體心臟I/R 模型的構建 本實驗根據之前報道的方法構建了大鼠離體心臟I/R 模型［12］。首先向大鼠腹腔注射2.5%肝素鈉（2 000 U/kg），15 min后再向腹腔注射3%戊巴比妥（60 mg/kg）。待大鼠完全麻醉后，平躺于手術臺上并固定四肢，切開腹部，沿劍突下的縱隔向上剪開胸腔，暴露心臟后用眼科剪剪取心臟。然后立即將其放入4 ℃的Krebs-Henseleit（K-H）液（0.12 mol/L NaCl， 0.004 5 mol/L KCl， 0.001 25 mol/L CaCl2， 0.001 2 mol/L MgCl2·6H2O， 0.001 2 mol/L KH2PO4， 0.02 mol/L NaHCO3，0.01 mol/L C6H12O6， pH 7.4），將主動脈連接Langen‐dorff 灌注系統并對離體大鼠心臟逆行恒溫灌注（37 ℃），逐漸增加K-H 液（與95% O2和5% CO2平衡）流速至8～9 mL/min。SD 大鼠隨機分為4 組，每組8只：control 組、ARP 組、I/R 組和I/R+ARP 組。control組：37 ℃ K-H 液平衡灌注15 min后繼續灌注75 min，90 min 時灌注含DMSO 的37 ℃ K-H 液30 min；ARP組：37 ℃ K-H 液平衡灌注15 min，持續灌注75 min后繼續灌注含ARP-100（0.03 mol/L）的37 ℃ K-H 液30 min；IR 組：37 ℃ K-H 液平衡灌注15 min 后繼續灌注15 min，注 射心 臟停 跳液Thomas 液（0.12 mol/L NaCl， 0.016 mol/L KCl， 0.016 6 mol/L MgCl2， 0.001 2 mol/L CaCl2， 0.010 mol/L NaHCO3， pH 7.8； 0.02 mL/g， 4 ℃），心臟置于4 ℃ K-H 液中60 min，期間于停搏30 min 時半量復灌Thomas 液（0.01 mL/g， 4 ℃），90 min 時使用37 ℃ K-H 液（含DMSO）再灌注30 min；I/R+ARP 組：37 ℃ K-H 液平衡灌注15 min 后繼續灌注15 min，注射 心 臟停 跳 液Thomas 液（0.02 mL/g，4 ℃），心臟置于4 ℃ K-H 液中60 min，中途半量復灌Thomas 液（0.01 mL/g， 4 ℃），90 min 時使用含ARP-100（0.03 mol/L）的37 ℃ K-H液再灌注30 min。

3.7 微電極陣列（multi-electrode array，MEAs）技術 按照之前報道的實驗方法利用MEAs 技術采集離體大鼠心臟的心電活動［13］。將EMS64-USB-1003型64 通道電生理標測放大器（8×8， grid；觸點材料：銀；網孔尺寸：3.0 mm×3.0 mm；電極直徑：0.1 mm；電極間距：0.43 mm；電極阻抗：1.5～1.7 Ω）放于SD大鼠左室處，選擇EMapScope5.0 軟件中MEAs 模式采集數據。采集平衡灌注15 min（T0），再灌注即刻（T1）及再灌注30 min（T2）時的室性心律失常類型、頻率及持續時間，根據Lambeth 慣例進行評分［14］，利用EMapScope5.0軟件進行數據分析。

3.8 免疫組織化學實驗 取SD 大鼠的心尖使用4%的中性緩沖福爾馬林進行樣本固定，置于不同濃度（依次70%、80%、95%、100%）的乙醇中脫水。將樣本浸入石蠟中包埋，使用切片機將組織樣本切成4 μm 的薄片并附著于玻璃片上。然后使用二甲苯脫蠟，采用不同濃度（依次100%、95%、80%、70%）的乙醇水化。使用檸檬酸溶液孵育3 min，加入10%山羊血清37 ℃封閉30 min，加入Ⅰ抗（Cx43 抗體，1∶500）后4 ℃孵育過夜。PBST洗片3次（3×5 min）加入Ⅱ抗（1∶200），37 ℃孵育30 min。用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine， DAB）染色以及蘇木精反染后，組織切片脫水，用中性香脂封片，在熒光顯微鏡下對切片進行觀察，并使用ImageJ軟件對圖像進行分析。

3.9 組織Western blot 實驗 取各組左心室的心臟組織50 mg，加入0.5 mL 組織裂解液勻漿，冰上裂解30 min 后在4 ℃冷凍離心機14 170×g離心15 min。然后用BCA 試劑盒檢測蛋白質濃度，用10% SDSPAGE 凝膠分離蛋白質，然后將其轉移到PVDF 膜上，將膜與5%脫脂牛奶封閉液室溫孵育2 h。然后在4 ℃下加入Ⅰ抗（Cx43 抗體、p-Cx43 和GAPDH 抗體，分別按1∶6 000、1∶1 000 和1∶5 000 稀釋）孵育過夜。1×TBST 洗膜3 次后加入Ⅱ抗（1∶5 000）室溫下振蕩孵育1 h。使用ECL 顯色后曝光顯影。用內參照GAPDH 蛋白條帶作為標準灰度值，用 ImageJ 軟件計算相應蛋白的相對含量。

4 統計學處理

用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 H/R 處理后的大鼠成纖維細胞條件培養液影響Cx43蛋白表達及縫隙連接功能

與control 組相比，normal 組中Cx43 蛋白表達及磷酸化水平無顯著差異（P>0.05），H/R 組中Cx43 蛋白表達及磷酸化水平顯著降低（P<0.01），見圖1A。與control 組相比，normal 組中熒光擴散范圍無顯著差異（P>0.05），H/R 組中熒光擴散范圍變窄（P<0.01），見圖1B、C。

Figure 1. The conditioned medium from H/R-treated rat cardiac fibroblasts impaired gap junction function. A： Western blot analysis of Cx43 and p-Cx43 in H9c2 cells treated with conditioned medium from H/R-treated rat cardiac fibroblasts； B： functional gap junction channels were detected by the scrape loading/dye transfer assay（scale bar=40 μm）； C： quantification of the lucifer yellow diffusion. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.圖1 H/R后大鼠心肌成纖維細胞條件培養液影響縫隙連接功能

2 ARP-100 減弱H/R 條件培養液對心肌細胞中Cx43表達及縫隙連接功能的影響

明膠酶譜法結果顯示，與control 組相比，H/R 組MMP2 活性顯著增強（P<0.01），見圖2A。H/R 條件培養液使用MMP2特異性抑制劑ARP-100后，與H/R組相比，H/R+ARP 組可抑制H/R 誘導的MMP2 活性增強（P<0.01），見圖2B。Western blot 實驗結果顯示，與control 組相比，ARP 組中Cx43 蛋白表達及磷酸化水平無顯著差異（P>0.05）；與H/R 組相比，H/R+ARP組中Cx43蛋白表達水平增加（P<0.05），磷酸化水平上調（P<0.05），見圖2C。與control 組相比，ARP 組中熒光擴散范圍差異無統計學意義（P>0.05）；與H/R 組相比，H/R+ARP 組熒光擴散范圍增寬（P<0.05），見圖2D、E。

Figure 2. ARP attenuated gap junction dysfunction caused by H/R. A and B： Gelatin zymography was conducted to detect the MMPs activities in the medium； C： Western blot analysis of Cx43 and p-Cx43 in H9c2 cells treated with or without ARP； D： func‐tional gap junction channels of H9c2 cell were examined using the scrape loading/dye transfer assay after the treatment of ARP（ scale bar=40 μm）； E： quantification of the lucifer yellow diffusion. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs H/R group.圖2 ARP-100減輕H/R引起的縫隙連接功能障礙

3 ARP-100減少在大鼠離體全心I/R 模型中的再灌注心律失常（reperfusion arrhythmia， RA）評分

各組典型心律失常心電圖如圖3A所示。與con‐trol組比較，ARP 組RA 評分無顯著差異（P>0.05），I/R 組RA 評分顯著增高（P<0.01）；與IR 組比較，IR+ARP組RA評分顯著降低（P<0.01），見圖3B。

Figure 3. ARP reduced arrhythmia score in isolated rat hearts subjected to I/R injury. A： representative electrocardiograph recordings of all experimental groups； B： arrhythmia score was calculated to quantify arrhythmia severity. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs I/R group.圖3 ARP-100減少離體I/R大鼠心臟的心律失常評分

4 ARP-100增加I/R心肌組織閏盤中Cx43的表達

免疫組織化學染色結果表明，與control 組相比，I/R 組心肌組織閏盤中Cx43 蛋白分布減少；與I/R 組相比，I/R+ARP 組心肌組織閏盤中Cx43 蛋白分布增加，見圖4A。Western blot 實驗結果顯示，與control組相比，I/R組中Cx43蛋白表達及磷酸化水平均顯著下降（P<0.01 或P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+ARP 組Cx43 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），磷酸化水平無顯著變化，見圖4B。

Figure 4. The effect of ARP on the distribution and expression of Cx43. A： representative immunohistochemical images of Cx43 ex‐pression at the intercalated discs of myocardium（ scale bar=50 μm）； B： Western blot analysis of Cx43 and p-Cx43 in myo‐cardium perfused with or without ARP. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0.01vs control group； #P<0.05 vs I/R group.圖4 ARP-100對Cx43蛋白分布及表達的影響

討 論

RA 是心肌缺血再灌注損傷（myocardial isch‐emia-reperfusion injury， MIRI）的主要并發癥之一。Cx43蛋白的下調或分布異常可導致心肌細胞間通訊異常，電活動受阻，并可能是導致心律失常、心肌炎和心肌梗死等病理過程的潛在機制之一［15-17］。在大鼠離體心臟I/R 模型中，閏盤處Cx43 蛋白的表達明顯下調［12］。此外，心房注射編碼Cx43 的腺病毒聯合電穿孔技術可使豬心房細胞中Cx43 蛋白的含量增加2.5 倍，顯著減少心房顫動的發生率［18］。另一方面，Cx43的基因突變可能導致縫隙連接丟失，細胞間通訊異常，與心臟畸形和嬰兒猝死有關［19］。總之，目前的研究表明Cx43 蛋白的下調可能導致細胞間通訊異常、電傳導速度減慢和心律失常。

心臟的主要細胞類型包括心肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞和平滑肌細胞，其中心肌細胞和成纖維細胞是心臟中的關鍵細胞類型［20］。成纖維細胞占心臟細胞總數的60%～70%，它們可以通過旁分泌信號、ECM 和機械相互作用等方式直接或間接地與心肌細胞進行細胞通訊，以維持心臟的正常功能并調節心臟對致病刺激的反應［21-22］。雖然心電活動主要存在于心肌細胞中，但近年來，成纖維細胞在心律失常中的作用越來越受到重視。通過shRNA 和siRNA敲減成纖維細胞中的Pitx2c會增加成纖維細胞的活性并影響心臟的電生理和房顫的發生［23］。此外，H/R后的CFs培養液可下調大鼠心肌細胞中Cx43的表達水平［9］。本研究進一步揭示了H/R 使大鼠CFs 培養液中MMP2活性顯著增加，而外源性抑制MMP2活性可減弱大鼠CFs 條件培養液對大鼠心肌細胞中Cx43表達、磷酸化水平和縫隙連接的影響。在大鼠離體心臟I/R 模型中也驗證了MMP2 特異性抑制劑的心肌保護作用。這些結果提示H/R 處理的大鼠CFs 可能通過分泌MMP2影響大鼠心肌細胞中Cx43蛋白的表達、磷酸化水平和縫隙連接功能。抑制大鼠心肌中MMP2 的過度活化，保持ECM 的動態平衡可能是減少離體大鼠心臟MIRI有希望的策略。

心臟ECM 是一個動態而復雜的網絡，在為心臟細胞提供結構支持、調節基因表達和縫隙連接形成方面發揮著重要作用［24］。成纖維細胞可影響ECM中蛋白的表達，而ECM 的重塑可能導致心肌動作電位的傳導延遲和心律失常發生的風險增加［25］。本研究結果表明H/R處理可導致大鼠CFs條件培養液中MMP2的活性增加，這可能是H/R條件培養液影響大鼠心肌細胞中Cx43 蛋白表達及縫隙連接功能的潛在機制。但我們未進一步探究MMP2調節Cx43蛋白的具體機制。MMP2可降解ECM中的蛋白成分，這可能影響位于細胞表面的Cx43 蛋白的表達和分布，該領域的深入探究可能為RA的發生機制提供新的見解。

本研究采用Langendorff 灌注裝置建立SD 大鼠低溫全心I/R 模型，通過MEAs 系統記錄電極接觸部位心肌細胞的電活動和心律失常發生情況。研究局限性是使用離體大鼠模型來模擬I/R 損傷，而不是體內模型。在大鼠離體心臟I/R 模型中排除了外部因素如心臟的神經元和激素調節以及血液成分的干擾，然而在體內心肌I/R 損傷的病理生理機制更為復雜，MMPs 的激活及作用機制可能更復雜。此外，也需要使用其他MMP2抑制劑或MMP2基因沉默/敲除技術進行后續研究以驗證本研究的結果。

綜上所述，H/R 處理后的大鼠CFs條件培養液影響大鼠心肌細胞中Cx43 蛋白的表達和縫隙連接功能，其機制可能是大鼠CFs條件培養液中MMP2活性增加介導的。抑制MMP2 活性可減少大鼠離體全心I/R模型中心律失常評分。