高滲環(huán)境調(diào)控鈣黏蛋白表達(dá)并影響擬胚體分化*

許健宜， 吳引弟， 方麗君， 蔣虹婧， 孫盱衡， 劉 青， 肖 聰， 林展翼△

［1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006，2南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣東 廣州 510180］

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有多功能的分化潛力和倫理優(yōu)勢(shì)，已成為多種疾病（如退行性疾病、心肌損傷、骨組織再生等）治療與研究的潛在種子細(xì)胞來(lái)源［1-3］。擬胚體（embryoid body， EB）是多能干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中形成的三維細(xì)胞聚集體［4］，可以響應(yīng)生物力學(xué)信號(hào)［4］，編程為特定細(xì)胞譜系，對(duì)心肌細(xì)胞［5］、神經(jīng)細(xì)胞［6］和血管細(xì)胞［7］等依賴于初始EB 步驟的定向分化至關(guān)重要。然而，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞廣泛臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)之一是高效地引導(dǎo)其進(jìn)入特定譜系，因?yàn)閱渭円蕾嘐B 的自發(fā)分化常導(dǎo)致分化多樣性不可控［8］。越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注EB 分化影響因素的研究，希望通過(guò)理清各種體外影響因素的規(guī)模化調(diào)控，實(shí)現(xiàn)EB的可擴(kuò)展和可重復(fù)分化［9］。

細(xì)胞外環(huán)境中的物理信號(hào)，例如力學(xué)刺激［10］、幾何形狀和剛度等［4，9］，對(duì)于譜系規(guī)范有著重要影響。另外已有研究表明，細(xì)胞大小和細(xì)胞形態(tài)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)和分化表型有著顯著影響［11-13］，由于滲透壓能夠直接影響細(xì)胞的大小和形態(tài)，因此，本研究考慮環(huán)境中滲透壓也是規(guī)范化調(diào)控過(guò)程中必不可少的因素之一。聚 乙 二 醇300（polhethylene glycol 300， PEG 300）是一種非離子型的水漿性聚合物，已被用于改變培養(yǎng)液滲透壓，GUO 等［14］研究者表明，添加2%的PEG 300后，細(xì)胞大小和力學(xué)在2 min內(nèi)達(dá)到平衡，并且無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。但對(duì)于培養(yǎng)液中的滲透壓對(duì)EB的分化影響尚不明確。

在細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程中，細(xì)胞黏附分子提供了從細(xì)胞到細(xì)胞外環(huán)境、以及細(xì)胞之間的雙向信號(hào)通路［15］。物理信號(hào)能夠通過(guò)細(xì)胞黏附分子來(lái)激活細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間的相互作用，從而影響細(xì)胞的形成和分化。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin， CDH1）和神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin， CDH2）是兩種重要的細(xì)胞黏附分子，參與維持細(xì)胞之間的物理連接，并直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞分化［16-17］。例如，在干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，CDH1介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附會(huì)改變細(xì)胞和細(xì)胞集落的形態(tài)，可能激活參與維持未分化狀態(tài)或致力于特定譜系的信號(hào)通路［18-19］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CDH1 和CDH2 分子與成骨分化［20］、神經(jīng)分化和中胚層分化［21-22］等過(guò)程密切相關(guān)。

本研究旨在闡明高于常規(guī)培養(yǎng)液的滲透壓對(duì)EB 分化的影響，并探討其潛在的作用機(jī)制，以促進(jìn)EB 直接分化為給定的細(xì)胞類型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，從而提高其在疾病研究的應(yīng)用潛力。在不同滲透壓力的培養(yǎng)液中，本研究觀察到EB 的分化行為與滲透壓之間存在一定的相關(guān)性兩組EB 中的細(xì)胞黏附因子CDH1 和CDH2 表達(dá)存在差異，特別是CDH2的差異表達(dá)更加顯著。這些差異影響了滲透壓導(dǎo)致的EB 分化方向變化，即在較高滲透壓條件下培養(yǎng)的EB 顯示出更強(qiáng)的中胚層譜系承諾趨勢(shì)和更低的外胚層譜系承諾趨勢(shì)。通過(guò)使用TGF-β 特異性抑制劑SB431542 改變CDH2 的表達(dá)水平，觀察到高滲透壓培養(yǎng)液中胚層標(biāo)志物的高表達(dá)趨勢(shì)被抑制，同時(shí)外胚層標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)。這提示高滲透壓可以通過(guò)調(diào)節(jié)CDH2來(lái)改變EB的分化方向。這些結(jié)果表明環(huán)境滲透壓是規(guī)范干細(xì)胞分化的一個(gè)關(guān)鍵因素，為干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用提供了新的視角。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象的準(zhǔn)備

1.1 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells， hiPSCs）的培養(yǎng)與傳代 從賽貝公司（中國(guó)）購(gòu)買源于人成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，將其培養(yǎng)于37 ℃和5% CO2的環(huán)境中。在培養(yǎng)和傳代前，首先在培養(yǎng)皿上鋪減生長(zhǎng)因子的Matrigel?（hESCqualified Matrix，1∶100 in DMEM/F12； Corning），使用mTeSR plus 培養(yǎng)液（STEMCELL Technologies）維持干細(xì)胞多能性。每培養(yǎng)4天傳代1次，傳代時(shí)盡量保證細(xì)胞團(tuán)聚。

1.2 EB 的培養(yǎng)與形成 在hiPSCs 傳代當(dāng)天，使用ReLeSR ?（STEMCELL Technologies）收獲并解離hiPSCs。將這些細(xì)胞傳代至超低懸浮培養(yǎng)板（Corning）中，培養(yǎng)于mTeSR plus培養(yǎng)液和EB培養(yǎng)液的混合溶液中以形成EB。此混合溶液按照mTeSR plus 和EB 培養(yǎng)液2∶0（傳代當(dāng)天，第0 天）、2∶1、1∶1、1∶2 和0∶2 的比例每天更換，在第4 天以后只使用EB培養(yǎng)液培養(yǎng)EB。EB 培養(yǎng)液為高葡萄糖DMEM（Gib‐co）中添加10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）、1%非必需氨基酸（Gbico）、2 mmol/L GlutaMAX（Gib‐co）、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇（Sigma-Aldrich）、50 U/mL 青霉素和50 μg/mL 鏈霉素（Thermo Fisher Scien‐tific）。EB 培養(yǎng)階段實(shí)驗(yàn)組將添加不同濃度的PEG 300以改變滲透壓。

2 檢測(cè)方法

2.1 測(cè)定培養(yǎng)液中的滲透壓 在培養(yǎng)液中添加0%、1%、1.5%、1.75%、2%、2.25%和5%的PEG 300后，通過(guò)冰點(diǎn)滲透壓儀（FPOSM-V2.0）測(cè)量滲透壓來(lái)驗(yàn)證PEG 300對(duì)于提高培養(yǎng)液滲透壓的有效性。

2.2 RT-qPCR 檢測(cè)使用Trizol 試劑提取EB 的RNA，每個(gè)樣本定量至1 μg。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 與SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）結(jié)合，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參照為GAPDH。所用引物詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1. Primer sequences

2.3 Western blot 檢測(cè) 使用含有蛋白酶抑制劑（Roche）的RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)。使用Pierce?BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo Fisher Scientific）對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行定量。按每孔20 μg 蛋白的量將樣品加于4%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，樣品總體積不超過(guò)25 μL。電泳電壓為100～120 V，持續(xù)時(shí)間為40～60 min。隨后將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore），電壓為140-160 V，30 min。轉(zhuǎn)移后，用1%吐溫20 的三相緩沖鹽水（TBST）配置的5%脫脂牛奶溶液封閉膜。隨后使用特異性Ⅰ抗（GAPDH 抗體，1∶10 000；Tubb3 抗體，1∶50 000；T/Bry 抗體，1∶1 000；histone H3 抗體，1∶10 000；CDH1 抗體，1∶1 000；CDH2 抗體，1∶3 000；p-SMAD3 抗體，1∶2 000）對(duì)膜進(jìn)行孵育。使用ECL 蛋白印跡底物（Pierce）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，使用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值定量分析。所用抗體詳見(jiàn)表2。

表2 抗體信息Table 2. Antibody Information

2.4 免疫熒光染色 培養(yǎng)EB 2、4 和6 d 后，在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，隨后進(jìn)行石蠟包埋和切片。使用檸檬酸溶液（pH 6.0）在高溫高壓條件下進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后，切片在蒸餾水中沖洗3次，每次5 min。然后使用10%山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min。封閉完成后，每個(gè)切片上加入Ⅰ抗（CDH1 和CDH2 抗體，1∶200），在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，在每個(gè)切片中加入Ⅱ抗，室溫下孵育60 min。使用TBST 洗去Ⅱ抗后，在黑暗環(huán)境中用50μL DAPI 工作溶液（Abcam；DAPI 原液按1∶500 稀釋制備）進(jìn)行5 min 的核染色。完成這一過(guò)程后，用熒光封片劑封好切片，避光保存在4 ℃冰箱。拍攝時(shí)，使用LSM Meta共聚焦顯微鏡（LSM980；Zeiss）或熒光顯微鏡（Axio vert5；Zeiss）對(duì)切片進(jìn)行拍照。

2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將6孔板中一個(gè)孔的hiPSCs進(jìn)行消化后，加入2 mL mTeSR 培養(yǎng)液，然后在低附著96孔板上每孔加66 μL 細(xì)胞懸浮液以測(cè)定EBs 細(xì)胞的活力。移除培養(yǎng)液后，重新添加含有10 μL CCK-8溶液的100 μL 新鮮培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)箱中孵育2 h。接著，使用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞在450 nm 處的吸光度，分析細(xì)胞活力時(shí)采用實(shí)驗(yàn)組與空白組的吸光度值的比值。

2.6 AM/PI 凋亡染色檢測(cè) 使用超低吸附懸浮6 孔板培養(yǎng)EB。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，首先將培養(yǎng)液棄去，然后使用PBS緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌，以確保去除殘留的培養(yǎng)液。隨后，按照AM/PI 染色試劑的使用說(shuō)明書(shū)，加入適量的AM/PI 工作液。接下來(lái)，將細(xì)胞在37 ℃中避光的條件下孵育30 min。孵育結(jié)束后，通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)染色情況進(jìn)行觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SEM）表示。為評(píng)估結(jié)果的顯著性，采用了獨(dú)立樣本Student′st檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PEG 300增加了培養(yǎng)液的滲透壓

如圖1所示，加入PEG 300明顯提高了培養(yǎng)液的滲透壓。隨著PEG 300 濃度的逐漸增加，滲透壓也相應(yīng)呈上升趨勢(shì)，并且這兩者之間表現(xiàn)出顯著的線性關(guān)聯(lián)（R2=0.998 4，P<0.01）。這些結(jié)果表明，PEG 300的使用有效提升了培養(yǎng)液的滲透壓。

Figure 1. Osmotic pressure curve of the culture medium.圖1 培養(yǎng)液滲透壓曲線

2 高滲透壓對(duì)EB活力和增殖無(wú)明顯毒副作用

為了確認(rèn)將PEG 300 添加到培養(yǎng)液中對(duì)細(xì)胞的生物安全性，本研究進(jìn)行了細(xì)胞活力測(cè)定。研究比較了在不同滲透壓濃度中的EB 形成形態(tài)。在滲透壓濃度較高（4% PEG 300）的情況下，EB 出現(xiàn)散亂不聚集的現(xiàn)象，無(wú)法正常存活至培養(yǎng)結(jié)束（圖2A）。因此接下來(lái)只探究2%濃度PEG 300 與對(duì)照組細(xì)胞的存活情況。通過(guò)對(duì)高滲組和對(duì)照組的EB進(jìn)行AM/PI染色檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組EB 中含有相當(dāng)大比例的活細(xì)胞（綠色熒光染色）。EB 的死細(xì)胞染色并不明顯（紅色熒光染色，用白色箭頭表示的簇），相較而言，高滲組中紅色熒光更少，并且EB 的形態(tài)良好，無(wú)明顯凋亡壞死現(xiàn)象（圖2B）。

Figure 2. Activity assay of embryoid bodies（ EBs）. A： suspension cultured EBs in different concentrations of osmotic pressure； B：AM/PI staining to detect the activity of EBs； C： A450 values of suspended EBs from day 0 to day 5 were detected by CCK-8 assay. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs control group.圖2 擬胚體的活力檢測(cè)

CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了培養(yǎng)過(guò)程中EB 的增殖活性情況。CCK-8 實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)曲線顯示，EB 在整個(gè)培養(yǎng)周期持續(xù)增殖，其中，從第3 天開(kāi)始，高滲組的細(xì)胞較對(duì)照組相比優(yōu)勢(shì)增殖率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2C。

3 高滲透壓引起EB 中CDH1 表達(dá)維持同時(shí)CDH2表達(dá)下調(diào)

在EB 形成和分化過(guò)程中，鈣黏蛋白在細(xì)胞連接和功能中扮演重要角色，而CDH1 和CDH2 的表達(dá)與EB的分化相關(guān)［23-24］。為了探究高滲透壓培養(yǎng)環(huán)境對(duì)EB 分化方向的影響，檢測(cè)了第2、4、6 天高滲組和對(duì)照組EB 中CDH1 和CDH2 的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與第2 天相比，第4 天和第6 天高滲組和對(duì)照組的EB 中CDH1（紅色熒光）和CDH2（綠色熒光）熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，二者表達(dá)呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。然而，組間比較結(jié)果顯示，高滲組的CDH1 的熒光強(qiáng)度更高，而CDH2 熒光強(qiáng)度更低。另外，研究觀察到，高滲組的EB 在第2 天和第4 天表現(xiàn)出規(guī)則形態(tài)，并形成完整的球形結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3A、B。

這些結(jié)果提示，增加培養(yǎng)液的滲透壓影響了CDH1和CDH2的表達(dá)。為進(jìn)一步探討PEG 300導(dǎo)致的培養(yǎng)液滲透壓變化對(duì)EB 中CDH1 和CDH2 表達(dá)的影響，我們進(jìn)行了Western blot 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度滲透壓中EB 的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，CDH1 和CDH2的表達(dá)量與滲透壓濃度相關(guān)，隨著滲透壓濃度的升高，CDH2 的表達(dá)逐漸下調(diào)，而CDH1 總體上呈輕微上升趨勢(shì)。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示滲透壓與CDH1 和CDH2 的表達(dá)存在著直接相關(guān)性（P<0.05），見(jiàn)圖3C。

4 高滲透壓對(duì)EB中MET進(jìn)程的影響

由于CDH1 和CDH2 是MET 進(jìn)程兩個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)志物，而順序性EMT-MET 在干細(xì)胞命運(yùn)決定和轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用［25-26］，為了了解不同滲透壓培養(yǎng)液中EB 的EMT 進(jìn)程，我們檢測(cè)了EMT 相關(guān)基因的表達(dá)情況，RT-qPCR 結(jié)果顯示，EMT 經(jīng)典標(biāo)志物（Snail 和Twist）的上下調(diào)趨勢(shì)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，vi‐mentin出現(xiàn)明顯上調(diào)，CDH1略有上調(diào)，而CDH2則明顯下調(diào)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The expression of EMT markers in embryoid bodies. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖4 擬胚體EMT標(biāo)志物檢測(cè)

5 高滲透壓對(duì)EB分化方向的影響

在EB 形成過(guò)程中，鈣黏蛋白的變化與EB 的分化有著一定關(guān)聯(lián)性［27］。我們從EB形成的第1天開(kāi)始檢測(cè)了兩組EB 的三胚層標(biāo)志物的表達(dá)情況，以探討高滲透壓培養(yǎng)液和對(duì)照組培養(yǎng)液對(duì)EB 形成階段分化方向的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高滲組EB 中的中胚層相關(guān)標(biāo)志物（T/Bry、Eome、Mixl1 和Hand1）的表達(dá)在EB的第4天開(kāi)始顯現(xiàn)（圖5A）。同時(shí)，高滲組EB 中胚層標(biāo)志物的表達(dá)量在第4 天或之后顯著高于對(duì)照組，提示高滲組EB的中胚層分化趨勢(shì)更強(qiáng)。

Figure 5. Expression of differentiation markers in embryoid bodies（ EBs） at different time points. A： the expression of mesoderm-re‐lated markers（ T/Bry， Eome， Mixl1 and Hand1） in the 2 groups of EBs at different time points； B： the expression of endo‐derm-related markers（ Gata4 and FoxA1） in the 2 groups of EBs at different time points； C： the expression of ectoderm-re‐lated markers（ Pax6 and Tubb3） in the 2 groups of EBs at different time points； D： the expression of T/Bry in EBs cultured with different concentrations of PEG 300； E： the expression of pluripotency-related markers （Oct4 and Nanog） in the 2 groups of EBs at different time points. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs contorl.圖5 各組擬胚體在不同時(shí)點(diǎn)的分化標(biāo)志物表達(dá)情況

內(nèi)胚層和外胚層相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)趨勢(shì)不一致，在高滲組，EB中Gata4 的表達(dá)相對(duì)高于對(duì)照組，F(xiàn)oxA1 無(wú)明顯趨勢(shì)（圖5B）。高滲組EB中，外胚層標(biāo)志物Pax6在第4天和第6天的表達(dá)量都顯著低于對(duì)照組，而Tubb3在第6天的表達(dá)量也低于對(duì)照組（圖5C）。

在含有不同濃度PEG 300 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)EB 6 d后，檢測(cè)了中胚層標(biāo)志物T/Bry的表達(dá)情況，以明確滲透壓濃度與中胚層標(biāo)志物表達(dá)情況的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，T/Bry 的表達(dá)量隨著培養(yǎng)液滲透壓的增加而增加（P<0.05），見(jiàn)圖5D，提示培養(yǎng)液滲透壓的變化與中胚層標(biāo)志物的表達(dá)存在一定的濃度相關(guān)性。

6 高滲透壓對(duì)EB多能性的影響

由于CDH2 和CDH1 的表達(dá)往往提示EB 的多能性發(fā)生了轉(zhuǎn)變，為了驗(yàn)證高滲透壓培養(yǎng)液對(duì)EB 多能性的影響，檢測(cè)了第1 至第6 天EB 的多能性標(biāo)志物Oct4 和Nanog 的表達(dá)情況。總體來(lái)看，這兩組標(biāo)志物在時(shí)間推移中顯示出一時(shí)性的升高趨勢(shì)（圖5E）。在高滲組中，Nanog和OCT4在第2至第5天的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，這可能與高滲組EB 中CDH1 的保持有關(guān)［15，21］。

7 抑制p-Smad3上調(diào)CDH2并抑制中、外胚層分化

已有研究表明了Smad3 的存在會(huì)下調(diào)CDH2 的表達(dá)水平［28-30］。本研究通過(guò)SB431542［21］來(lái)抑制p-Smad3 的功能。蛋白相對(duì)定量結(jié)果顯示，在高滲+抑制劑組（以下簡(jiǎn)稱Anti組）中，p-Smad3的表達(dá)水平受到抑制，表明SB431542成功抑制了p-Smad3的表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與高滲組相比，Anti 組的CDH2呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)，其熒光表達(dá)強(qiáng)度接近于對(duì)照組（圖6B）。此外，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Anti 組的CDH2 顯著上調(diào)（P<0.05），同時(shí)CDH1 的表達(dá)水平略有下降，表明SB431542 可以調(diào)節(jié)EB 的CDH2表達(dá)水平（圖6A）。進(jìn)一步的Western blot檢測(cè)顯示，Anti 組EB 中胚層的表達(dá)情況呈現(xiàn)出T/Bry 表達(dá)量明顯下調(diào)，同時(shí)外胚層標(biāo)志物Tubb3 的表達(dá)水平明顯回升（P<0.05），見(jiàn)圖6C。這提示改變CDH2的表達(dá)水平可能調(diào)節(jié)了EB的胚層分化方向。

Figure 6. Influence of up-regulated CDH2 on differentiation of embryoid bodies（ EBs） in high-osmolarity group. A： Western blot re‐sults for p-Smad3， CDH1 and CDH2 in the 3 groups of EBs； B： the immunofluorescence intensity of CDH2 in the 3 groups of EBs（ scale bar =100 μm）； C： the protein expression levels of T/Bry and Tubb3 in the 3 groups of EBs. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05 vs Hyper group.圖6 上調(diào)CDH2對(duì)高滲組擬胚體分化的影響

討 論

干細(xì)胞在微環(huán)境中能夠精確感知并傳導(dǎo)生物化學(xué)信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的行為、細(xì)胞命運(yùn)或生長(zhǎng)變化產(chǎn)生顯著影響［31，32］。目前，關(guān)于較高滲透壓環(huán)境因素對(duì)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的EB 發(fā)生發(fā)育影響的研究相對(duì)較少，本研究為探討組織與培養(yǎng)環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的功能與分化的影響提供了新的視角。本研究使用PEG 300 來(lái)提高培養(yǎng)液滲透壓。結(jié)果顯示，PEG 300對(duì)EB沒(méi)有即時(shí)毒性作用，并且在EB形成過(guò)程中能夠維持EB 的良好形態(tài)，具有良好的生物安全性。

體外研究已經(jīng)充分證明了鈣黏蛋白對(duì)于干細(xì)胞增殖、自我更新、黏附和多譜系分化的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用［23-24，27，33-35］。本研究觀察到，培養(yǎng)液滲透壓對(duì)EB 的CDH1 和CDH2 的表達(dá)水平產(chǎn)生影響。在高滲組中，CDH1 和CDH2 表達(dá)量與滲透壓濃度呈顯著的線性相關(guān)。然而，與CDH1 相比，高滲組與對(duì)照組之間CDH2 表達(dá)量的差異更為顯著，表明培養(yǎng)環(huán)境滲透壓的提高可能與CDH2 表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)相關(guān)性更強(qiáng)。由于CDH1和CDH2同時(shí)是EMT過(guò)程的標(biāo)志物，其轉(zhuǎn)變可能與EMT 過(guò)程的改變相關(guān)，但由于其他的經(jīng)典EMT 標(biāo)志物沒(méi)有與CDH1 和CDH2 改變相符的趨勢(shì)，與EMT-MET 過(guò)程的標(biāo)志物轉(zhuǎn)變不相符，提示高滲透壓對(duì)EMT 過(guò)程的影響不甚明顯，CDH1 和CDH2可能是作為獨(dú)立因素在發(fā)揮作用。

另外，在EB 形成過(guò)程中，鈣黏蛋白與中胚層和外胚層分化的最早階段事件相關(guān)［27］，了解EB 的三胚層分化情況對(duì)于更充分地利用EB 在再生醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用上至關(guān)重要。對(duì)三個(gè)胚層的標(biāo)志物的表達(dá)情況分析顯示，第6 天EB 的中胚層相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)量顯著高于前4 天，提示EB 的中胚層分化開(kāi)始于第4天之后。同時(shí)，高滲組的中胚層標(biāo)志物表達(dá)量在第4天后顯著高于對(duì)照組，提示高滲促進(jìn)了EB 的中胚層分化效率。相比之下，高滲抑制了EB 的外胚層標(biāo)志物的表達(dá)，但對(duì)內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)影響不明確。

進(jìn)一步比較不同滲透壓濃度對(duì)EB 中胚層分化的影響發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓濃度的升高，EB 中胚層標(biāo)志物的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且與CDH1 隨著滲透壓濃度增加而上調(diào)、CDH2隨著滲透壓濃度增加而下調(diào)的趨勢(shì)一致。這提示滲透壓升高可能通過(guò)穩(wěn)定CDH1及抑制CDH2 的表達(dá)，從而影響了EB 的分化過(guò)程。此外，CDH1可能直接或間接參與多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子OCT4 的表達(dá)［15］。因此，高滲組EB 中多能性相關(guān)基因的高表達(dá)量可能提示著滲透壓可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣黏蛋白來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)的這些過(guò)程。

Sally 等［21］的研究結(jié)果顯示，阻斷CDH1 的下調(diào)能夠抑制神經(jīng)誘導(dǎo)分化，同時(shí)促進(jìn)多能性或中胚層分化。在本研究中，滲透壓引起的CDH1 表達(dá)差異并不如CDH2 顯著。相對(duì)于高滲組，Anti 組的CDH1降低沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，高滲組與對(duì)照組的比較結(jié)果顯示，在較高滲透壓環(huán)境中，CDH1 的表達(dá)量高于對(duì)照組，與Sally 等的研究結(jié)果一致。這也提示在較高滲透壓環(huán)境中，CDH2 可能對(duì)EB 的分化扮演更為重要的角色，這與其他關(guān)于CDH2 對(duì)分化影響的研究相符［28，35-37］。

通過(guò)上調(diào)高滲組EB 的CDH2 表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)Anti 組中胚層標(biāo)志物的表達(dá)量下降，而外胚層標(biāo)志物的表達(dá)量上調(diào)。這表明高滲對(duì)于EB 分化的影響是可以通過(guò)上調(diào)CDH2被逆轉(zhuǎn)的。Pei等人的研究也顯示，在iPSCs 中強(qiáng)制表達(dá)CDH2 顯著提高了分化效率，而shRNA 敲低CDH2 則阻斷了神經(jīng)分化［36］。這些研究結(jié)果支持了本研究的發(fā)現(xiàn)，即較高滲透壓環(huán)境導(dǎo)致CDH1 相對(duì)維持而CDH2 下調(diào)，尤其是CDH2的下調(diào)，對(duì)EB 產(chǎn)生傾向于中胚層分化和神經(jīng)外胚層抑制具有顯著影響（圖7）。

Figure 7. Schematic diagram depicting the influence of hyperos‐motic pressure on the differentiation of embryoid bodies.圖7 高滲透壓影響擬胚體分化示意圖

綜上所述，本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞外環(huán)境中滲透壓對(duì)干細(xì)胞分化的重要影響：增加環(huán)境滲透壓對(duì)EB 的中胚層分化起到了促進(jìn)作用，而對(duì)外胚層分化起到抑制作用。這種作用與較高滲透壓環(huán)境引發(fā)的CDH1 的維持和CDH2 的下調(diào)相關(guān)聯(lián)。本研究為物理環(huán)境因素影響細(xì)胞功能提供了新的線索，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供了新的思路。