溫陽生肌膏調控GRP78/CHOP通路抑制過度內質網應激促糖尿病難愈合創面修復*

丁雅容， 鄭時旭， 王 君， 謝晨磊， 奉水華， 周忠志，△， 陳 麗△

（1湖南中醫藥大學第一附屬醫院燒傷瘡瘍整形科，湖南 長沙 410007；2湖南中醫藥大學血管生物學與轉化醫學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3海南省人民醫院，海南 海口 570311）

糖尿病是以血糖濃度持續性升高為主要臨床特征的慢性代謝性疾病，目前全球發病人數已達5.37億，而中國約有1.12 億，糖尿病廣泛影響人體各器官代謝功能，使機體出現多種并發癥，嚴重威脅人類的生命健康［1］。糖尿病難愈合創面是糖尿病主要并發癥之一，并發率高達19%～34%，患者常由于肢體壞死而截肢或出現感染而導致死亡，且經過治療后創面復發率高達 65%，給患者及其家庭造成沉重負擔［2-3］。研究發現，糖尿病環境導致進行性增強的內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）并造成下游一系列病理生理變化可能是糖尿病難愈合創面發病及遷延的關鍵原因［4］。生理狀態下，當細胞受到外界刺激時，內質網發生ERS 進而激活蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic re‐ticulum kinase， PERK）、IRE1/X-box 結合蛋白1（Xbox binding protein-1，XBP-1）、激活轉錄因子6（acti‐vating transcription factor 6，ATF6）介導未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）清除錯誤折疊蛋白以恢復細胞功能［5］。而當高糖環境持續損傷細胞時，PERK、XBP-1、ATF6的共同解離調控因子葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78， CRP78）將會顯著上調，從而使ERS 過度激活并引起下游CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/nhancer binding protein homologous protein， CHOP）大量增加，引起procaspase-12 大量活化為caspase-12，引發細胞凋亡，介導疾病發生［6］，但此機制在糖尿病難愈合創面中的相關研究卻少見報道。

溫陽生肌膏（WYSJG）由丁香、肉桂、乳香和沒藥精密配伍而成，具有溫陽祛腐、活血生肌之功效，前期研究已發現其可促進糖尿病患者及大鼠難愈合創面修復［7-8］，但其具體機制仍未闡明。現代藥理學研究發現，溫陽生肌膏中有效成分沒食子酸等物質干預可降低大鼠糖尿病難愈合創面ERS 水平、IL-6、TNF-α 等炎癥因子含量并減輕相關損傷［9］。但其是否可通過降低GRP78/CHOP 通路抑制過度ERS，減少創面細胞凋亡促進糖尿病難愈合創面愈合卻并不明確。因此，本研究通過制備大鼠糖尿病難愈合創面模型，觀察溫陽生肌膏干預后的治療作用及其對GRP78/CHOP 通路的影響，探究溫陽生肌膏治療糖尿病難愈合創面的相關機制，為其臨床治療糖尿病難愈合創面的深入研究提供實驗基礎。

材料和方法

1 動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養及實驗操作均在湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心屏障動物實驗設施內進行，實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。本實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會審查，倫理批號：ZYFY20221111-53。

2 實驗主要試劑和儀器

2.1 實驗藥物 溫陽生肌膏：丁香、肉桂、乳香和沒藥組成，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科制備。貝復新，即重組牛堿性成纖維細胞生長因子外用凝膠（recombinant bovine basic fibroblast growth fac‐tor gel，rb-bFGF）購自珠海億勝生物制藥有限公司。

2.2 實驗試劑 高脂飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；鏈脲霉素（streptozotocin， STZ）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；DAB 染液和HRP 山羊抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔熒光Ⅱ抗購自武漢亞科因生物科技有限公司；GRP78 和CHOP 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗caspase-12 和β-actin 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；化學發光顯影液和蛋白分子量Marker 購自Thermo Fisher；IL-1β ELISA 檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司

2.3 實驗儀器 RM2235 型切片機、Histocore pearl型全自動脫水機和Histocore Arcadiah 型全自動包埋機購自上海徠卡儀器有限公司；PANNORAMIC 型掃片機購自3DHIESTECH；Axio Examiner 熒光顯微鏡購自卡爾蔡司光學（中國）有限公司；PowerPacBasic電泳轉膜裝置、721BR17573 ChemiDoc XRS 和化學發光成像分析儀購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；Spark 多功能酶標儀購自帝肯（上海）實驗器材有限公司；透射電鏡購自日立（中國）有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠糖尿病難愈合創面模型制備 高脂飼料連續喂養30 d 后連續7 d 按照20 mg/kg 劑量肌肉注射氫化可的松，再以45 mg/kg劑量腹腔注射STZ。若大鼠隨機血糖值連續3 d≥16.7 mmol/L，則認為糖尿病大鼠模型成功。隨后用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在背側部位置備皮，形成兩個4 cm×4 cm 正方形裸皮區域，依次用絡合碘與75%乙醇消毒，在大鼠背部手術形成兩個直徑為1 cm的圓形全層皮膚缺損創面，造模后若出現創面散漫，平坦塌陷，肉芽生長緩慢、顏色蒼白等特征，則認為大鼠糖尿病難愈合創面模型成功［10］。

3.2 分組及處理 正常對照（control）組7 只大鼠創面常規消毒后予生理鹽水涂抹；將糖尿病難愈合創面建模成功的大鼠隨機分為模型（model組）、溫陽生肌膏（WYSJG）組和貝復新（rb-bFGF）組，每組7 只。模型組創面常規消毒后予生理鹽水涂抹，溫陽生肌膏組創面局部外敷溫陽生肌膏，貝復新組創面外敷貝復新，每日換藥1次在處理后的0、5、9和14 d對創面進行拍照記錄，于處理后14 d用4%成巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。以創面為中心取得大小為2 cm×2 cm 的標本，一側創面組織于4%多聚甲醛瓶中固定，常溫保存，用于組織病理學檢測，另一側于?80 ℃凍存，用于分子生物學檢測。

3.3 創面愈合觀察及愈合率計算 創面愈合情況及創面愈合率計算分別于干預后0、5、9 和14 d 觀察各組大鼠創面愈合情況，并用圖像分析軟件ImageJ測定拍攝創面的面積計算創面愈合率。創面愈合率（%）=（原創面面積?相應觀察時間點創面面積）/原創面面積×100%。

3.4 創面組織顯微形態 創面組織病理形態觀察大鼠取材后，于4%多聚甲醛中固定24～48 h，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，石蠟切片，片厚4 μm，采用HE 染色制片觀察局部組織炎癥細胞浸潤、肉芽組織生長情況。

3.5 Western blot 法檢測創面組織GRP78、CHOP 和caspase-12 含量 皮膚創面組織解凍后于RIPA 裂解液研磨，離心取上清，BCA 法測定總蛋白濃度，選擇蛋白質量為20 μg 進行電泳。恒壓60 V 將溴酚藍指示線跑至濃縮膠分離膠交界線后轉100V 跑至膠板底部；恒電流200 mA，100 min 轉膜； 10%脫脂奶粉溶液37 ℃ 孵育2 h進行封閉；加入Ⅰ抗4 ℃搖晃孵育過夜；洗膜后以HRP 標記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育；洗膜后滴加ECL 顯影液后以顯影儀顯影。后以ImageJ 軟件計算條帶平均灰度值，以β-actin 為內參照，反映各組蛋白相對含量。

3.6 免疫組織化學法檢測GRP78、CHOP和caspase-12 表達及分布情況 組織切片常規脫蠟、復水后，EDTA 高壓熱修復，加過氧化物酶阻斷劑，3% BSA 封閉，孵育待檢蛋白Ⅰ抗（GRP78、CHOP 和caspase-12抗體，1∶200），4 ℃冰箱靜置過夜，加入HRP 標記的Ⅱ抗（1∶400），37 ℃避光孵育1 h；采用PBST 洗滌3次，DAB 顯色，蘇木素復染后樹脂膠封片。顯微鏡下檢測大鼠創面細胞GRP78、CHOP 和caspase-12 顯色及分布情況，用ImageJ 軟件測定各指標的陽染情況，以陽性表達量來表示單位面積蛋白表達水平。

3.7 透射電鏡觀察創面組織內質網數量及形態情況 洗凈創面組織戊二醛后，1%鋨酸固定液室溫避光固定50 min。之后進行梯度脫水：50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮Ⅰ 15 min，100%丙酮Ⅱ15 min。組織浸透：100%丙酮+電鏡樹脂包埋液（由Eponate 12 Resin、DDSA、NMA 和DMP-30 混合配制而成）1∶1 混合配置，37 ℃，12 h。樹脂包埋后，放入恒溫烘箱37 ℃烘烤12 h；電鏡組織樹脂固化，60 ℃恒溫烘箱內48 h；樣本進行修整并切片（厚度為50 nm）；3%醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色；日立HT600透射電鏡下觀察并拍照。

3.8 ELISA 檢測創面組織炎癥因子IL-1β 含量 皮膚創面組織解凍后于RIPA 裂解液研磨，離心取上清。分別設空白孔、待測樣品孔，按照相關試劑盒步驟檢測創面組織炎癥因子IL-1β 含量的水平。用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔的光密度（A）值以表征各指標含量。

4 統計學處理

用SPSS 26.0統計軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面愈合情況的影響

如圖1所示，各組大鼠干預后分別于0、5、9、14 d觀察其創面愈合情況。干預5 d 后，除模型組外，其余各組創面組織干燥結痂、分泌物基本消失、創緣收斂情況較好；而模型組仍有大量滲出、愈合情況差、且創緣未觀察到明顯收斂現象。干預9 d后，模型組創緣及創面明顯紅腫，且存在較多紅色分泌物，創面未見明顯愈合；而溫陽生肌膏組創面明顯愈合，創面愈合情況良好，且基本無明顯紅腫等炎癥表現。干預14 d 后，正常組、溫陽生肌膏組、貝復新組創面均已基本愈合，且溫陽生肌膏組愈合效果優于貝復新組；而模型組創面仍存在少量滲出及紅腫表現，上皮化情況不佳，創面情況差。

Figure 1. Observation of healing of refractory wounds in diabetic rats. The representative pictures of the 4 groups indicate the healing process at different time points. Each image is represented as a square measuring 1.5 cm on each side.圖1 糖尿病大鼠難愈合創面的愈合情況

2 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面愈合率的影響

如圖2所示，干預5、9和14 d后，與正常組對比，模型組愈合率顯著降低（P<0.01）；與模型組對比，溫陽生肌膏組及貝復新組創面愈合率顯著增加（P<0.01）；與溫陽生肌膏組對比，貝復新組愈合率雖出現降低但差異無統計學意義（P>0.05）。

Figure 2. The healing rate of refractory wounds in diabetic rats.Wound healing results are presented as the percentages of the initial area. Mean±SD. n=5. ##P<0.01 vs con‐trol group； **P<0.01 vs model group.圖2 糖尿病大鼠難愈合創面愈合率

3 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面組織顯微形態的觀察

如圖3 所示，干預14 d 后取材，通過對創面組織HE 染色后在顯微鏡下觀察發現，正常組創面皮膚層次分明，各層結構排列有序，肉芽組織形成良好，局部炎癥細胞浸潤已基本消散；模型組創面皮膚組織層次欠清晰，細胞形態不佳，同時可見較多炎癥細胞浸潤，肉芽生長停滯；而與模型組對比，溫陽生肌膏組與貝復新組創面皮膚組織層次完整清晰，肉芽組織生長良好并富含新生血管，且炎癥細胞僅存在少量浸潤。

Figure 3. Observation of wound tissue micromorphology in diabetic rats. Arrows in A： hair follicle； arrows in B， E and F： granula‐tion tissue； arrows in C： inflammatory cells； arrows in D， G and H： red blood cells.圖3 糖尿病大鼠難愈合創面組織顯微形態的觀察

4 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達情況的影響

Western blot法實驗結果顯示，與正常組對比，模型組大鼠創面組織GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白表達量明顯增加（P<0.01）；而與模型組對比，溫陽生肌膏組GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量顯著下降（P<0.01），貝復新組GRP78、CHOP 和caspase-12蛋白含量顯著下降（P<0.01）；與溫陽生肌膏組對比，貝復新組GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量增加，但差異無統計學意義（P>0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression of GRP78， CHOP and caspase-12 in refractory wounds of diabetic rats detected by Western blot.Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖4 Western blot檢測糖尿病大鼠難愈合創面GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達情況

如圖5 所示，干預14 d 后取材，以免疫組化法檢測大鼠創面組織GRP78、CHOP和caspase-12蛋白在創面組織中的分布情況及含量。通過ImageJ 軟件進一步對創面組織陽性染色平均光密度值分析，與正常組對比，模型組GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量均顯著增加（P<0.01）；與模型組對比，溫陽生肌膏組與貝復新組GRP78、CHOP和caspase-12蛋白含量均顯著降低（P<0.01）；而貝復新組GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量則高于溫陽生肌膏組，但差異無統計學意義。

5 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面內質網數量及形態的影響

干預14 d 后取材，以透射電鏡觀察各組大鼠創面組織內質網數量及形態。結果顯示：正常組內質網數量適中，且折疊情況良好，形態正常；模型組內質網數量明顯減少，僅存內質網口徑增加，腫脹明顯；溫陽生肌膏組內質網含量豐富，形態規則且折疊整齊；貝復新組內質網含量較多，折疊情況良好但稍有腫脹，見圖6。

6 溫陽生肌膏對糖尿病大鼠難愈合創面組織中炎癥因子IL-1β含量的影響

干預14 d 后取材，以ELISA 法檢測各組大鼠創面組織炎癥因子IL-1β含量。干預14 d后，與正常組對比，模型組IL-1β 含量上調（P<0.01）；與模型組對比，溫陽生肌膏組與貝復新組IL-1β 含量下調（P<0.01）；而貝復新組IL-1β含量高于溫陽生肌膏組，但二者之間不存在統計學差異，見圖7。

Figure 7. Alterations of IL-1β content in refractory wounds of rats in different groups. Mean±SD. n=5. ##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖7 糖尿病大鼠難愈合創面組織炎癥因子IL-1β含量變化

討 論

糖尿病難愈合創面是糖尿病常見的并發癥之一，具有遷延不愈、護理難度高、易再發等與常規創面不同的特點，是臨床常見的慢性創面類型［11］。過往研究發現，糖尿病難愈合創面發病機制復雜，主要涉及糖代謝異常、周圍神經病變、微循環血管病變以及上述機制引起的創面細胞功能異常［12］。但最新研究發現，過度ERS 在糖尿病難愈合創面發生發展中具有重要意義［4］。Chu 等［13］的研究表明，在糖尿病難愈合創面中炎癥介質中性粒細胞外陷阱（NETs）與CHOP、caspase-12等ERS 指標將會明顯上升，而通過治療后發現前述指標均下調且創面愈合速度顯著加快，這提示降低過度ERS 對治療糖尿病難愈合創面具有潛在價值。但ERS 參與糖尿病難愈合創面發病的機制及針對該靶點對其進行干預的措施仍需進一步探究。

內質網是真核細胞生物進行蛋白質合成與折疊的重要場所，是維持各類生命活動正常進行的重要基石，其功能障礙是多種疾病發生發展的主要原因［14］。目前，糖尿病環境引起過度ERS 導致糖尿病發病與糖尿病心肌病、微血管病變等系統并發癥發病的關系已被證實［15-17］，但其在糖尿病難愈合創面修復中的作用仍未明確。本研究發現，模型組大鼠創面愈合速率顯著減緩，且創面顏色晦暗，HE 染色顯示其創面顯微結構混亂，炎癥細胞大量增加，符合既往研究報道［18］；進一步檢測ERS 主要相關因子GRP78 和CHOP 的含量發現，上述指標在模型組表達顯著上調，證明過度ERS 在糖尿病難愈合創面中具有重要作用。而本研究所研究藥物溫陽生肌膏干預后可顯著增加大鼠創面愈合率，同時顯著降低了GRP78和CHOP含量，減輕ERS水平。

細胞凋亡是過度ERS 介導各類疾病發生的主要途徑之一［19］，高糖環境可導致過度ERS 進而激活CHOP 相關的凋亡信號傳遞，引起procaspase-12大量活化為caspase-12，使細胞凋亡持續發生［20］。此外，過度ERS 也會導致等炎癥因子大量表達，從而介導細胞凋亡，導致疾病發生［20］。本研究結果發現，cas‐pase-12 和IL-1β 在模型組中表達明顯上升，而溫陽生肌膏干預則可顯著逆轉上述現象。同時，通過電子顯微鏡觀察發現，糖尿病大鼠創面組織內質網明顯較正常組腫脹、折疊結構消失且數量明顯減少，而溫陽生肌膏干預后上述情況則可明顯改善。

本研究所用藥物溫陽生肌膏由丁香、肉桂、乳香、沒藥配伍而成，團隊前期研究發現其對糖尿病難愈合創面具有顯著療效［7-8］。但其作用與調控ERS減少創面組織細胞凋亡之間是否有關并不明確。本研究首次發現，溫陽生肌膏干預可顯著減少糖尿病難愈合創面組織GRP78 和CHOP 蛋白含量，從而下調通過下調GRP78/CHOP 通路進而抑制ERS 產生損傷，降低caspase-12表達水平，減輕細胞凋亡水平，同時降低促炎因子IL-1β 的表達，減輕創面炎癥反應，最終促進SD 大鼠糖尿病難愈合創面愈合。本研究所使用陽性對照藥物rb-bFGF 是一種成纖維細胞生長因子，是創面組織修復與再生領域的經典藥物之一，其可通過促進血管新生、纖維組織修復與細胞增殖進而加速創面修復［22］。本研究發現，rb-bFGF 對糖尿病難愈合創面仍有顯著促愈合作用，且與溫陽生肌膏相同的調控GRP78/CHOP 通路降低caspase-12介導的細胞凋亡與炎癥反應，但效果稍低于溫陽生肌膏。本團隊前期對溫陽生肌膏內有效單體成分沒食子酸進行研究發現，沒食子酸可顯著減輕高糖誘導的成纖維細胞氧化應激與炎癥反應，進而恢復成纖維細胞增殖活性與膠原蛋白含量［23］。因此我們推測溫陽生肌膏調控GRP78/CHOP 通路抑制過度內質網應激促糖尿病難愈合創面修復的靶點之一可能是創面相關的成纖維細胞。但其具體機制可能需要進一步明確。

綜上所述，溫陽生肌膏可顯著促進糖尿病難愈合創面修復，其作用可能是通過抑制GRP78/CHOP通路，減少過度ERS 從而降低創面組織凋亡水平而實現，為進一步臨床運用溫陽生肌膏治療糖尿病難愈合創面提供了科學依據。