不同松花粉提取物對環磷酰胺誘導大鼠卵巢損傷的保護作用

劉其聳，陳 陽，楊長軍，何毓婕，陳秋銘，何志勇，王召君，陳 潔，曾茂茂,*

（1.煙臺理工學院食品與生物工程學院，山東 煙臺 264000；2.煙臺新時代健康產業有限公司，山東 煙臺 264006；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

卵巢是雌性動物卵泡發育，黃體形成、退化和排卵以及類固醇激素合成的生殖器官，其分泌的性腺類固醇激素、前列腺素等多種激素和生長因子控制著機體的發育和生理活動[1]。醫療相關卵巢損傷主要是指手術或放化療對卵巢結構和功能所造成的損傷，可見于婦科良惡性腫瘤的治療過程中[2]。環磷酰胺是臨床上最常用的藥物之一，對多種腫瘤及自身免疫性疾病具有良好的治療效果，但其作為烷化劑是公認的對卵巢損傷最大的化療藥物，會導致用藥患者卵巢功能損傷、生育能力下降，還可能影響終身健康[3]。環磷酰胺誘導卵巢損傷機制相關的信息很少，目前多將其歸因于氧化應激、炎癥和細胞凋亡[4]。一些天然產物被證明可對環磷酰胺誘導的卵巢損傷起到有效的保護作用[5]，具體效果取決于所含有效單體成分的種類與含量。由于具有良好的抗氧化特性[4]，已有較多的植物單體成分被證實具有卵巢保護的功效，如白藜蘆醇[6]、槲皮素[7]、鹽酸益母草堿[8]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[9]、淫羊藿苷[10]、輔酶Q10[11]和人參皂苷Rb1[12]等諸多黃酮、多酚和三萜類小分子化合物，更大分子質量的富硒蛋清肽（分子質量為200～1 000 Da的組分占比達98.33%）[13]、殼寡糖（水溶，分子質量≤2 000 Da）[14]，以及來源于動植物的魷魚墨多糖[15]、透明質酸[16]、巖藻聚糖硫酸酯[17]等大分子。對環磷酰胺誘導卵巢損傷具有保護作用的物質在分子質量及溶解性上具有較大差異，這可能與疾病發生涉及機體內的多個通路及靶點有關[18]。

松花粉是松科植物馬尾松、油松或其同屬植物的雄性生殖細胞，是一種藥食同源的原料，目前已在扶正化瘀片（膠囊）、清肺止咳散和哮喘丸等中成藥中廣泛應用。研究發現，松花粉中含有維生素、酚酸、黃酮、萜類、生物堿、有機酸、氨基酸及其衍生物、脂類、糖及醇類和核苷酸及其衍生物等小分子物質[19]，以及多糖[20]和蛋白質[21]等大分子物質。松花粉的乙醇提取物和水提物都具有較好的抗氧化活性[22]，并可改善機體的炎癥癥狀[23]，調節細胞凋亡[24]。本課題組的前期研究證實松花粉可以有效保護環磷酰胺誘導的卵巢損傷[25]，并通過廣泛靶向代謝組學發現松花粉可以通過影響α-亞麻酸代謝、VB6代謝、嘌呤代謝、賴氨酸降解和糖酵解/糖異生途徑促進肝臟代謝由紊亂向正常水平回歸[18]，這可能是松花粉“從肝論治卵巢早衰”干預環磷酰胺誘導卵巢損傷的機制之一[26]。中藥強調多組分多靶點協同作用，但因中藥成分多樣、與機體相互作用非常復雜，直接揭示其混合組分在分子水平上的作用機制非常困難。通過按照分子質量大小和化合物溶解性差異等理化性質對松花粉組分進行分離，進而驗證各組分對卵巢的保護效果，結合統計分析可以篩選效應組分以及確定其相應的主要干預途徑。

本研究分析松花粉水提物、水提大分子化合物（＞5 kDa）、乙醇提物和乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）4 種松花粉提取物的總糖、粗多糖、總酚和總黃酮等組成，并探討各提取物對攝入環磷酰胺大鼠的卵巢保護作用，包括卵巢形態、抗氧化能力、細胞凋亡能力和抗炎能力等，進一步通過統計分析對松花粉的效應組分進行篩選，旨在對后續準確解析松花粉內對于卵巢損傷具有保護作用的藥效物質及其體內作用機制提供指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD大鼠（雌性，10 周齡，體質量約250 g），由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供（生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001）。

破壁云南松花粉 新時代健康產業（集團）有限公司；環磷酰胺一水合物 上海源葉生物科技有限公司；補佳樂戊酸雌二醇片 拜耳醫藥保健有限公司。

甲醛溶液、甲醇、福林-酚試劑 中國醫藥集團有限公司；RIPA細胞裂解液 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-4試劑盒，總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒，脂質氧化檢測試劑盒，一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光），BCA蛋白濃度測定試劑盒，伊紅-蘇木素（hematoxylin &eosin，H&E）染色試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ASP300S全自動脫水機、EG1150H組織包埋機、RM2245轉輪式切片機、ST5010自動載玻片染色機德國Leica儀器有限公司；Trans-Blot Turbo半干轉印系統、164-5050基礎電源電泳儀、165-8003小型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；iBright FL1500成像系統美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 松花粉提取物的制備

水提物的制備：稱取100 g破壁松花粉，溶于2 L超純水。在45 ℃超聲攪拌3 h，抽濾，重復3 次后合并濾液，凍干，得到松花粉水提物；水提大分子化合物的制備：水提物制備中合并的濾液使用5 kDa的膜超濾后保留截留液，凍干，得到水提大分子化合物（＞5 kDa）；乙醇提物的制備：取100 g破壁松花粉溶于2 L體積分數70%乙醇溶液。在45 ℃超聲攪拌3 h，抽濾，重復3 次后合并濾液，40 ℃旋轉蒸發全部乙醇，凍干，得到松花粉乙醇提物；乙醇提小分子化合物的制備：松花粉醇提物制備中合并的濾液使用5 kDa的膜超濾后保留透過液并再次超濾。第2次的透過液在40 ℃旋轉蒸發，凍干，得到乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）。

1.3.2 松花粉提取物總糖、粗多糖、總酚和總黃酮含量的測定

采用GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》[27]中的苯酚-硫酸法對松花粉中總糖含量進行測定。采用袁桂香等[28]的水提醇沉法提取多糖，用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量。依據梅進等[29]的方法測定松花粉中總酚含量。依據黃雪秋等[30]的方法測定松花粉中總黃酮含量。

1.3.3 動物實驗

大鼠適應性喂養1 周，除空白對照組8 只之外，其余進行環磷酰胺誘導卵巢損傷，空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水。取造模成功的56 只大鼠隨機分為7 組，每組8 只，灌胃方式如表1所示，連續灌胃28 d。末次給藥后，大鼠禁食12 h后使用異氟烷吸入麻醉。迅速取出卵巢，剔除所有脂肪后稱質量，計算卵巢指數。稱質量后的卵巢一半用質量分數4%多聚甲醛溶液固定，一半置于液氮中存于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.4 大鼠卵巢組織病理學觀察

4%多聚甲醛溶液中的卵巢使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續切片，H&E染色后，于光學顯微鏡下進行組織病理學觀察并拍照記錄，觀察內容包括卵巢的始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡、黃體數的差異，以及卵巢皮質、髓質、顆粒細胞和細胞間質等其他病理改變。

1.3.5 酶聯免疫吸附法檢測大鼠卵巢炎癥因子和抗氧化能力

采用商業化試劑盒測定卵巢中的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-4水平，以及SOD、GSH-Px、CAT的活力、T-AOC水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，具體步驟嚴格按照說明書執行。

1.3.6 大鼠卵巢顆粒細胞TUNEL檢測

采用商業化試劑盒測定卵泡周圍顆粒細胞的凋亡水平，具體步驟嚴格按照說明書進行。操作完成后于熒光顯微鏡下拍攝清晰照片用于凋亡細胞計數和凋亡指數計算，計算公式如下：

1.3.7 蛋白質免疫印跡法（Western blot，WB）檢測大鼠卵巢凋亡蛋白表達

冷凍的卵巢在冰上剪切后，于RIPA裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）中充分勻漿，靜置30 min，以14 000 r/min離心10 min。以蛋白濃度最低的樣品為基準進行凝膠電泳，并使用半干轉印系統將蛋白從凝膠轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉2 h。封閉后PVDF膜用TBST洗滌3 次，加入不同的一抗（表2），4 ℃孵育過夜。一抗孵育后，用Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3 次，每次20 min，然后二抗室溫孵育1 h。用TBST洗滌3 次，每次20 min，然后將增強型化學發光試劑均勻滴在PVDF薄膜上，用化學發光成像檢測儀檢測發光強度并拍照。

表2 WB抗體信息Table 2 Information about antibodies used for WB

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 松花粉4 種不同提取物的成分分析

松花粉4 種提取物中的總糖、粗多糖、總酚和總黃酮含量如表3所示。可以發現，水提物中的糖類物質的含量較醇提物更高，而酚類及黃酮類物質則相反，在乙醇提物中含量更高（P＜0.05）。通過使用5 kDa的膜超濾后的水提大分子化合物中含有更多的糖類，且粗多糖相對總糖占比由22.59%增加至28.65%，總黃酮流失更為嚴重；乙醇提小分子化合物中總酚、總黃酮含量有所富集，總糖含量下降最為顯著。以往研究中證實植物多糖及多酚、黃酮類物質都可以對環磷酰胺誘導的卵巢損傷起到保護作用[7,17]，本研究制備所得的4 種提取物在這些主要活性成分含量上差異顯著（P＜0.05），通過驗證4 種提取物對環磷酰胺誘導卵巢損傷的保護效果，可以為后續篩選松花粉中確切具有卵巢保護作用的單一組分糖類抑或是多酚黃酮類的藥效物質提供指導，并可通過不同組分作用途徑的差異為更加科學的食品或藥品復配提供理論依據。

表3 松花粉4 種提取物的功效成分含量Table 3 Contents of four functional components in pine pollen extracts mg/g

2.2 松花粉提取物對卵巢損傷大鼠卵巢形態的影響

經各松花粉提取物灌胃后，與模型組相比，乙醇提物組、乙醇提小分子化合物組和水提大分子化合物組均對卵巢指數有顯著提升，而原粉組和水提物組沒有顯著提升。從卵巢形態的結果來看，模型組較空白組的始基卵泡差異不明顯，初級、次級和成熟卵泡及黃體數量下降顯著，閉鎖卵泡則顯著增加（圖1），符合以往文獻報道中環磷酰胺破壞發育中卵泡這一現象[31]。相比于模型組，陽性組的始基卵泡和閉鎖卵泡數量大量下降，初級卵泡變化不明顯，次級和成熟卵泡及黃體數量一定程度上恢復。原粉組黃體數量比陽性組少，低于空白組，水提物組具有與原粉組類似的結果。乙醇提物組的初級和次級卵泡數量顯著下降，而成熟卵泡明顯增加，閉鎖卵泡數量最少。除黃體和閉鎖卵泡兩項，水提大分子化合物組與水提物組結果相似，水提大分子化合物組增加了黃體數量，但對于減少閉鎖卵泡的效果最差。乙醇提小分子化合物組對減少閉鎖卵泡的效果僅次于乙醇提物組，成熟卵泡數量與空白對照組持平，但初級卵泡和次級卵泡數量比空白對照組少。結果表明，各松花粉提取物均對卵巢形態改善具有正面作用，但對卵巢各組織結構的改善效果具有差異。基于水提物和乙醇提物中多糖和小分子抗氧化化合物組成的差異，可以認為松花粉對卵巢形態的影響是多組分多靶點共同作用的結果，探究各組分的作用機理有助于通過對其進行合理組合，以發揮更全面和顯著的保護卵巢效果。

圖1 SD大鼠卵巢組織病理學切片Fig.1 Histopathological sections of SD rat ovaries

2.3 松花粉提取物對環磷酰胺誘導卵巢損傷大鼠卵巢抗氧化能力的影響

如圖2所示，相較于空白對照組，模型組的卵巢T-AOC顯著下降了12.52%，GSH-Px、SOD和CAT活力顯著下降了50.05%、53.80%和63.75%，MDA水平顯著上升了103.38%（P＜0.05）。與模型組相比，除水提大分子化合物組外，其余各組的卵巢抗氧化能力均有顯著提升，其中提升最大的是乙醇提小分子化合物組，其次是乙醇提物，兩組分別將T-AOC、GSH-Px活力、SOD活力和CAT活力顯著提高了25.81%、16.03%，109.90%、104.31%，120.63%、91.62%和237.09%、138.42%，并將MDA水平顯著降低了48.43%、53.42%（P＜0.05）。乙醇提物提升機體抗氧化能力的效果也優于水提物，并且乙醇提物和乙醇提小分子化合物的卵巢GSH-Px和CAT活力無顯著差異（P＞0.05）。水提大分子化合物組在各項抗氧化指標方面的表現不如水提物組，表明水提物對卵巢抗氧化方面的提升可能更多是受水溶性小分子化合物的影響。對于水溶性多糖大分子、醇溶性多酚和黃酮等小分子提升機體內抗氧化酶活力及降低MDA含量均有所報道[32]，但本研究發現相對模型組而言，松花粉水提大分子化合物提升機體內抗氧化酶活力及降低脂質氧化不顯著（P＞0.05），表明松花粉多糖等水溶性大分子物質與小分子化合物在通過調節卵巢氧化應激保護卵巢機制方面存在差異，這可能是松花粉多糖等水溶性大分子物質無法進入胞內作用于相關靶點的原因。

圖2 SD大鼠卵巢T-AOC（A）、GSH-Px（B）、SOD（C）、CAT（D）、MDA（E）水平（n＝5）Fig.2 Levels of T-AOC (A),GSH-Px (B),SOD (C),CAT (D) and MDA (E) in SD rat ovaries (n=5)

2.4 松花粉提取物對卵巢損傷大鼠卵巢抗炎能力的影響

TNF-α和IL-6被認為是促炎因子[33]，而IL-4是抑炎因子[34]。如圖3所示，與空白對照組相比，模型組的TNF-α、IL-6和IL-4均顯著提升，分別提升了190.25%、106.60%和104.04%（P＜0.05），與以往報道中環磷酰胺誘導效果相同[35]，表明環磷酰胺擾亂了大鼠體內免疫應答系統。各松花粉提取物均能顯著回調炎癥因子水平（P＜0.05），且水提物和水提大分子化合物降低促炎因子的效果略好于乙醇提物及乙醇提小分子化合物，但無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，除了在回調TNF-α時水提物與水提大分子化合物的效果略好，可以認為松花粉4 種提取物在通過抗炎機制保護環磷酰胺誘導的卵巢損傷方面具有相似效果。

圖3 SD大鼠卵巢TNF-α（A）、IL-4（B）和IL-6（C）水平（n＝6）Fig.3 Levels of TNF-α (A),IL-4 (B) and IL-6 (C) in SD rat ovaries (n=6)

2.5 松花粉4 種不同提取物對卵巢損傷大鼠卵巢抗細胞凋亡能力的影響

如表4所示，模型組的卵泡顆粒細胞凋亡指數為（83.40±5.37）%，遠高于其余各組（P＜0.05）。松花粉原粉、水提物、乙醇提物、水提大分子化合物、乙醇提小分子化合物分別將凋亡指數顯著降低了50.71%、62.04%、48.29%、55.42%和51.66%，表明松花粉各組分都對調控卵巢顆粒細胞凋亡有積極影響。相比水提物組，水提大分子化合物組凋亡指數升高了11.78%（P＜0.05）；相比醇提物組，醇提小分子化合物組的凋亡指數下降了6.91%（P＜0.05），表明小于5 kDa的小分子化合物能有效減少顆粒細胞的凋亡。水提物細胞凋亡指數顯著低于醇提物，這可能與有效小分子化合物水溶性高于醇溶性，因而在水提物中的含量高于在醇提物中的含量有關。程妮等[36]研究證明松花粉水提取物和乙醇提取物中均檢出原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸4 種酚酸類物質，且在水提取物中的含量均比乙醇提取物中含量高，其中咖啡酸[37]已被證明可以減少卵巢顆粒細胞的凋亡。

表4 8 組大鼠顆粒細胞凋亡指數（n＝5）Table 4 Apoptosis index of granulosa cells in rats from eight groups (n =5)

2.6 4 種松花粉提取物對卵巢損傷大鼠卵巢凋亡蛋白表達的影響

在研究的5 種凋亡相關蛋白中，Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白[38]，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3是促凋亡蛋白，其中Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，僅存在于正在凋亡的細胞中[39]。如圖4所示，模型組較空白組的Bcl-2蛋白含量下降，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3含量均顯著上升。與模型組相比，松花粉原粉及4 種提取物組均顯著上調了Bcl-2蛋白表達，下調了Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表達（P＜0.05）。研究認為，Bcl-2與Bax的比值對細胞接受凋亡信號刺激后是否存活起關鍵作用[40]。本研究結果顯示，乙醇提物組與乙醇提小分子化合物組的Bcl-2/Bax值顯著高于水提物組和水提大分子化合物，而Cleaved Caspase-3的表達則顯著低于水提物組與水提大分子化合物組（P＜0.05），說明乙醇提物與乙醇提小分子化合物調控卵巢抗凋亡蛋白表達能力最強，其次是水提物和大分子水提取物。卵巢凋亡蛋白表達與顆粒凋亡指數的結果存在差異，表明4 種松花粉提取物在通過調控凋亡蛋白表達，進而減少卵巢細胞凋亡的機制方面存在較大差異。

圖4 8 組大鼠卵巢凋亡蛋白表達（n＝3）Fig.4 Expression of apoptosis-related factors in rat ovaries from eight groups (n =3)

2.7 4 種松花粉提取物對卵巢損傷大鼠影響的聚類分析及相關性分析

圖5A顯示，模型組與其余組分為兩大簇，表明4 種提取物都可以一定程度上緩解卵巢損傷。其中，陽性對照組與空白組分為一簇，與乙醇提小分子化合物和乙醇提物歸為一簇，與水提大分子化合物、松花粉原粉和水提物歸為一簇。聚類分析的結果證明了乙醇提小分子化合物和醇提物具有比松花粉原粉、水提物和水提大分子化合物更好的效果。圖5B的相關性分析結果顯示，總酚和總黃酮與閉鎖卵泡間形成負相關，總糖和粗多糖并未表現出與閉鎖卵泡的任何相關性；此外，總酚和總黃酮在提升機體抗氧化力、降低脂質氧化以及抑制促凋亡蛋白表達方面的效果好于總糖和粗多糖，這在一定程度上解釋了富集多酚和黃酮的乙醇提小分子物和乙醇提物具有更好卵巢保護作用的現象。但值得注意的是，糖類與TNF-α具有更強的負相關特性（P＜0.05），即清除促炎因子TNF-α可能是松花粉多糖發揮保護卵巢作用的途徑。

圖5 不同實驗組別大鼠的聚類分析（A）與松花粉提取物和體內指標間的相關性分析（B）Fig.5 Cluster analysis of rats in different experimental groups (A) and correlation analysis between pine pollen extracts and physiological indices in rats (B)

3 結論

本研究分析了4 類松花粉提取物中的糖類、黃酮和多酚的含量，水提物及水提大分子化合物糖類含量較高，而乙醇提物及乙醇提小分子物則含黃酮和多酚較多，且經過進一步制備的水提大分子化合物和乙醇提小分子化合物進一步提升了其中的主要活性物質含量。松花粉的4 種提取物均在一定程度上減少了環磷酰胺誘導的卵巢損傷，但醇提物及乙醇提小分子化合物通過減少閉鎖卵泡，提高卵巢抗氧化能力，調控卵巢凋亡細胞蛋白表達等保護卵巢，而松花粉多糖則通過清除促炎因子TNF-α保護卵巢。后期通過進一步分離多酚黃酮類小分子藥效物質及多糖類物質，有利于制作組分明晰、作用途徑可控的松花粉產品。