氯化鋰通過PI3K/Akt信號通路調控牙髓干細胞成牙本質向分化的研究*

李 鵬,劉會琴,李東雨,朱小苗,王勝朝,何文喜,王志華△

(1.中國科學院大學成都存濟口腔醫院,成都 610031;2.新安縣人民醫院口腔科,河南洛陽 471899;3.口頜系統重建與再生全國重點實驗室/國家口腔疾病臨床醫學研究中心/陜西省口腔醫學重點實驗室/空軍軍醫大學第三附屬醫院牙體牙髓病科,西安 710032;4.空軍軍醫大學空軍特色醫學中心口腔科,北京 100142)

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)在牙髓損傷修復過程中發揮著重要作用,但調控 DPSCs成牙本質向分化的信號轉導機制仍不完全清楚。Wnt/β-連環素(β-catenin)信號通路在牙胚生長發育、牙齒和牙周組織形態發生、牙上皮的增殖發育及成牙本質細胞的生長分化等過程中都發揮著重要作用[1-3]。氯化鋰(LiCl)作為Wnt/β-catenin通路激活劑,可促進成牙骨質細胞增殖及牙周膜干細胞分化[4-6]。然而,氯化鋰是否可以促進牙髓損傷修復過程目前尚未見報道。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路在整個機體細胞存活、生長和分化等生物行為的調控中起著核心作用[7-8]。研究發現PI3K/Akt通路可受到Wnt配體的調節,二者之間發生復雜的相互作用,在誘導成骨細胞功能和骨折愈合等方面發揮重要作用[9]。而PI3K/Akt是否可通過Wnt/β-catenin信號通路調控牙髓再生和牙髓損傷修復過程仍未可知。本研究擬觀察氯化鋰對人DPSCs生物學行為的影響及其相關分子機制,這對闡明牙髓損傷修復的分子機制有重要意義,也可以為將來臨床活髓保存治療和DPSCs組織工程應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1人DPSCs培養和鑒定

本研究經空軍軍醫大學第三附屬醫院倫理委員會審核通過(IRB-REV-2022065),所有受試者均知情同意。參照文獻[10-11]報道的方法進行DPSCs培養和鑒定,從新鮮拔除的人(18～20歲)第三磨牙牙冠取新鮮牙髓組織于6孔板,采用膠原酶和Dispase酶聯合消化牙髓組織20 min后進行原代培養,用含20%胎牛血清的α-最低必需培養液(α-minimum essential medium,α-MEM,美國Gibco公司)0.7 mL重懸組織,靜置培養,3 d后補液至1 mL,每2天更換培養液至細胞呈放射狀生長,傳代后進行單克隆培養。單克隆篩選獲得DPSCs細胞系,進行干細胞鑒定。

1.1.2主要儀器與試劑

主要儀器:超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);ELX808全自動酶標儀(美國BioTek公司);倒置相差顯微鏡和照相系統(日本Olymous公司);PCR儀及實時定量 PCR系統(美國Applied Biosystems公司);電泳儀、全能型蛋白轉印系統、轉膜儀及化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。主要試劑:α-MEM 培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司);膠原酶(德國BioFroxx公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);β-甘油磷酸鈉、Western 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司);1%茜素紅染色液(北京索萊寶科技有限公司);反轉錄試劑盒(德國Qiagen公司);SYBR PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);PCR儀及ABI Prism 7500 real-time PCR系統(美國Applied Biosystems公司);二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒、RIPA(強)裂解液(西安赫特生物科技有限公司);超敏電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)顯影液(蘇州四正柏生物科技有限公司);LY294002(美國Sigma公司);小鼠抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1茜素紅染色檢測礦化結節生成

取克隆生長狀態好的P5代DPSCs,以2×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養板。用含 10%胎牛血清的α-MEM培養基培養細胞達80%以上的匯合率,更換礦化誘導液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C和含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養基)。用濃度0、1、10 mmol/L的氯化鋰加或不加LY294002(25 μmol/L)刺激DPSCs,每3天換液1次,誘導1或2周后終止。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗細胞3次,4%多聚甲醛固定細胞15～30 min;再用PBS清洗細胞3次,清除殘余固定液;40 mmol/L pH 4.2的茜素紅染色5～10 min,用雙蒸水(double distilled water,ddH2O)洗去殘留染液,直至洗液變清為止。倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄礦化結節的形成情況。最后,用10%十六烷基吡啶溶液溶解培養皿里的茜素紅,采用ELX808全自動酶標儀檢測562 nm波長處的吸光度[A(562)]值并記錄。

1.2.2實時熒光定量逆轉錄PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)檢測成牙本質標志基因的表達

以2×105個/孔的細胞密度將DPSCs接種于6孔培養板,培養至匯和率達80%左右時,用含濃度0、1、10 mmol/L氯化鋰加或不加LY294002(25 μmol/L)的礦化誘導液刺激DPSCs,每3天換液1次,誘導2周后終止。用Trizol試劑提取細胞總RNA,用Omniscript RT反轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)合成 cDNA。將cDNA和SYBR PCR試劑混合,使用ABI Prism 7500 real-time PCR系統進行逆轉錄。PCR循環條件:95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,35個循環。牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)基因引物序列見表1。以GAPDH基因為內參基因,將目的基因相對于人GAPDH和對照(未處理細胞)水平的相對倍數變化歸一化,采用2-ΔΔCt法表示目的基因相對表達水平。

表1 PCR引物序列

1.2.3Western blot檢測Akt及磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)水平

6孔板每孔接種2×105個DPSCs,細胞匯合度達到80%左右加入濃度1 mmol/L氯化鋰(加或不加LY294002),用不含血清的α-MEM培養基饑餓培養6、12、24 h后終止培養,以未加入氯化鋰和LY294002處理的細胞為對照(0 h)。棄去培養液,加入預冷的PBS,清洗3次;每組加入適量含苯甲基磺酰氟(PMSF)的IP裂解液(PMSF終濃度1 mmol/L),冰上裂解10 min將細胞刮下收集至EP管內,4 ℃、12 000×g離心15 min;然后將上清液轉移至新的EP管中進行BCA定量,加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液,煮沸10 min。配制10%分離膠和5%濃縮膠,每條泳道加樣20 μg蛋白,220 V恒壓電泳30 min分離樣品蛋白;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜先用甲醇活化,再半干轉膜,25 V恒壓電泳7 min;轉膜完成后,將PVDF膜放入封閉液中封閉 0.5 h。PI3K/Akt各磷酸化蛋白和總蛋白抗體按照1∶1 000稀釋于5%胎牛血清中,4 ℃過夜。TBST清洗3次,每次5 min,放入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(抗體稀釋液1∶5 000稀釋),37 ℃孵育1 h,TBST清洗3次,每次5 min。ECL液(A、B液以1∶1混合)均勻涂于膜上,使用增強型化學發光成像系統對蛋白質條帶進行曝光。ImageJ軟件分析面板灰度作圖,計算p-Akt/Akt比值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 氯化鋰對DPSCs牙本質向分化能力的影響

茜素紅染色分析發現:礦化誘導1周后,各組均形成很少的礦化結節,見圖1A、B;礦化誘導2周后,各組均產生較多的礦化結節,其中1 mmol/L氯化鋰刺激可明顯促進DPSCs礦化結節的形成(P<0.05),而10 mmol/L氯化鋰刺激后礦化結節形成減少(P<0.05),見圖1A、C。RT-qPCR結果發現,1 mmol/L氯化鋰刺激DPSCs 2周可明顯促進成牙本質標志基因DSPP、DMP1、BSP、ALP mRNA的表達(圖1D),提示1 mmol/L氯化鋰刺激DPSCs能夠誘導其牙本質向分化。

A:茜素紅染色;B、C:分別為不同濃度氯化鋰刺激DPSCs 1、2周后茜素紅染色定量分析;D:不同濃度氯化鋰刺激DPSCs 2周后成牙本質標志基因定量分析;a:P<0.05,與0 mmol/L氯化鋰比較。

2.2 PI3K/Akt信號通路對氯化鋰調控的DPSCs分化過程的影響

為了驗證PI3K/Akt信號通路是否參與氯化鋰調控的DPSCs成牙本質向分化過程,用PI3K信號通路抑制劑LY294002(25 μmol/L)加或不加氯化鋰(1 mmol/L)刺激DPSCs礦化誘導2周,通過茜素紅染色分析發現,氯化鋰(1 mmol/L)可明顯促進DPSCs礦化結節形成(P<0.05),而加入LY294002(25 μmol/L)明顯削弱了氯化鋰(1 mmol/L)對DPSCs礦化結節形成的作用(P<0.05),見圖2A、B。RT-qPCR結果發現,氯化鋰(1 mmol/L)明顯促進DPSCs牙本質標志基因DSPP、DMP1、ALP mRNA的表達;而加入LY294002(25 μmol/L)后DSPP、DMP1、ALP mRNA表達明顯下調(P<0.05),見圖2C～F。

A、B:茜素紅染色及定量分析;C～F:分別為DSPP、DMP1、ALP、OCN mRNA定量分析;氯化鋰濃度:1 mmol/L;a:P<0.05,與氯化鋰和LY294002未處理細胞比較;b:P<0.05,與1 mmol/L氯化鋰刺激細胞比較。

2.3 PI3K/Akt信號通路對氯化鋰誘導的DPSCs內Akt蛋白活化情況的影響

為了進一步驗證PI3K/Akt信號通路的作用,用1 mmol/L氯化鋰刺激DPSCs 0、6、12、24 h(加或不加LY294002),通過Western blot檢驗PI3K通路下游Akt活化情況,結果顯示:氯化鋰刺激DPSCs后p-Akt/Akt比值明顯升高(P<0.05),并具有時間依賴性;而加入LY294002共同刺激24 h后,p-Akt/Akt比值明顯下降(P<0.05),LY294002明顯抑制Akt的磷酸化,見圖3。

A:Akt及p-Akt蛋白表達變化;B:p-Akt/Akt比值比較;氯化鋰濃度:1 mmol/L;a:P<0.05,與0 h比較;b:P<0.05,與1 mmol/L氯化鋰刺激24 h比較。

3 討 論

DPSCs成牙本質向分化對于牙髓損傷修復和牙齒再生,甚至組織再生都起著至關重要的作用,其機制研究一直是牙髓生物學領域的熱點研究問題。氯化鋰是美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的可通過阻止β-catenin磷酸化激活Wnt/β-catenin通路的藥物[12]。研究發現,氯化鋰可通過抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β,GSK-3β)而激活Wnt/β-catenin通路促進骨形成[13]。體內研究也發現,氯化鋰可促進骨質疏松大鼠的骨再生[14]。此外,氯化鋰可明顯降低正畸治療導致的牙根吸收[15],促進成牙骨質細胞增殖及牙周膜干細胞分化[4-6]。本研究結果發現,1 mmol/L氯化鋰刺激DPSCs可明顯促進礦化結節的形成,而10 mmol/L氯化鋰刺激后礦化結節明顯減少。進一步通過RT-qPCR檢測發現,1 mmol/L氯化鋰刺激DPSCs后成牙本質標志基因DSPP、DMP1、BSP及ALP mRNA表達明顯上調。以上結果提示,低濃度氯化鋰可促進DPSCs成牙本質向分化。

間充質干細胞的分化是一個非常復雜的過程,涉及大量的信號通路、細胞因子和轉錄因子的調控。其中,Wnt和PI3K/Akt信號通路對干細胞分化過程的調控發揮著重要作用。在典型的Wnt通路中,β-catenin作為關鍵的轉錄輔激活因子,將細胞外信號傳遞到細胞核內,從而激活靶基因的表達[16]。如GSK-3β失活可導致β-catenin在細胞質大量聚集而轉位至細胞核,從而作用于下游的靶基因如Runx2和過氧化物酶增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)基因,繼而調控干細胞成骨或成脂向分化[16-18]。在間充質干細胞則主要通過抑制GSK-3β活化而激活β-catenin,最終促進成骨分化,抑制成脂向分化[19]。體內或體外實驗發現,間充質干細胞內β-catenin失活導致成骨分化能力下降[20-21]。由此可見,β-catenin激活有利于間充質干細胞成骨向分化,本研究結果低濃度氯化鋰促進DPSCs成牙本質向分化與大部分研究報道一致。Wnt信號在骨再生中的重要作用已經得到了很好的研究[22-23]。有研究發現,Wnt和PI3K/Akt信號轉導通路可促進成骨細胞增殖,抑制破骨細胞分化[24-25]。也有報道指出,Wnt蛋白可通過激活Src/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和PI3K/Akt信號級聯來延長成骨細胞和成骨祖細胞的存活時間[26]。然而,PI3K/Akt是否通過與Wnt/β-catenin通路的相互作用促進牙本質再生仍未知。本研究發現,PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002明顯減弱了氯化鋰誘導的DPSCs礦化結節形成和DSPP、DMP1、ALP礦化基因表達水平。由此可見,PI3K/Akt信號通路可能參與氯化鋰誘導的DPSCs成牙本質向分化的調控。此外,本研究進一步發現氯化鋰能夠明顯促進Akt的磷酸化,并具有時間依賴性,而LY294002可明顯抑制氯化鋰刺激導致的Akt磷酸化,證明PI3K/Akt信號通路確實參與調控氯化鋰刺激的DPSCs成牙本質向分化過程。

綜上所述,本研究發現低濃度氯化鋰(1 mmol/L)可明顯促進DPSCs成牙本質向分化,PI3K/Akt信號通路在此過程中可能發揮著重要調控作用。針對這些信號通路的研究將為齲源性感染的治療提供新的靶點。氯化鋰也可能用作具有生物活性的下一代活髓保存劑,但尚需進一步的研究。