Mdivi-1通過抑制少突膠質細胞凋亡信號通路發揮髓鞘保護作用*

李艷花， 張曉娟▲， 張思羽， 侯惜緣， 劉子乙， 于曉靜， 張年萍△

（1山西大同大學醫學院，老年慢性病智慧醫康養大同市重點實驗室，山西 大同 037009；2西安交通大學醫學院，陜西 西安 710004）

多發性硬化（multiple sclerosis）是一種難治易復發的自身免疫性中樞神經系統白質脫髓鞘疾病，已經成為導致青壯年殘疾的第二大類疾病，在我國多發性硬化發病率逐年提高，目前缺乏特效藥［1］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）是目前最為常用的多發性硬化動物模型，與多發性硬化臨床表現接近，普遍認為多發性硬化和EAE 的病理過程相似［2］。已有研究顯示，線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial fission inhibi‐tor-1， Mdivi-1）能明顯改善小鼠EAE 發病期臨床癥狀，但關于具體作用機制仍不明確。髓鞘是包裹在神經元軸突外面的管狀外膜，在中樞神經系統中由少突膠質細胞形成。髓鞘持續損傷，可累及軸索、神經元和異常激活神經膠質細胞，進而嚴重損害中樞神經系統，導致病情加重，因此，阻斷髓鞘損傷和促進髓鞘再生是改善臨床結局過程的關鍵事件［3］。

材料和方法

1 實驗動物及主要試劑、儀器

8 周 齡雌性SPF 級C57BL/6 小鼠30 只，體質 量18～21 g，從北京維通利華動物有限公司購買，許可證號：SCXK（京）2019-0008。實驗動物的使用、飼養和處理均符合山西大同大學的動物倫理道德原則。Mdivi-1、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、弗氏完全佐劑、DAPI、細胞增殖試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）細胞毒性檢測試劑盒（Sigma）；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（Invitro‐gen）；髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白第35～55 位肽段（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55， MOG35-55）購自Genscript；星形孢菌素（stauro‐sporine）購 自Enzo Life Sciences；抗MOG、CC1、cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C （CytC）和Bax 和Bcl-2 抗體（Abcam）；TUNEL 凋亡試劑盒（Pro‐mega）。流式細胞儀（Bio-Rad）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 實驗動物分組及處理 所有小鼠后頸部皮下注射0.2 mL MOG35-55乳劑（含MOG35-55300 μg、滅活的結核分枝桿菌400 μg、生理鹽水100 μL 和弗氏完全佐劑100 μL）［4］。小鼠隨機分為2 組（每組15 只），免疫后第3 天起持續進行如下處理：（1）DMSO 模型組，腹腔給予0.1% DMSO 水溶液；（2）Mdivi-1 干預組，腹腔給予Mdivi-1（25 mg·kg?1·d?1，用0.1% DMSO水溶液溶解）。至免疫后第28 天，腹腔注射氯胺酮-甲苯噻嗪（80 mg/kg+5 mg/kg），麻醉斷頸處死，用生理鹽水快速經心臟灌注沖洗血管，灌注4%多聚甲醛進行體內固定，分離完整的脊髓組織；4 ℃冰箱中，2%多聚甲醛體外固定4 h，蔗糖溶液中梯度脫水各4 h，OCT 充分浸潤包埋，并制成10 μm 切片，過夜晾干后，?80 ℃冰箱保存備用。

2.2 髓鞘病理染色 上述冰凍切片使用本實驗室改良的Luxol fast blue （LFB）染色流程進行染色［5］，具體如下：切片先經乙醇二甲苯梯度脫水脫脂，再復水至95%乙醇溶液，除去二甲苯，放入LFB 溶液中染色過夜（56 ℃溫箱中），經乙醇梯度復水，滴加0.05%碳酸鋰分化液，分化兩次至脊髓灰質變白，終止分化，乙醇二甲苯梯度脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察脊髓白質髓鞘染色情況，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件measure-Count-area 工具測量脊髓白質區域中沒有染藍的區域（該區域為髓鞘脫失區域），計算脫髓鞘區域占整個白質區域的百分比。

2.3 免疫熒光染色 上述冰凍切片用PBS 洗3 次，1% BSA/0.3% Triton X-100/PBS 封閉通透2 h，加抗MOG、CC1、cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C、Bax 和Bcl-2 抗體，4 ℃冰箱中孵育過夜，次日PBS洗3 次，加入相應的Ⅱ抗，室溫孵育1.5 h，DAPI 染色5 min，PBS 洗3 次，50%甘油封片，缺失Ⅰ抗處理的切片作為陰性對照，用激光共聚焦采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件measure-Count-area 工具測量陽性區域，使用圖片上的標尺折合成面積。

2.4 TUNEL 染色使用0.3% Triton X-100/PBS 將切片通透10 min，PBS 洗3 次，在TUNEL 熒光素染色液中浸染10 min，PBS 洗3 次，50%甘油封片，用激光共聚焦采集圖像。Image-Pro Plus 6.0 軟件“面積”參數測量陽性表達熒光信號。

2.5 Western blot實驗 稱量脊髓組織，置于離心管中，以1 g∶7 mL 的比例加入RIPA 裂解液，加入兩顆磁珠，在bead shaker 上震蕩1 min，4 ℃孵育30 min。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，制備濃度相同的蛋白樣本。用15% SDS-PAGE 分離脊髓蛋白，250 mA，75 min 轉膜，50%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入Ⅰ抗（cleaved caspase-3、caspase-9、cytochrome C、Bax、Bcl-2和GAPDH 抗體，均1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日早上孵育HRP 偶聯抗兔或抗小鼠Ⅱ抗，室溫孵育2 h。洗膜后，加ECL 顯色液顯色，Bio-Rad 成像儀凝膠成像，Image Lab 6.1軟件分析檢測條帶灰度比值。

2.6 MO3.13少突膠質細胞處理和JC-1染色 用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養MO3.13 少突膠質細胞系于6 孔板中，分為正常對照組、Mdivi-1 組、staurosporine 組和staurosporine+Mdivi-1，每組設置3個復孔。細胞貼壁后，加入5 μmol/L staurosporine 和10 nmol/L Mdivi-1 處理2 h，更換只含有DMSO 或Mdivi-1 的培養液繼續培養過夜，次日收集上清液，1×109/L 細胞加入10 mg/L 的JC-1 染色10 min，PBS 洗滌，流式細胞儀檢測熒光信號，實驗重復3次。

2.7 LDH 檢測MO3.13 少突膠質細胞死亡 取上述細胞培養液50 μL于96孔板中，再加入50 μL反應混合液，室溫孵育30 min，加入終止液，振蕩10 s，于492 nm波長檢測吸光度（A），實驗重復3次。

2.8 MTT檢測MO3.13少突膠質細胞活力 細胞培養于96 孔板中，培養和處理方法同2.6，藥物處理結束前，加入MTT，繼續培養4 h 后，吸去培養液，加入含0.04 mol/L HCl 的0.2 mL 異丙醇，充分混勻，于570 nm波長測定A值，實驗重復3次。

3 統計學處理

上述數據輸入GraphPad Prism 6 軟件，以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間均數比較使用韋爾奇校正的非配對t檢驗，多組間均數比較采用方差分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。山西大同大學統計學專家對文章中的統計學方法進行審核。

結 果

1 Mdivi-1減少EAE小鼠脊髓組織白質區髓鞘丟失

LFB 染色結果顯示，給予DMSO 的EAE 模型小鼠髓鞘丟失較多，而給予Mdivi-1 的EAE 模型小鼠髓鞘丟失較少（P<0.01），見圖1A；使用抗MOG 抗體對脊髓組織進行免疫熒光染色，發現給予DMSO 的EAE 模型小鼠脊髓組織中較多部位的MOG 表達量減少，MOG 蛋白分布雜亂，而給予Mdivi-1 的EAE 模型小鼠脊髓組織中MOG 蛋白分布均勻且表達量較DMSO 組顯著增加（P<0.01），見圖1B；對DAPI 標記的細胞核周圍MOG 蛋白的分枝狀表達進行統計，發現Mdivi-1 干預顯著增加了細胞核周圍MOG 的分布量（P<0.05），見圖1C。

Figure 1. Mdivi-1 decreased demyelination in the spinal cord of EAE mice. A： LFB staining and quantitative analysis of demyelin‐ation in the white matter of spinal cord； B： immunofluorescence of MOG-positive myelin in the white matter of spinal cord and quantitative analysis of MOG+ myelin density； C： demonstration of the method to quantify branching of oligodendrocyte process extension. Concentric circles separated by 15 μm were drawn around the DAPI+ nucleus， and the number of inter‐sections that MOG+ myelin with the concentric circles was defined as the branching score using the Sholl analysis plugin for ImageJ software. Quantitative analysis was performed for MOG+ branch score. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.圖1 Mdivi-1減少EAE小鼠脊髓組織髓鞘丟失

2 Mdivi-1 減少EAE 小鼠脊髓組織中少突膠質細胞凋亡

使用CC1 抗體和TUNEL 稀釋液對小鼠脊髓組織進行染色，結果顯示在DMSO 處理的EAE 模型小鼠脊髓組織中有很少的CC1 表達，TUNEL 和cleaved caspase-3 陽性細胞較多，而Mdivi-1 處理組的CC1 表達量高，TUNEL 和cleaved caspase-3 陽性細胞少，兩組進行比較，Mdivi-1 顯著減少了CC1 和TUNEL 雙陽性細胞數量，也顯著減少了cleaved caspase-3 陽性細胞數量（P<0.01），見圖2。

Figure 2. Mdivi-1 decreased the apoptosis of CC1+ oligodendrocytes in the spinal cord of EAE mice. A： double immunofluorescence staining of CC1 and TUNEL was shown and quantitative analysis was performed； B： immunofluorescence staining of cleaved caspase-3 was shown and quantitative analysis was performed. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs DMSO group.圖2 Mdivi-1減少EAE小鼠脊髓組織中少突膠質細胞凋亡

3 Mdivi-1 減少凋亡蛋白caspase-9 和cytochrome C的表達

使用抗caspase-9 抗體和抗cytochrome C 抗體對小鼠脊髓組織進行免疫熒光染色，結果顯示在DMSO處理的EAE 模型小鼠脊髓組織中有很多caspase-9和cytochrome C 表達，而Mdivi-1 處理組caspase-9 和cytochrome C表達顯著減少（P<0.01），見圖3。

Figure 3. Mdivi-1 decreased the expression of caspase-9 and cytochrome C in the spinal cord of EAE mice. Immunofluorescence staining of caspase-9（ A） and cytochrome C（ B） was shown， and quantitative analysis was performed. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs DMSO group.圖3 Mdivi-1減少EAE小鼠脊髓組織白質區caspase-9和cytochrome C的表達

4 Mdivi-1 減少細胞凋亡蛋白Bax 的表達，而不影響抗凋亡蛋白Bcl-2的表達

使用Bax抗體和Bcl-2抗體對小鼠脊髓組織進行染色，結果顯示，與DMSO 處理的EAE 模型組相比，Mdivi-1 處理組小鼠脊髓組織中Bax 表達量較低（P<0.01），而Bcl-2 的表達量兩組之間沒有顯著差異，見圖4。

Figure 4. Effect of Mdivi-1 on Bax and Bcl-2 expression levels in the spinal cord of EAE mice. Immunofluorescence staining of Bax（A） and Bcl-2（ B） was shown， and quantitative analysis was performed. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs DMSO group.圖4 Mdivi-1對EAE小鼠脊髓組織Bax和Bcl-2表達的影響

5 Mdivi-1 對cleaved caspase-3、caspase-9、CytC、Bax和Bcl-2表達的影響

Western blot 實驗結果進一步顯示，與DMSO 組相比，Mdivi-1 組小鼠脊髓組織凋亡蛋白cleaved cas‐pase-3、caspase-9、CytC 和Bax 的表達水平顯著降低（P<0.05），而Bcl-2 表達沒有顯著差異，與免疫熒光染色結果相同，見圖5。

Figure 5. Effect of Mdivi-1 on apoptotic protein expression levels in the spinal cord of EAE mice. The protein levels of cleaved cas‐pase-3， caspase-9， cytochrome C（ CytC）， Bax and Bcl-2 in the spinal cord were detected by Western blot. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs DMSO group.圖5 Mdivi-1對EAE小鼠脊髓組織凋亡蛋白表達的影響

6 Mdivi-1減少MO3.13少突膠質細胞的損傷

體外培養MO3.13 少突膠質細胞系6 h，待細胞貼壁后，先加入staurosporine 和Mdivi-1 處理2 h，更換只含有DMSO 或Mdivi-1 的細胞培養液，繼續培養24 h，取細胞，使用JC-1 染料標記線粒體膜電位極化狀態，結果顯示staurosporine 處理導致正常細胞（live cells）與線粒體膜去極化的細胞（apoptotic cells）比值顯著降低（P<0.01），Mdivi-1 處理增加了正常細胞與線粒體膜去極化的細胞的比值（P<0.05），說明Mdi‐vi-1 能阻止staurosporine 誘導的線粒體膜電位去極化，減少線粒體相關細胞凋亡，見圖6A。收集細胞上清液，使用LDH 試劑盒檢測細胞死亡情況，發現staurosporine 誘導更多的細胞死亡（P<0.01），Mdivi-1處理顯著減少了staurosporine 誘導的細胞死亡（P<0.01），見圖6B；使用MTT 實驗檢測細胞活力，發現staurosporine 處理導致細胞活力顯著下降（P<0.01），Mdivi-1 顯著阻止staurosporine 誘導的細胞活力下降（P<0.01），見圖6C。

討 論

少突膠質細胞的丟失與多發性硬化疾病的進展密切相關，凋亡信號通路和補體系統異常激活是少突膠質細胞丟失的主要機制之一，抑制少突膠質細胞凋亡能起到髓鞘保護的作用。已有研究顯示EAE模型小鼠的脊髓組織中發動蛋白相關蛋白1（dyna‐min-related protein 1， Drp1）第616 位絲氨酸（Ser616）磷酸化水平明顯升高［6］，Drp1（Ser616）過度磷酸化導致線粒體過度分裂、生物能量缺陷、活性氧和促凋亡因子的釋放，導致線粒體相關細胞凋亡［7-8］。Mdivi-1是Drp1 的抑制劑，能有效抑制Drp1 的磷酸化。因此，本課題組使用TUNEL 試劑盒檢測了Mdivi-1 對EAE 小鼠脊髓組織細胞凋亡的影響，結果發現DMSO 處理的EAE 小鼠脊髓組織中有大量的TUNEL陽性細胞，表明有大量細胞發生凋亡，使用CC1 標記少突膠質細胞，結果顯示在DMSO 模型組中，大量的凋亡信號定位于少突膠質細胞。因此，我們認為MOG 免疫誘導的脫髓鞘依賴于少突膠質細胞凋亡，是EAE 模型中少突膠質細胞丟失的原因，但是Mdi‐vi-1 干預使得EAE 小鼠脊髓組織中CC1+TUNEL+細胞數量明顯減少。體外培養MO3.13少突膠質細胞，使用staurosporine 處理2 h，明顯誘導MO3.13少突膠質細胞線粒體膜電位發生去極化，增加細胞膜通透性，使更多的LDH 滲出到胞外，MTT 實驗也顯示staurosporine 使細胞活力明顯下降，但給予Mdivi-1干預，可以明顯阻止staurosporine 誘導的細胞損傷。以上體內和體外實驗均證明Mdivi-1 干預可以抑制少突膠質細胞凋亡。

大量cytochrome C 進入細胞質是線粒體相關凋亡途徑中最關鍵的環節［9］。因此，本研究對線粒體相關凋亡蛋白表達進行了分析，結果顯示EAE 小鼠脊髓組織白質區caspase-9、cytochrome C 和cleaved caspase-3 被激活。有研究顯示線粒體內外膜通透性轉變孔過度開放，膜通透性增加，促進了cytochrome C 釋放進入細胞質［10］，與凋亡蛋白酶活化因子1 和procaspase-9結合形成凋亡小體，啟動caspase 家族凋亡級聯反應，激活下游靶點caspase-3，最終導致細胞凋亡［11］。Mdivi-1 治療減少了caspase-9、cytochrome C和cleaved caspase-3的表達，這為Mdivi-1抑制細胞凋亡提供了直接證據。Yi 等［12］2022 年發現，Mdivi-1 能阻止鎘誘導的線粒體過度分裂、阻止cytochrome C 從線粒體釋放到胞質并減弱生殖細胞凋亡，這與我們的研究結論相似。另外，在線粒體相關凋亡途徑中，Bax 是一個重要的介導者，當Bax 被激活后，破壞線粒體外膜完整性，Bax 易位到線粒體，促進cyto‐chrome C 釋放［13］。正常情況下，促凋亡和抗凋亡蛋白平衡協調，但當這種平衡被打破后，就會導致細胞凋亡［14］。在實驗中EAE 小鼠脊髓白質中Bax 的表達量明顯增加，Mdivi-1 干預明顯降低了Bax 的表達，但是沒有影響抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，暗示在EAE 模型小鼠中Mdivi-1 具有明顯抑制凋亡的能力而不能提升細胞的抗凋亡能力。Nguyen 等［15］2021 年 對Mdivi-1在中風后缺血再灌注損傷的臨床前應用評估中發現，十項研究均顯示Mdivi-1 能降低線粒體介導的促凋亡因子（凋亡誘導因子、Bax、cytochrome C、caspase-9 和caspase-3）的表達，并增強抗凋亡因子Bcl-2 的表達，這與我們的研究結果相似但不完全一致。

綜上所述，我們推測在EAE 模型中，MOG 免疫誘導的脫髓鞘與少突膠質細胞丟失有關，凋亡是少突膠質細胞丟失的原因；Mdivi-1 干預可以通過抑制線粒體相關凋亡途徑來抑制細胞凋亡，起到對少突膠質細胞和髓鞘的保護作用。但是細胞凋亡是個復雜的過程，Mdivi-1 能否通過抑制其他的凋亡途徑來減少EAE小鼠脊髓組織中少突膠質細胞的丟失還有待我們進一步探討。