淫黃葛合劑對APP/PS1 HAMP?/?小鼠認知功能和鐵死亡氨基酸代謝通路的影響*

劉 珊， 賀小平， 趙 炎， 鐘健民， 張燁華， 劉怡銘， 李佳璇， 董賢慧

（河北中醫藥大學 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091）

阿爾茨海默病（Alzheimer Disease， AD）作為一種進行性神經退行性疾病，其發病機制復雜［1］，病理特征主要有β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）沉積形成的老年斑和tan 蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結，二者均會導致神經元死亡。神經元核抗原（neuronal nuclear antigen， NeuN）是有絲分裂后神經元的特異性標志物。NeuN 表達的變化與神經元變性有關。研究顯示AD 患者腦部存在鐵超載現象［2］，鐵沉積的位置與老年斑呈共定位趨勢。鐵螯合劑會在減輕鐵沉積的同時減少淀粉樣斑塊的形成改善AD［3］。鐵調素（hepcidin；由HAMP基因編碼）作為鐵代謝的主要調控因子，當體內鐵過度增多時，通過與膜鐵轉運蛋白（ferroportin， Fpn）結合使其內化降解，減少細胞內的鐵排出，進而控制體內鐵代謝平衡。研究顯示，AD 腦部神經元出現鐵死亡（ferropto‐sis），且鐵死亡抑制劑可有效緩解Aβ 聚集引起的神經元死亡和記憶障礙，表明鐵沉積和鐵死亡與AD 關聯密切［4］。因此，本研究在APPswe/PS1dE9小鼠的基礎上將HAMP基因敲除以獲得鐵超載的APPswe/PS1dE9小鼠（APP/PS1HAMP?/?小鼠）模型。

鐵死亡不同于其他細胞死亡方式，主要分為鐵代謝、脂質過氧化和氨基酸代謝三個部分，其本質是鐵沉積引起的脂質過氧化增多，氨基酸代謝通路抗氧化能力降低而導致細胞死亡［5］。在鐵死亡過程中，氨基酸代謝通路胱氨酸-谷氨酸逆向轉運體攝入胱氨酸合成谷胱甘肽（glutathione， GSH），然后與谷胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）作用而清除有毒的過氧化脂質。其中GSH 是重要的抗氧化因子［6］，谷氨酰胺酶2（glutamatase 2，GLS2）和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（gluta‐mate-cysteine ligase catalytic subunit， GCLC）［7］都參與GSH的合成，二者升高可以促進GSH合成，提高抗氧化能力。因此，GSH、GCLC 和GLS2 對鐵死亡過程中抗氧化的作用至關重要。

中藥是我國傳統瑰寶，對于治療AD 有顯著效果［8］。中醫理論中，AD 被稱為癡呆，病機為本虛標實，涉及心、肝、腎等多個臟腑。淫羊藿苷-黃芪甲苷-葛根素（淫黃葛）合劑（icariin-astragaloside IV-puera‐rin mixture， Yin-Huang-Ge mixture， YHG）由淫羊藿、黃芪和葛根的有效單體組成，可以改善APP/PS1 小鼠學習記憶能力，減少APP/PS1 小鼠腦部老年斑沉積，減輕神經元損傷，對鐵代謝相關蛋白HAMP、Fpn1 和二價金屬轉運蛋白（divalentmetal transporter 1， DMT1）也有影響。地拉羅司（deferasirox， DFX）作為鐵螯合劑與鐵死亡抑制劑，可以抑制tau 蛋白聚集，減輕神經功能障礙［9］。YHG 對AD 的有著多種治療效果，但是具體作用機制尚未明確。因此，本實驗采用APP/PS1HAMP?/?小鼠作為AD 腦鐵超載動物模型，并以DFX 為陽性對照藥，通過研究YHG 對APP/PS1HAMP?/?小鼠認知功能和神經元損傷的影響，以及鐵死亡氨基酸代謝通路關鍵蛋白GSH、GCLC 和GLS2的表達變化，進一步探討YHG通過調控鐵死亡氨基酸代謝通路改善AD認知功能的作用機制。

材料與方法

1 實驗動物、試劑與儀器

1.1 實驗動物 APPswe/PS1dE9 小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2010-0008。所有實驗經過河北中醫藥大學動物倫理委員會與河北中醫藥大學實驗動物中心批準，許可證號：SYXK（冀）2017-0005。實驗保持12 h 明暗周期，25 ℃室溫，50%濕度，所有動物單籠喂養。

1.2 主要試劑與儀器 黃芪甲苷（MB1955-1）、淫羊藿苷（MB2189）、葛根素（MB6183）和DFX（MB1208-2）購自大連美侖生物技術有限公司，含量均≥97%；Prestained Protain Marker II （8-195 kDa； G2058）和Anti-beta Actin Rabbit pAb （GB11001）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG （H+L）購自江蘇碧云天生物技術有限公司（A0208）；GCLC Polyclonal antibody（12601-1-AP）購自Proteintech；GLS2 antibody （DF13386）購自Affini‐ty；組織鐵試劑盒（A039-2-1）南京建成生物工程研究所。蛋白電泳和轉膜儀（Bio-Rad）；Varioskan LUX 型多功能微孔讀數儀（Thermo）；RM2255全自動輪轉切片機、DM5000B 型熒光顯微鏡和EM UC7 超薄切片機（Leica）；HT7700透射電鏡（HITACHI）。

2 方法

2.1 動物分組及干預 實驗分為7 組：陰性對照組（C57 組；6 月齡C57BL/6J 小鼠）、APP/PS1 組（6 月齡APPswe/PS1dE9 小 鼠）、APP/PS1HAMP?/?組（6 月 齡APP/PS1HAMP?/?小鼠）、APP/PS1+YHG 組、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組、APP/PS1+DFX 組 和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組，每組6 只，均為雄性。YHG 和DFX灌胃給藥，其余各組給予蒸餾水灌胃，每日一次，用藥2 個月。YHG 根據徐淑云主編的《藥理實驗方法》以臨床3 倍用量給藥（淫羊藿苷、黃芪甲苷和葛根素劑量分別為120、80和80 mg/kg），DFX劑量為100 mg/kg。

2.2 APP/PS1HAMP?/?小鼠的構建及其基因型鑒定 （1）以C57BL/6J 小鼠為背景，采用CRISPER/Cas9 技術構建HAMP?/?小鼠，然后將獲得的HAMP?/?小鼠與APPswe/PS1dE9 小鼠合籠繁育，最終獲得APP/PS1HAMP?/?小鼠。（2）APP/PS1HAMP?/?小鼠出生1 周后剪鼠尾提取DNA 做基因型鑒定。根據查詢到的小鼠HAMP、APP和PS1基因序列，設計基因型鑒定用的PCR 擴增引物（表1）。由于APP基因和PS1基因共用PrP啟動子，這2個基因連鎖表達，因此為了簡化鑒定過程，我們只檢驗APP基因。HAMP基因PCR 體系：鼠尾基因DNA 1.5 μL，正向引物（10μmol/L） 1 μL，反向引物（10 μmol/L） 0.5 μL，He/Wt-R （10 μmol/L） 0.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L） 1.5 μL，10× PCR Buffer （Mg2+Plus） 3 μL，TaKaRaTaqHS （5 U/μL） 0.2 μL， ddH2O21.8 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；加入DNA 聚合酶1 μL；94 ℃ 30 s，65 ℃30 s，72 ℃ 60 s，循環35 次；72 ℃終延伸5 min。APP基因PCR 反應體系：鼠尾基因DNA 5 μL，引物0.5μL，10× PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 5 μL， MgCl21.5μL， ddH2O 9.5 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；加入DNA 聚合酶1 μL；94 ℃ 60 s， 56 ℃ 60 s， 72 ℃60 s，35個循環。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 引物序列Table 1. Primer sequence

2.3 組織鐵試劑盒檢測小鼠腦鐵含量 取各組小鼠腦組織稱重，按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機械勻漿，以2 500 r/min離心10 min，取上清液。按照試劑盒加入鐵顯色劑混勻后，沸水浴5 min，流水冷卻后以3 500 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，0.5 cm 光徑，波長520 nm，雙蒸水調零，測各管吸光度。

2.4 透射電鏡觀察小鼠海馬神經元線粒體形態 將每組小鼠海馬組織切取1 mm×1 mm×1 mm 的小塊；2.5%戊二醛固定4 h，0.1 mol/L PBS 沖洗3 次，每次15 min；1%鋨酸固定2 h，PBS 再次沖洗3 次，每次15 min；在分級丙酮中常規脫水，室溫用Epon 812包埋，烘箱固化，超薄切片，厚度50～60 nm；3%醋酸鈾酰檸檬酸鉛雙染色20 min，水洗，烘箱干燥；最后用透射電鏡觀察并拍照。

2.5 Morris水迷宮實驗 （1）定位導航實驗：實驗為期5 d，先進行適應性訓練。訓練開始時，將平臺置于第3 象限，以每個象限的中點為起點，將小鼠面對墻壁放入水中，保證小鼠背對平臺入水。小鼠每天訓練4次，每次從不同的起點入水，記錄小鼠在120 s內找到水下平臺的時間，即逃離潛伏期。如果小鼠在測試時間內沒有找到隱藏平臺，則實驗者引導小鼠將其置于平臺上休息15 s，并記錄為120 s 的逃逸潛伏期。（2）空間探索實驗：第6 天取下平臺，測試小鼠對平臺空間位置的記憶能力。將小鼠放入水中，所有小鼠均在同一入水點入水，記錄120 s 內小鼠穿過目標象限的次數和在目標象限的停留時間。

2.6 免疫熒光染色觀察小鼠腦組織NeuN 表達情況 將切片架分別浸于Ⅰ級和Ⅱ級二甲苯中脫蠟各15 min；取出切片，依次浸入95%、85%、75%乙醇各1 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min；置于煮沸抗原修復液中，低火修復10 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min；使用濾紙片將每張切片擦干，免疫組化筆在組織周圍畫圈，防止滴加液體時外溢；滴加山羊血清于濕盒內室溫15 min；取出切片，擺放在切片架上，PBS 沖洗3次，每次5 min；Ⅰ抗孵育4 ℃過夜；PBS 沖洗3 次，每次5 min；避光，滴加熒光Ⅱ抗（1∶200 稀釋），室溫孵育60 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min；滴加DAPI 至完全覆蓋組織以復染核；抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察染色效果，400倍鏡下拍照。

2.7 生化試劑盒檢測小鼠腦組織GSH 表達 取各組小鼠腦組織稱重，每0.1 g 組織加入預冷的Extrac‐tion Buffer，快速冰上勻漿，勻漿后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液冰上待測。酶標儀預熱30 min 以上，調節波長至412 nm。在96 孔板加入待測液體及其他試劑，充分混勻，室溫避光孵育2 min，酶標儀檢測吸光度。

2.8 Western blot 檢測 小鼠腦組織GCLC 和GLS2 蛋白表達 取各組小鼠腦組織加入裂解液進行蛋白提取；然后采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度；將蛋白以60 μg 加入凝膠中，電泳2 h；然后將凝膠蛋白經25 V 恒壓20 min轉移到PVDF 膜上；TBST 清洗后，將牛奶放入Ⅰ抗中，在4 ℃冰箱中過夜；用TBST 沖洗3次，每次10 min；將Ⅰ抗與種匹配的山羊Ⅱ抗室溫孵育2 h；用TBST 沖洗3 次，每次10 min；使用Fusion FX5光譜成像系統直接從PVDF 膜上獲得印跡圖像，通過ImageJ軟件測量條帶的吸光度。

3 統計學分析

實驗數據均使用SPSS 26.0軟件分析。以均數±標準差（mean±SD）表示計量資料。組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 APP/PS1 HAMP?/?小鼠的基因型鑒定

基因型鑒定結果顯示，APP基因片段擴增長度為360 bp，圖中500 bp 下方有條帶顯示，表明小鼠體內有APP基因表達，見圖1A。HAMP基因片段長度為2 555 bp，敲除該基因后引物擴增片段長度為759 bp，圖中在750 bp 附近有條帶顯示，表明HAMP基因敲除成功，見圖1B。上述結果表明，本課題組成功構建APP/PS1HAMP?/?小鼠。

Figure 1. Identification of mouse genotype. A： identification of APP gene （PCR product at 360 bp）； B： identifica‐tion of HAMP knockout （PCR product at 759 bp）.NC： negative control； M： DNA marker.圖1 小鼠基因型的鑒定

2 YHG對APP/PS1 HAMP?/?小鼠腦鐵含量的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠腦鐵含量顯著升高（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組鐵含量進一步升高（P<0.01）；APP/PS1 組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組鐵含量顯著降低（P<0.01）；與APP/PS1HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組鐵含量顯著降低（P<0.01）；APP/PS1+YHG 組與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組相比，鐵含量無顯著差異（P>0.05），見圖2。

Figure 2. Iron content in brain of rats in each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs C57 group； ##P<0.01 vs APP/PS1 group； △△P<0.01 vs APP/PS1 HAMP?/? group.圖2 各組小鼠腦鐵含量結果

3 YHG 對APP/PS1 HAMP?/?小鼠海馬神經元超微結構的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠海馬神經元線粒體膜皺縮，密度增加，線粒體體積減小；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組線粒體嵴斷裂，線粒體破裂；與APP/PS1 組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組線粒體形態明顯改善；與APP/PS1HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組線粒體形態亦明顯改善；APP/PS1+YHG 組與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 與APP/PS1HAMP?/?+DFX組相比，線粒體形態無明顯差異（P>0.05），見圖3。

Figure 3. The mitochondrial ultrastructure of mouse hippocam‐pal neurons in each group observed by transmission electron microscopy（ scale bar=1 μm）.圖3 各組小鼠海馬神經元線粒體形態

4 YHG 對APP/PS1 HAMP?/?小鼠學習記憶能力的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠的逃避潛伏期顯著延長，目標象限停留時間縮短，穿越平臺次數減少（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組逃避潛伏期進一步延長，目標象限停留時間進一步縮短，穿越平臺次數進一步減少（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組逃避潛伏期顯著縮短，目標象限停留時間延長，穿越平臺次數增多（P<0.01）；與APP/PS1HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組逃避潛伏期顯著縮短，目標象限停留時間延長，穿越平臺次數增多（P<0.05）；APP/PS1+YHG 組與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 與APP/PS1HAMP?/?+DFX組相比，逃避潛伏期、目標象限停留時間和穿越平臺次數無顯著差異（P>0.05），見圖4。

5 YHG 對APP/PS1 HAMP?/?小鼠腦組織NeuN 表達的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠腦組織NeuN表達水平顯著下降（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組NeuN 表達水平進一步降低（P<0.01）；與APP/PS1組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組NeuN 表達水平顯著升高（P<0.01）；與APP/PS1 HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組NeuN表達水平顯著升高（P<0.01）；APP/PS1+YHG 組與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組與APP/PS1HAMP?/?+DFX 組相比，NeuN 表達水平無顯著差異（P>0.05），見圖5。

Figure 5. The expression of NeuN in mouse brain tissues of each group detected by immunofluorescence staining （scale bar=100μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs C57 group； ##P<0.01 vs APP/PS1 group； △△P<0.01 vs APP/PS1 HAMP?/? group.圖5 各組小鼠腦組織NeuN表達水平檢測結果

6 YHG 對APP/PS1 HAMP?/?小鼠腦組織GSH 含量的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠腦組織GSH 含量顯著下降（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組GSH 含量進一步降低（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組GSH 含量顯著升高（P<0.01）；與APP/PS1HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組和APP/PS1HAMP?/?+DFX 組GSH 含量顯著升高（P<0.01）；APP/PS1+YHG 組 與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 與APP/PS1HAMP?/?+DFX組相比，GSH含量無顯著差異（P>0.05），見圖6。

Figure 6. The GSH content in mouse brain tissues of each group.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs C57 group； ##P<0.01 vs APP/PS1 group； △△P<0.01 vs APP/PS1 HAMP?/? group.圖6 各組小鼠腦組織GSH含量

7 YHG 對APP/PS1 HAMP?/?小鼠腦組織GCLC 和GLS2蛋白表達的影響

與C57 組相比，APP/PS1 組和APP/PS1HAMP?/?組小鼠腦組織GCLC和GLS2蛋白表達水平顯著下降（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1HAMP?/?組GCLC 和GLS2 蛋白表達水平進一步降低（P<0.01）；與APP/PS1 組相比，APP/PS1+YHG 組和APP/PS1+DFX 組GCLC 和GLS2 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與APP/PS1HAMP?/?組相比，APP/PS1HAMP?/?+YHG 組 和APP/PS1 HAMP?/?+DFX 組GCLC 和GLS2蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；APP/PS1+YHG 組與APP/PS1+DFX 組相比、APP/PS1HAMP?/?+YHG 組與APP/PS1HAMP?/?+DFX 組相比，GCLC 和GLS2 蛋白表達水平無顯著差異（P>0.05），見圖7。

討 論

AD 主要癥狀為認知功能障礙、進行性記憶力減退，并伴隨著非認知性精神癥狀［10］。隨著中國老齡化社會進程加快，AD 患病率及死亡率也在不斷上升［11］。AD 發病機制錯綜復雜，其中鐵沉積和鐵死亡與AD 的發病關系密切。多種緩解鐵沉積與鐵死亡的藥物均可以減輕AD 癥狀［12］。DFX 作為鐵螯合劑，同時也是鐵死亡抑制劑，被發現可以減輕腦鐵沉積和過量鐵產生的神經毒性，抑制tau 蛋白和Aβ 的沉積，減輕神經元損傷。但是DFX也有明顯的副作用，比如過敏、肝腎功能障礙等［13］。目前治療AD 的藥物種類繁多，都不能徹底根治，只能緩解癥狀或是延緩發病，且很多治療藥物都有副作用［14］。

AD 在中醫中被稱為呆病，中醫對于AD 有著豐富的治療經驗，中藥多效用、多靶點的優勢逐漸受到重視，有研究表示中藥通過多種信號通路治療AD［15-16］。YHG由淫羊藿苷、黃芪甲苷和葛根素組成，三者分別為淫羊藿、黃芪和葛根的有效組分。現代藥理學研究表明淫羊藿苷、黃芪甲苷和葛根素均有抗炎抗氧化的作用。淫羊藿苷通過影響SIRT1 和抑制Aβ 級聯發病機制而緩解AD［17］。黃芪甲苷可以提高谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低自由基水平，進而起到神經保護作用。黃芪甲苷還可通過影響NogoA/NgR 和cAMP/PKA 通路改善APP/PS1 轉基因小鼠認知功能［18］。葛根素可以穿過血腦屏障，提高多種抗氧化物質活性，降低炎癥因子和凋亡基因表達，從而減輕AD 癥狀［19］。本課題組前期研究顯示，YHG 可以緩解腦鐵超載，有效改善AD 模型小鼠學習記憶能力，減輕大腦皮質神經原纖維纏結、老年斑和神經元水腫。與DFX 相比，YHG 采用淫羊藿、黃芪和葛根的有效單體成分，具有中藥多效用多靶點的作用優勢［20］，同時也沒有明顯毒副作用。但是YHG 對治療AD 的具體作用機制尚未完全明確。本實驗構建APP/PS1HAMP?/?小鼠模型，進一步探討YHG 對AD的作用機制。水迷宮結果顯示，APP/PS1HAMP?/?小鼠較APP/PS1 小鼠認知功能障礙加重，空間記憶能力下降，而YHG 治療后APP/PS1HAMP?/?小鼠的認知功能障礙減輕，空間記憶能力升高。二價鐵離子具有高度的氧化活性，過量二價鐵離子沉積會引起大量氧化反應而損傷神經元。本實驗結果顯示，APP/PS1HAMP?/?小鼠較APP/PS1 小鼠腦部鐵沉積加重，免疫熒光結果顯示APP/PS1HAMP?/?小鼠較APP/PS1小鼠腦部NeuN 表達減少，神經元損傷加重，YHG 治療后APP/PS1HAMP?/?小鼠腦部鐵沉積減輕，NeuN表達增多，神經元損傷減輕。這些結果表明，YHG可減輕腦鐵沉積，改善認知功能，增強學習記憶能力。

鐵死亡作為一種鐵依賴性脂質活性氧堆積導致的細胞死亡方式，其細胞形態上的變化是線粒體變小，線粒體膜密度增高，線粒體嵴減少或消失，線粒體外膜破裂［21］。鐵死亡與AD 的關系密切［22］。透射電鏡結果顯示，APP/PS1HAMP?/?小鼠較APP/PS1 小鼠神經元線粒體破損更加嚴重，YHG 治療后APP/PS1HAMP?/?小鼠神經元線粒體破損減輕。細胞發生鐵死亡過程中主要分為鐵代謝、氨基酸代謝和脂質代謝三部分。其中氨基酸代謝抑制過氧化自由基過度氧化，起到關鍵的抗氧化作用［23］。在這個過程中，GPX4與GSH結合，將有毒的脂質氫過氧化物轉變成無毒的脂醇［24］。谷胱甘肽由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸共同組成，GLS2 將谷氨酰胺轉化成谷氨酸，進而生成GSH［25］，GCLC 作為一個重要的酶，參與GSH 的合成［26］。GSH 生成增多，將促進與GPX4 的結合，增強抗氧化能力。生化法與Western blot 實驗結果顯示，APP/PS1HAMP?/?小鼠較APP/PS1 小鼠GSH、GCLC 和GLS2 的表達水平降低，抗氧化能力減弱；YHG 治療后使APP/PS1HAMP?/?小鼠腦部GSH、GCLC 和GLS2 的表達水平升高，抗氧化能力加強。這些結果表明，增強鐵死亡氨基酸代謝通路，可提高抗氧化能力，減輕神經元鐵死亡。

綜上所述，YHG 通過調控鐵死亡氨基酸代謝通路，提高GSH、GCLC 和GLS2 的表達水平，進而增強抗氧化能力，減輕APP/PS1HAMP?/?小鼠腦部神經元損傷，抑制鐵死亡，從而改善APP/PS1HAMP?/?小鼠的認知功能及學習記憶能力。