糖尿病腎病小鼠中前纖維蛋白1的表達和免疫細胞浸潤分析*

麥麗萍， 黃桂萍， 鄧春玉， 鄭丹琳， 李曉紅， 何國東

［南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）醫學研究部，廣東 廣州 510080］

糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）是導致終末期腎病的主要原因之一，與腎小球、血管和腎小管損傷有關。數據顯示，我國20%～40%的糖尿病患者可并發DN，這些病人常伴有心血管和神經系統疾病等基礎病，加重了DN 的疾病進展和增加死亡風險［1］。因此，探索DN 的發病機制和有效的藥物研發備受關注，然而目前DN 的發病機制尚不明確。既往研究顯示，高血糖和氧化應激引起的血管功能障礙是DN 發病的重要因素；晚期糖基化終產物（ad‐vanced glycation end products， AGEs）積累，與其受體RAGE 結合，誘導產生活性氧（reactive oxygen spe‐cies， ROS）激活相關的信號通路，活化下游靶分子，如：核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起腎臟損傷，在DN的發生與發展過程中起著關鍵作用［2-4］。

前纖維蛋白1（profilin 1， PFN1）是前纖維蛋白（profilin， PFN）的亞型之一，在進化上高度保守的一種肌動蛋白結合蛋白，普遍存在于所有真核生物中，被認為有3 個結構域：肌動蛋白結合結構域、聚L-脯氨酸結合結構域和磷脂酰肌醇結合結構域。PFN1作為關鍵的小分子肌動蛋白調節蛋白，通過其結構域調控肌動蛋白的聚合-解聚動態平衡，介導細胞收縮和細胞骨架的改變［5］。PFN1還作為關鍵信號分子的相互作用網絡樞紐，通過結構域與靶蛋白的相互結合參與蛋白質的跨膜轉運、小G 蛋白信號通路的活化以及核內轉錄等一系列重要的生理、病理過程［6］。由此可見，PFN1 在許多細胞功能中起著至關重要的作用，包括膜運輸、內吞、細胞周期、運動、增殖、細胞存活、轉錄、干細胞和自噬等。PFN1 的異常表達或缺失可影響細胞的正常生理活動并導致疾病的發展。目前，PFN1 在人類惡性腫瘤、神經系統疾病和內皮功能障礙中異常表達［7-8］。PFN1在AGEs誘導的心肌細胞肥大和凋亡中起到強而有力的調節作用。AGEs 通過提高ROS 的產生，RhoA 和ROCK2 的表達來增加PFN1 的表達，PFN1 升高促進肌動蛋白細胞骨架的紊亂；下調PFN1 可減輕H9c2 細胞AGEs誘導的心肌細胞肥大和凋亡［9］。

PFN1 可調節滋養層細胞侵襲和巨噬細胞分化；在滋養層細胞中下調PFN1 可通過NF-κB 信號通路促進腫瘤壞死因子α 分泌，誘導巨噬細胞極化為M1表型［10］。DN 腎小管上皮細胞與巨噬細胞之間的通訊通過細胞外小泡轉移形成負反饋環，促進腎臟炎癥和凋亡［11］。課題組前期研究顯示：PFN1 可通過Hedgehog信號通路促進DN腎小管上皮細胞凋亡［12］。本項工作擬進一步觀察DN 小鼠中PFN1的表達和免疫細胞浸潤情況。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級8 周 齡雄性C57BL/6 小 鼠16 只，體重量（20±5） g，購自廣東省醫學實驗動物中心［許可證號：SCXK（粵）2022-0002］。飼養室溫、濕度、光照適宜，普通飼料喂養。

2 細胞株

人腎皮質近曲小管上皮細胞系HK-2 購自賽業生物科技有限公司（貨號： H4-0501），該細胞株已鑒定。HK-2 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，37 ℃，5% CO2的環境中培養生長。

3 主要實驗試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）購自Sigma；PFN1 抗體（67390-1-Ig）、胱天蛋白酶3（caspase-3）抗體（19677-1-AP）和單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1）抗體（26161-1-AP）購自Proteintech；B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（BA0412）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-asso‐ciated X protein， Bax）抗體（A00183）、GAPDH 抗體（A00227-1）和HRP Ⅱ抗（BA1050 和BA1054）均購自Boster；CC 趨化因子受體4（CC chemokine receptor 4，CCR4）抗體（TD10206S）和白細胞介素1 受體I型（in‐terleukin-1 receptor type I， IL-1R1）抗體（PK06667S）購自Abmart；CD11b 抗體（ab133357）和山羊抗兔IgG-HRP（ab205718）購自 Abcam；F4/80 抗體（70076S）購自CST；Harris蘇木素染色液（BA4041）購自珠海貝索生物技術有限公司；DAB 顯色試劑盒（DAB-4033）購自福州邁新生物技術開發。胎牛血清（AB-FBS-ED1050）購自Abwbio；DMEM/F12 培養液（C11330500BT）購 自Gibco；Lipofectamine 2000（11668019 ）購自Invitrogen。

4 主要方法

4.1 數據下載 從GEO 數據庫官網（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/）下載樣本來源可靠的DN 患者芯片表達數據集GSE30122［13-14］，使用R 軟件（ver‐sion 4.0.2，http：//r-project. org/）的affy 包［15］讀 取 數據，通過背景校正，數據均一化處理，最終獲得該數據集的基因表達矩陣。數據集中的樣本均來自于Homo sapiens，平臺基于GPL571［HG-U133A_2］ Af‐fymetrix Human Genome U133A 2.0 Array，其中包括19例DN患者和50例正常腎臟樣本。

4.2 DN 患者腎臟組織免疫細胞浸潤水平 CIBER‐SORT 是基于線性支持向量回歸原理對人類免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的工具。對芯片表達矩陣進行非負矩陣分解后計算不同細胞類型的比例。該方法基于已知參考數據集，提供22 種免疫細胞亞型的基因表達特征集［16］。本研究通過利用CIBERSORT 分析并比較DN 與非DN 患者腎臟組織免疫細胞浸潤水平。

4.3 實驗動物的分組和造模 將16 只C57BL/6 小鼠編號，稱量體重，并隨機分為正常組和模型組（DN組），每組各8 只。參照課題組前期的研究方法［12］，采用腹腔注射STZ 法建立DN 小鼠模型［17-19］，適應性喂養1 周后，腹腔連續5 d 注射STZ（50 mg/kg）， 5 d后檢測血糖水平，若血糖>16.7 mmol/L 可判斷糖尿病模型造模成功，此后每周監測小鼠血糖和24 h 尿微量蛋白水平。8 周后若24 h 尿微量蛋白大于 30 mg則認為DN 模型成功［20-21］。造模成功后，脊椎脫臼法處死小鼠后開腹取腎臟，立即放于4%多聚甲醛固定，備用。

4.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）、過碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff， PAS）和馬松（Masson）染色觀察腎臟病理學變化 將各組小鼠腎組織用4%多聚甲醛固定液固定，常規石蠟包埋組織、切片和脫蠟水化后，分別進行HE、PAS、Masson 染色，封片，正置顯微鏡下觀察切片，放大200倍采集圖像。

4.5 巨噬細胞、Th17細胞和凋亡相關標記物的免疫組織化學染色 組織連續切片法將各組小鼠腎組織石蠟塊切取4 μm 厚度的，常規脫蠟水化，抗原修復后冷卻，浸泡于3 %的H2O2中30 min 去除內源性過氧化物酶活性后，滴加10 %山羊血清室溫封閉30 min，甩去血清，用10 %山羊血清稀釋Ⅰ抗［PFN1（1∶100）、CD11b（1∶6 000）、F4/80（1∶500）、CCR4（1∶200）、IL-1R1（1∶100）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶200）、caspase-3 抗體（1∶200）］，4℃孵育過夜，TBST 漂洗后滴加羊抗兔的Ⅱ抗，37 ℃孵育45 min，新鮮配制的DAB 顯色液顯色后用蘇木素染核，鹽酸酒精分化1～2 s，洗凈，返藍液返藍數秒后洗凈，封片劑封片，晾干，鏡檢。顯微鏡下在陽性細胞區域隨機選擇5 個視野，對染色進行評分：以染色強度評分值［陰性（無著色）0 分、弱陽性（淡黃色）1 分、中陽性（棕黃色）2分和強陽性（棕褐色）3分］與相應的陽性細胞百分比乘積為總評分。

4.6 Western blot 檢測PFN1、MCP-1 和caspase-3 蛋白的表達情況 為研究PFN1 在DN 中的作用，課題組前期已用高糖誘導HK-2 細胞建立DN 細胞模型；并將PFN1基因過表達或敲除［12］。

將第3～12 代HK-2 細胞（P3-P12）接種到6 孔板中（每孔約2×105個細胞）。將細胞分為6 組，每組3個復孔。即對照組（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖（45 mmol/L D-葡萄糖）誘導72 h 組、shRNA 載體轉染+高糖誘導72 h組、PFN1 shRNA 轉染+高糖誘導72 h組、質粒載體轉染+高糖誘導72 h 組和PFN1 質粒轉染+高糖誘導72 h 組。細胞經Lipofectamine 2000 轉染shRNA 或PFN1 質粒24 h 后，換成高糖培養液（45 mmol/L D-葡萄糖DMEM+10% FBS）繼續培養72 h。

細胞去除培養液，PBS洗3次，加入細胞裂解液，冰上刮取細胞進行總蛋白提取；使用BCA 法測定細胞總蛋白濃度；100 ℃蛋白變性5 min；使用預制膠進行SDS-PAGE，各孔的上樣體積根據所測得的蛋白濃度計算，電壓調至140 V，電泳50 min 后停止。電泳結束后，取出膠，快速轉膜16 min；取出膜，用無蛋白快速封閉液在搖床下封閉10 min；4 ℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜；TBST 漂洗3 次，每次5 min；常溫搖床上孵育Ⅱ抗1 h；TBST 漂洗3 次，每次5 min；ECL 顯色和曝光。

5 統計學處理

生信分析的數據處理與分析均通過R 軟件（4.0.2版本）完成。對于兩組連續變量的比較，通過獨立Studentt檢驗估計正態分布變量的統計顯著性，并通過Mann-Whitney U檢驗（即Wilcoxon秩和檢驗）分析非正態分布變量間的差異。卡方檢驗或Fisher精確檢驗用于比較和分析兩組分類變量之間的統計顯著性。PFN1 與免疫細胞浸潤水平相關性分析采用Pearson分析。所有的統計P值均為雙側，以P<0.05為有統計學意義。

其他數據處理采用GraphPad Prism 9.0 統計軟件，所有數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗進行分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 生物信息學分析DN患者腎組織芯片表達數據集GSE30122中細胞免疫浸潤情況

DN 患者腎組織芯片表達數據集GSE30122 中，與正常腎臟組織相比，PFN1基因在DN 患者的腎臟組織中表達量顯著升高（P<0.01），見圖1A。本研究進一步分析不同免疫細胞亞群與PFN1 表達的相關性，見圖1B。結果顯示，PFN1基因的表達與T 細胞和巨噬細胞具有顯著相關性，其中與CD4初始細胞、γδT 細胞、巨噬細胞（M1 和M2）、漿細胞和肥大細胞（靜息）呈現顯著的正相關性；與幼稚B 細胞、樹突狀細胞和活化的肥大細胞呈現顯著的負相關性。

Figure 1. The correlation expression of PFN1 and immunocyte infiltration in the data set GSE30122 of transcriptome expression in diabetic nephropathy （DN） kidney tis‐sues. A： PFN1 gene expression in kidney tissue of DN patients. **P<0.01 vs control group. B： the corre‐lation expression of PFN1 and different subsets of im‐mune cells. A stronger correlation is indicated by a deeper shade of red， while a weaker correlation is rep‐resented by a deeper shade of blue. The color scale is represented as follows： a higher positive correlation（approaching 1） is associated with a deeper shade of blue， while a higher negative correlation（approaching?1） is associated with a deeper shade of red.圖1 糖尿病腎病患者腎組織芯片轉錄組數據集GSE30122中PFN1的表達和免疫細胞浸潤情況

2 DN小鼠中腎組織病理變化和PFN1的表達

DN 小鼠腎組織HE 染色可見腎小球肥大，系膜擴張；腎小管肥大、管腔增大；間質可見少量炎癥細胞浸潤。PAS 染色結果顯示，DN 組可見腎小球系膜區明顯增寬，基底膜明顯增厚，細胞外基質累積。Masson染色可見DN組腎小球基底膜明顯增厚，膠原纖維增多。見圖2。

Figure 2. Pathological changes of kidney tissue in diabetic ne‐phropathy （DN） mice （scale bar=100 μm）. A and B： HE staining of renal tissue in mice. In DN group，glomerular hypertrophy， mesangial dilation， renal tu‐bule hypertrophy and lumen enlargement. C and D：PAS staining of renal tissue in mice. In DN group，the glomerular mesangial zone exhibited significant widening， the basement membrane displayed notice‐able thickening， and there was evident accumulation of extracellular matrix. E and F： Masson staining of renal tissue in mice. In DN group， the glomerular basement membrane exhibited a substantial increase in thickness， accompanied by a notable augmentation in collagen fibers. Blue color represents the positive expression of collagen fiber.圖2 糖尿病腎病小鼠中腎組織病理變化

進一步對小鼠腎組織進行免疫組織化學染色，與正常組比較，DN 組PFN1 表達顯著上調（P<0.01），見圖3。

Figure 3. The expression of PFN1 in renal tissue of diabetic ne‐phropathy （DN） mice was detected by immunohisto‐chemical （IHC） staining （scale bar=100 μm）. The expression of PFN1 was significantly increased in DN group. The brown hue is indicative of PFN1 positivi‐ty， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs control group.圖3 糖尿病腎病小鼠中腎組織PFN1的表達情況

3 DN 小鼠中巨噬細胞和Th17 細胞相關蛋白表達情況

根據圖1B 生信分析的結果，選擇了巨噬細胞的CD11b 和F4/80，Th17 細胞的CCR4 和IL-1R1 表面標記物進行分析。與正常組比較，DN 組免疫指標CD11b、F4/80 表達顯著增多（P<0.01）。CCR4 在腎小球中部分表達； IL-1R1 在腎小管和腎小球中表達均顯著增多（P<0.01），見圖4、5。

Figure 4. Immune infiltration of macrophage in renal tissue of diabetic nephropathy（DN） mice. The expression of CD11b and F4/80 in renal tissue was detected by immunohistochemical （IHC） staining（scale bar=100 μm）. The expression of CD11b and F4/80 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖4 糖尿病腎病小鼠中腎組織中巨噬細胞免疫浸潤情況

Figure 5. Immune infiltration of Th17 cells in renal tissue of diabetic nephropathy（DN） mice. The expression of CCR4 and IL-1R1 in renal tissue detected by immunohistochemical （IHC） staining （scale bar=100 μm）. The expression of CCR4 and IL-1R1 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased intensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖5 糖尿病腎病小鼠中腎組織Th17細胞免疫浸潤情況

4 DN小鼠中腎組織細胞凋亡相關蛋白表達情況

進一步檢測DN 小鼠中腎組織細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 和caspase-3，與正常組比較，DN 組腎小管中細胞胞漿中可見棕色或棕褐色著色；腎小管中Bax、Bcl-2 和caspase-3 蛋白的表達均顯著升高（P<0.01），見圖6。

Figure 6. Expression of apoptosis markers in renal tissue of diabetic nephropathy（ DN） mice. The expression of Bax， Bcl-2 and cas‐pase-3 in renal tissue detected by immunohistochemical（ IHC） staining（ scale bar=100 μm）. The expression of Bax， Bcl-2 and caspase-3 increased significantly in DN group. The color brown is indicative of positive expression， with increased in‐tensity of staining correlating with heightened expression levels. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs control group.圖6 糖尿病腎病小鼠中腎組織細胞凋亡指標的表達情況

5 在高糖誘導HK-2 細胞中，過表達PFN1 促進MCP-1和caspase-3蛋白表達

過表達PFN1后，高糖誘導HK-2 細胞培養72 h，MCP-1和caspase-3蛋白表達上調（P<0.01），見圖7。

Figure 7. Effects of PFN1 overexpression on the protein expression of MCP-1 and caspase-3 in HK-2 cells induced by high glucose（HG） for 72 h. The protein levels of PFN1， MCP-1 and caspase-3 were assessed by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs HG group.圖7 過表達PFN1對高糖誘導HK-2細胞中MCP-1和caspase-3蛋白表達的影響

討 論

DN 是常見的慢性腎臟疾病，其發病率和死亡率在人群中迅速上升［22-23］。研究表明，DN 的發病機制涉及高血糖、AGEs、腎素-血管緊張素系統、氧化應激等多種代謝和血流動力學因素的相互作用［24-26］。慢性炎癥是DN的致病因素之一。

PFN1 作為一種肌動蛋白結合蛋白，其失調已被報道與人類惡性腫瘤、神經系統疾病、內皮功能障礙、心血管等疾病有關。PFN1 通過缺氧誘導因子-1依賴途徑介導糖尿病視網膜病變微血管內皮功能障礙，促進細胞凋亡［27］。研究表明：PFN1 在動脈粥樣斑塊處的表達顯著增加，提示其在介導內皮功能障礙中發揮重要作用。而晚期糖基化終產物誘導的心肌細胞肥大以及免疫反應是糖尿病心肌病發病和發展的重要病理基礎［9，28］。因此，PFN1 參與血管內皮功能調控，在血管性疾病的發生與發展中起著重要的作用。此外，PFN1 可通過上調整合素α5β1 介導星形孢菌素誘導乳腺癌細胞凋亡［29］。而α5β1 已被報道與腫瘤免疫逃逸有關，這就提示了PFN1可能具有調節免疫微環境的功能［30］。然而，目前關于PFN1與DN的免疫浸潤關系的報道較少。

本研究首先利用DN 患者腎組織芯片轉錄組表達數據分析PFN1的表達水平和免疫細胞浸潤情況，結果顯示：PFN1基因表達量顯著升高且與巨噬細胞和T 細胞有顯著的相關性。隨后，DN 小鼠實驗中可見模型組小鼠的腎臟組織中PFN1表達量顯著升高，且CD11b、F4/80、CCR4 和IL-1R1 免疫指標以及Bax、Bcl-2 和caspase-3 凋亡相關蛋白表達升高。最后，細胞實驗結果顯示PFN1過表達后可促進人腎皮質近曲小管上皮細胞MCP-1和caspase-3蛋白的表達。本研究顯示PFN1失調與DN有關，同時提示PFN1的致病機制可能與免疫調節作用有關。

炎癥分子和細胞因子間形成的復雜細胞因子網，構成細胞免疫浸潤和慢性炎癥反應等腎臟繼發性病理改變。葡萄糖和代謝產物的積累激活腎臟中巨噬細胞增多；巨噬細胞免疫浸潤和高血糖水平、AGEs、血管緊張素-II 和促炎因子誘導腎小管細胞和足細胞產生MCP-1，募集外周單核細胞，引起腎細胞（足細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞等）損傷［31］。MCP-1 可以與細胞表面的CCR2 趨化因子受體相互作用，介導炎癥免疫反應［32］。腎小管上皮細胞與巨噬細胞通訊通過細胞外囊泡轉移形成負反饋環促進DN 腎臟炎癥和細胞凋亡，在DN 的發生和發展和進展中起著重要作用［33］。抑制巨噬細胞活化/轉變和巨噬細胞及其他細胞相互作用可能是減弱DN 的方法［34］。此外，TH17 輔助性T 細胞表達CCR4 并分泌細胞因子，如IL-17A 和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。研究表明，Toll 樣受體 4（TLR 4）活化可促進DN足細胞損傷和間質纖維化，過表達TLR 4 可能通過激活TH17 細胞參與DN 的免疫發病機制［35］。IL-1R1信號轉導已被認為在TH17 細胞分化和自身免疫性疾病發生中的作用［36］。Th17 可能在DN 的進展中發揮獨立的作用，或與其他炎癥細胞共同作用，促進DN腎臟炎癥和細胞凋亡。

而本研究結果顯示DN 小鼠腎組織中PFN1表達升高，巨噬細胞和Th17 細胞免疫浸潤。高糖誘導HK-2 細胞模型中過表達PFN1可促進MCP-1 和cas‐pase-3 蛋白的表達。綜上所述，我們推測DN 小鼠腎組織中PFN1 的表達可能與巨噬細胞和Th17 細胞免疫浸潤有關，促進DN 細胞凋亡。后續將繼續在整體水平明確PFN1通過免疫調節促進DN 細胞凋亡的作用，并闡明PFN1調控MCP-1和caspase-3蛋白表達的分子機制。