糖尿病腎病小鼠中前纖維蛋白1的表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤分析*

麥麗萍， 黃桂萍， 鄧春玉， 鄭丹琳， 李曉紅， 何國東

［南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080］

糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，與腎小球、血管和腎小管損傷有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示，我國20%～40%的糖尿病患者可并發(fā)DN，這些病人常伴有心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等基礎(chǔ)病，加重了DN 的疾病進(jìn)展和增加死亡風(fēng)險［1］。因此，探索DN 的發(fā)病機(jī)制和有效的藥物研發(fā)備受關(guān)注，然而目前DN 的發(fā)病機(jī)制尚不明確。既往研究顯示，高血糖和氧化應(yīng)激引起的血管功能障礙是DN 發(fā)病的重要因素；晚期糖基化終產(chǎn)物（ad‐vanced glycation end products， AGEs）積累，與其受體RAGE 結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen spe‐cies， ROS）激活相關(guān)的信號通路，活化下游靶分子，如：核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起腎臟損傷，在DN的發(fā)生與發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用［2-4］。

前纖維蛋白1（profilin 1， PFN1）是前纖維蛋白（profilin， PFN）的亞型之一，在進(jìn)化上高度保守的一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，普遍存在于所有真核生物中，被認(rèn)為有3 個結(jié)構(gòu)域：肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、聚L-脯氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和磷脂酰肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PFN1作為關(guān)鍵的小分子肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，通過其結(jié)構(gòu)域調(diào)控肌動蛋白的聚合-解聚動態(tài)平衡，介導(dǎo)細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架的改變［5］。PFN1還作為關(guān)鍵信號分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)樞紐，通過結(jié)構(gòu)域與靶蛋白的相互結(jié)合參與蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、小G 蛋白信號通路的活化以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄等一系列重要的生理、病理過程［6］。由此可見，PFN1 在許多細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用，包括膜運(yùn)輸、內(nèi)吞、細(xì)胞周期、運(yùn)動、增殖、細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)錄、干細(xì)胞和自噬等。PFN1 的異常表達(dá)或缺失可影響細(xì)胞的正常生理活動并導(dǎo)致疾病的發(fā)展。目前，PFN1 在人類惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和內(nèi)皮功能障礙中異常表達(dá)［7-8］。PFN1在AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡中起到強(qiáng)而有力的調(diào)節(jié)作用。AGEs 通過提高ROS 的產(chǎn)生，RhoA 和ROCK2 的表達(dá)來增加PFN1 的表達(dá)，PFN1 升高促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架的紊亂；下調(diào)PFN1 可減輕H9c2 細(xì)胞AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡［9］。

PFN1 可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和巨噬細(xì)胞分化；在滋養(yǎng)層細(xì)胞中下調(diào)PFN1 可通過NF-κB 信號通路促進(jìn)腫瘤壞死因子α 分泌，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M1表型［10］。DN 腎小管上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的通訊通過細(xì)胞外小泡轉(zhuǎn)移形成負(fù)反饋環(huán)，促進(jìn)腎臟炎癥和凋亡［11］。課題組前期研究顯示：PFN1 可通過Hedgehog信號通路促進(jìn)DN腎小管上皮細(xì)胞凋亡［12］。本項工作擬進(jìn)一步觀察DN 小鼠中PFN1的表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤情況。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級8 周 齡雄性C57BL/6 小 鼠16 只，體重量（20±5） g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心［許可證號：SCXK（粵）2022-0002］。飼養(yǎng)室溫、濕度、光照適宜，普通飼料喂養(yǎng)。

2 細(xì)胞株

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2 購自賽業(yè)生物科技有限公司（貨號： H4-0501），該細(xì)胞株已鑒定。HK-2 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)生長。

3 主要實驗試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）購自Sigma；PFN1 抗體（67390-1-Ig）、胱天蛋白酶3（caspase-3）抗體（19677-1-AP）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1）抗體（26161-1-AP）購自Proteintech；B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（BA0412）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-asso‐ciated X protein， Bax）抗體（A00183）、GAPDH 抗體（A00227-1）和HRP Ⅱ抗（BA1050 和BA1054）均購自Boster；CC 趨化因子受體4（CC chemokine receptor 4，CCR4）抗體（TD10206S）和白細(xì)胞介素1 受體I型（in‐terleukin-1 receptor type I， IL-1R1）抗體（PK06667S）購自Abmart；CD11b 抗體（ab133357）和山羊抗兔IgG-HRP（ab205718）購自 Abcam；F4/80 抗體（70076S）購自CST；Harris蘇木素染色液（BA4041）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色試劑盒（DAB-4033）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)。胎牛血清（AB-FBS-ED1050）購自Abwbio；DMEM/F12 培養(yǎng)液（C11330500BT）購 自Gibco；Lipofectamine 2000（11668019 ）購自Invitrogen。

4 主要方法

4.1 數(shù)據(jù)下載 從GEO 數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/）下載樣本來源可靠的DN 患者芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE30122［13-14］，使用R 軟件（ver‐sion 4.0.2，http：//r-project. org/）的affy 包［15］讀 取 數(shù)據(jù)，通過背景校正，數(shù)據(jù)均一化處理，最終獲得該數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)矩陣。數(shù)據(jù)集中的樣本均來自于Homo sapiens，平臺基于GPL571［HG-U133A_2］ Af‐fymetrix Human Genome U133A 2.0 Array，其中包括19例DN患者和50例正常腎臟樣本。

4.2 DN 患者腎臟組織免疫細(xì)胞浸潤水平 CIBER‐SORT 是基于線性支持向量回歸原理對人類免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的工具。對芯片表達(dá)矩陣進(jìn)行非負(fù)矩陣分解后計算不同細(xì)胞類型的比例。該方法基于已知參考數(shù)據(jù)集，提供22 種免疫細(xì)胞亞型的基因表達(dá)特征集［16］。本研究通過利用CIBERSORT 分析并比較DN 與非DN 患者腎臟組織免疫細(xì)胞浸潤水平。

4.3 實驗動物的分組和造模 將16 只C57BL/6 小鼠編號，稱量體重，并隨機(jī)分為正常組和模型組（DN組），每組各8 只。參照課題組前期的研究方法［12］，采用腹腔注射STZ 法建立DN 小鼠模型［17-19］，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，腹腔連續(xù)5 d 注射STZ（50 mg/kg）， 5 d后檢測血糖水平，若血糖>16.7 mmol/L 可判斷糖尿病模型造模成功，此后每周監(jiān)測小鼠血糖和24 h 尿微量蛋白水平。8 周后若24 h 尿微量蛋白大于 30 mg則認(rèn)為DN 模型成功［20-21］。造模成功后，脊椎脫臼法處死小鼠后開腹取腎臟，立即放于4%多聚甲醛固定，備用。

4.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）、過碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff， PAS）和馬松（Masson）染色觀察腎臟病理學(xué)變化 將各組小鼠腎組織用4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)石蠟包埋組織、切片和脫蠟水化后，分別進(jìn)行HE、PAS、Masson 染色，封片，正置顯微鏡下觀察切片，放大200倍采集圖像。

4.5 巨噬細(xì)胞、Th17細(xì)胞和凋亡相關(guān)標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)染色 組織連續(xù)切片法將各組小鼠腎組織石蠟塊切取4 μm 厚度的，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)后冷卻，浸泡于3 %的H2O2中30 min 去除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，滴加10 %山羊血清室溫封閉30 min，甩去血清，用10 %山羊血清稀釋Ⅰ抗［PFN1（1∶100）、CD11b（1∶6 000）、F4/80（1∶500）、CCR4（1∶200）、IL-1R1（1∶100）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶200）、caspase-3 抗體（1∶200）］，4℃孵育過夜，TBST 漂洗后滴加羊抗兔的Ⅱ抗，37 ℃孵育45 min，新鮮配制的DAB 顯色液顯色后用蘇木素染核，鹽酸酒精分化1～2 s，洗凈，返藍(lán)液返藍(lán)數(shù)秒后洗凈，封片劑封片，晾干，鏡檢。顯微鏡下在陽性細(xì)胞區(qū)域隨機(jī)選擇5 個視野，對染色進(jìn)行評分：以染色強(qiáng)度評分值［陰性（無著色）0 分、弱陽性（淡黃色）1 分、中陽性（棕黃色）2分和強(qiáng)陽性（棕褐色）3分］與相應(yīng)的陽性細(xì)胞百分比乘積為總評分。

4.6 Western blot 檢測PFN1、MCP-1 和caspase-3 蛋白的表達(dá)情況 為研究PFN1 在DN 中的作用，課題組前期已用高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞建立DN 細(xì)胞模型；并將PFN1基因過表達(dá)或敲除［12］。

將第3～12 代HK-2 細(xì)胞（P3-P12）接種到6 孔板中（每孔約2×105個細(xì)胞）。將細(xì)胞分為6 組，每組3個復(fù)孔。即對照組（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖（45 mmol/L D-葡萄糖）誘導(dǎo)72 h 組、shRNA 載體轉(zhuǎn)染+高糖誘導(dǎo)72 h組、PFN1 shRNA 轉(zhuǎn)染+高糖誘導(dǎo)72 h組、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染+高糖誘導(dǎo)72 h 組和PFN1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+高糖誘導(dǎo)72 h 組。細(xì)胞經(jīng)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染shRNA 或PFN1 質(zhì)粒24 h 后，換成高糖培養(yǎng)液（45 mmol/L D-葡萄糖DMEM+10% FBS）繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

細(xì)胞去除培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上刮取細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提??；使用BCA 法測定細(xì)胞總蛋白濃度；100 ℃蛋白變性5 min；使用預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE，各孔的上樣體積根據(jù)所測得的蛋白濃度計算，電壓調(diào)至140 V，電泳50 min 后停止。電泳結(jié)束后，取出膠，快速轉(zhuǎn)膜16 min；取出膜，用無蛋白快速封閉液在搖床下封閉10 min；4 ℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜；TBST 漂洗3 次，每次5 min；常溫?fù)u床上孵育Ⅱ抗1 h；TBST 漂洗3 次，每次5 min；ECL 顯色和曝光。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

生信分析的數(shù)據(jù)處理與分析均通過R 軟件（4.0.2版本）完成。對于兩組連續(xù)變量的比較，通過獨(dú)立Studentt檢驗估計正態(tài)分布變量的統(tǒng)計顯著性，并通過Mann-Whitney U檢驗（即Wilcoxon秩和檢驗）分析非正態(tài)分布變量間的差異?？ǚ綑z驗或Fisher精確檢驗用于比較和分析兩組分類變量之間的統(tǒng)計顯著性。PFN1 與免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)性分析采用Pearson分析。所有的統(tǒng)計P值均為雙側(cè)，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

其他數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)分析DN患者腎組織芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE30122中細(xì)胞免疫浸潤情況

DN 患者腎組織芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE30122 中，與正常腎臟組織相比，PFN1基因在DN 患者的腎臟組織中表達(dá)量顯著升高（P<0.01），見圖1A。本研究進(jìn)一步分析不同免疫細(xì)胞亞群與PFN1 表達(dá)的相關(guān)性，見圖1B。結(jié)果顯示，PFN1基因的表達(dá)與T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有顯著相關(guān)性，其中與CD4初始細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（M1 和M2）、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞（靜息）呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性；與幼稚B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。

Figure 1. The correlation expression of PFN1 and immunocyte infiltration in the data set GSE30122 of transcriptome expression in diabetic nephropathy （DN） kidney tis‐sues. A： PFN1 gene expression in kidney tissue of DN patients. **P<0.01 vs control group. B： the corre‐lation expression of PFN1 and different subsets of im‐mune cells. A stronger correlation is indicated by a deeper shade of red， while a weaker correlation is rep‐resented by a deeper shade of blue. The color scale is represented as follows： a higher positive correlation（approaching 1） is associated with a deeper shade of blue， while a higher negative correlation（approaching?1） is associated with a deeper shade of red.圖1 糖尿病腎病患者腎組織芯片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE30122中PFN1的表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤情況

2 DN小鼠中腎組織病理變化和PFN1的表達(dá)

DN 小鼠腎組織HE 染色可見腎小球肥大，系膜擴(kuò)張；腎小管肥大、管腔增大；間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。PAS 染色結(jié)果顯示，DN 組可見腎小球系膜區(qū)明顯增寬，基底膜明顯增厚，細(xì)胞外基質(zhì)累積。Masson染色可見DN組腎小球基底膜明顯增厚，膠原纖維增多。見圖2。

Figure 2. Pathological changes of kidney tissue in diabetic ne‐phropathy （DN） mice （scale bar=100 μm）. A and B： HE staining of renal tissue in mice. In DN group，glomerular hypertrophy， mesangial dilation， renal tu‐bule hypertrophy and lumen enlargement. C and D：PAS staining of renal tissue in mice. In DN group，the glomerular mesangial zone exhibited significant widening， the basement membrane displayed notice‐able thickening， and there was evident accumulation of extracellular matrix. E and F： Masson staining of renal tissue in mice. In DN group， the glomerular basement membrane exhibited a substantial increase in thickness， accompanied by a notable augmentation in collagen fibers. Blue color represents the positive expression of collagen fiber.圖2 糖尿病腎病小鼠中腎組織病理變化

進(jìn)一步對小鼠腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，與正常組比較，DN 組PFN1 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），見圖3。

Figure 3. The expression of PFN1 in renal tissue of diabetic ne‐phropathy （DN） mice was detected by immunohisto‐chemical （IHC） staining （scale bar=100 μm）. The expression of PFN1 was significantly increased in DN group. The brown hue is indicative of PFN1 positivi‐ty， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control group.圖3 糖尿病腎病小鼠中腎組織PFN1的表達(dá)情況

3 DN 小鼠中巨噬細(xì)胞和Th17 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況

根據(jù)圖1B 生信分析的結(jié)果，選擇了巨噬細(xì)胞的CD11b 和F4/80，Th17 細(xì)胞的CCR4 和IL-1R1 表面標(biāo)記物進(jìn)行分析。與正常組比較，DN 組免疫指標(biāo)CD11b、F4/80 表達(dá)顯著增多（P<0.01）。CCR4 在腎小球中部分表達(dá)； IL-1R1 在腎小管和腎小球中表達(dá)均顯著增多（P<0.01），見圖4、5。

Figure 4. Immune infiltration of macrophage in renal tissue of diabetic nephropathy（DN） mice. The expression of CD11b and F4/80 in renal tissue was detected by immunohistochemical （IHC） staining（scale bar=100 μm）. The expression of CD11b and F4/80 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖4 糖尿病腎病小鼠中腎組織中巨噬細(xì)胞免疫浸潤情況

Figure 5. Immune infiltration of Th17 cells in renal tissue of diabetic nephropathy（DN） mice. The expression of CCR4 and IL-1R1 in renal tissue detected by immunohistochemical （IHC） staining （scale bar=100 μm）. The expression of CCR4 and IL-1R1 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖5 糖尿病腎病小鼠中腎組織Th17細(xì)胞免疫浸潤情況

4 DN小鼠中腎組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

進(jìn)一步檢測DN 小鼠中腎組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 和caspase-3，與正常組比較，DN 組腎小管中細(xì)胞胞漿中可見棕色或棕褐色著色；腎小管中Bax、Bcl-2 和caspase-3 蛋白的表達(dá)均顯著升高（P<0.01），見圖6。

Figure 6. Expression of apoptosis markers in renal tissue of diabetic nephropathy（ DN） mice. The expression of Bax， Bcl-2 and cas‐pase-3 in renal tissue detected by immunohistochemical（ IHC） staining（ scale bar=100 μm）. The expression of Bax， Bcl-2 and caspase-3 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased in‐tensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖6 糖尿病腎病小鼠中腎組織細(xì)胞凋亡指標(biāo)的表達(dá)情況

5 在高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞中，過表達(dá)PFN1 促進(jìn)MCP-1和caspase-3蛋白表達(dá)

過表達(dá)PFN1后，高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)72 h，MCP-1和caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01），見圖7。

Figure 7. Effects of PFN1 overexpression on the protein expression of MCP-1 and caspase-3 in HK-2 cells induced by high glucose（HG） for 72 h. The protein levels of PFN1， MCP-1 and caspase-3 were assessed by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs HG group.圖7 過表達(dá)PFN1對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中MCP-1和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

討 論

DN 是常見的慢性腎臟疾病，其發(fā)病率和死亡率在人群中迅速上升［22-23］。研究表明，DN 的發(fā)病機(jī)制涉及高血糖、AGEs、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、氧化應(yīng)激等多種代謝和血流動力學(xué)因素的相互作用［24-26］。慢性炎癥是DN的致病因素之一。

PFN1 作為一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，其失調(diào)已被報道與人類惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)皮功能障礙、心血管等疾病有關(guān)。PFN1 通過缺氧誘導(dǎo)因子-1依賴途徑介導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜病變微血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［27］。研究表明：PFN1 在動脈粥樣斑塊處的表達(dá)顯著增加，提示其在介導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮重要作用。而晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大以及免疫反應(yīng)是糖尿病心肌病發(fā)病和發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)［9，28］。因此，PFN1 參與血管內(nèi)皮功能調(diào)控，在血管性疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。此外，PFN1 可通過上調(diào)整合素α5β1 介導(dǎo)星形孢菌素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［29］。而α5β1 已被報道與腫瘤免疫逃逸有關(guān)，這就提示了PFN1可能具有調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境的功能［30］。然而，目前關(guān)于PFN1與DN的免疫浸潤關(guān)系的報道較少。

本研究首先利用DN 患者腎組織芯片轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)分析PFN1的表達(dá)水平和免疫細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果顯示：PFN1基因表達(dá)量顯著升高且與巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞有顯著的相關(guān)性。隨后，DN 小鼠實驗中可見模型組小鼠的腎臟組織中PFN1表達(dá)量顯著升高，且CD11b、F4/80、CCR4 和IL-1R1 免疫指標(biāo)以及Bax、Bcl-2 和caspase-3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)升高。最后，細(xì)胞實驗結(jié)果顯示PFN1過表達(dá)后可促進(jìn)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞MCP-1和caspase-3蛋白的表達(dá)。本研究顯示PFN1失調(diào)與DN有關(guān)，同時提示PFN1的致病機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

炎癥分子和細(xì)胞因子間形成的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)，構(gòu)成細(xì)胞免疫浸潤和慢性炎癥反應(yīng)等腎臟繼發(fā)性病理改變。葡萄糖和代謝產(chǎn)物的積累激活腎臟中巨噬細(xì)胞增多；巨噬細(xì)胞免疫浸潤和高血糖水平、AGEs、血管緊張素-II 和促炎因子誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞和足細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1，募集外周單核細(xì)胞，引起腎細(xì)胞（足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等）損傷［31］。MCP-1 可以與細(xì)胞表面的CCR2 趨化因子受體相互作用，介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)［32］。腎小管上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞通訊通過細(xì)胞外囊泡轉(zhuǎn)移形成負(fù)反饋環(huán)促進(jìn)DN 腎臟炎癥和細(xì)胞凋亡，在DN 的發(fā)生和發(fā)展和進(jìn)展中起著重要作用［33］。抑制巨噬細(xì)胞活化/轉(zhuǎn)變和巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞相互作用可能是減弱DN 的方法［34］。此外，TH17 輔助性T 細(xì)胞表達(dá)CCR4 并分泌細(xì)胞因子，如IL-17A 和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。研究表明，Toll 樣受體 4（TLR 4）活化可促進(jìn)DN足細(xì)胞損傷和間質(zhì)纖維化，過表達(dá)TLR 4 可能通過激活TH17 細(xì)胞參與DN 的免疫發(fā)病機(jī)制［35］。IL-1R1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)已被認(rèn)為在TH17 細(xì)胞分化和自身免疫性疾病發(fā)生中的作用［36］。Th17 可能在DN 的進(jìn)展中發(fā)揮獨(dú)立的作用，或與其他炎癥細(xì)胞共同作用，促進(jìn)DN腎臟炎癥和細(xì)胞凋亡。

而本研究結(jié)果顯示DN 小鼠腎組織中PFN1表達(dá)升高，巨噬細(xì)胞和Th17 細(xì)胞免疫浸潤。高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞模型中過表達(dá)PFN1可促進(jìn)MCP-1 和cas‐pase-3 蛋白的表達(dá)。綜上所述，我們推測DN 小鼠腎組織中PFN1 的表達(dá)可能與巨噬細(xì)胞和Th17 細(xì)胞免疫浸潤有關(guān)，促進(jìn)DN 細(xì)胞凋亡。后續(xù)將繼續(xù)在整體水平明確PFN1通過免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)DN 細(xì)胞凋亡的作用，并闡明PFN1調(diào)控MCP-1和caspase-3蛋白表達(dá)的分子機(jī)制。