血液輻照對(duì)懸浮紅細(xì)胞中紅細(xì)胞微粒釋放及創(chuàng)傷患者深靜脈血栓形成的影響*

武麗芳,陸 華,許桂平△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.輸血科,重慶 400010)

紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)在保存過程中會(huì)發(fā)生儲(chǔ)存損傷,其主要表現(xiàn)在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)先升高后降低、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)下降、S-亞硝基血紅蛋白(SNO-Hb)下降、乳酸增加與pH值降低、結(jié)合珠蛋白下降、K+濃度增加、生物活性分子堆積(如細(xì)胞因子、組胺等)、RBC形態(tài)球形棘狀改變、磷脂酰絲氨酸外翻等[1-3]。此外,在RBC保存過程中,其細(xì)胞膜可向細(xì)胞外釋放大小為0.1～1.0 μm的囊泡,這些囊泡稱為紅細(xì)胞微粒(red blood cell-derived microparticles,RMP),RMP數(shù)量隨著RBC保存時(shí)間延長(zhǎng)而增加[4]。目前研究發(fā)現(xiàn),Ca2+升高、ATP缺失、K+升高、GPCR等信號(hào)通路的激活是促進(jìn)RMP產(chǎn)生的重要因素[4-6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RMP具有促進(jìn)凝血、促進(jìn)炎性反應(yīng)、加速一氧化氮清除、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附等功能[6]。由于RMP功能的多樣性,RMP被認(rèn)為與地中海貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥等血栓并發(fā)癥有關(guān)[7],也可能是輸血后血栓并發(fā)癥的主要因素[8]。

血液輻照(通常為γ射線)可以減滅淋巴細(xì)胞的免疫活性,輻照后的血液多用于器官移植患者,達(dá)到預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主病的目的[9]。γ射線直接使淋巴細(xì)胞核DNA變性,使其停止增殖,但也會(huì)損傷其他細(xì)胞。有研究報(bào)道,當(dāng)受到輻照時(shí),RBC脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜受損、血漿K+升高、乳酸脫氫酶和血紅蛋白濃度升高、細(xì)胞彈性和變形能力降低[10-11]。由于K+是RMP產(chǎn)生的重要原因之一,所以懸浮紅細(xì)胞(suspended red blood cells,SRBC)經(jīng)輻照后RMP含量有可能會(huì)增加。在臨床使用過程中,富余的輻照SRBC也常用于其他非移植患者。鑒于RMP的促凝血功能及其與輸血后血栓形成的關(guān)系[6,12],因此將輻照SRBC輸注給非移植患者,尤其是好發(fā)深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)的創(chuàng)傷患者[13],可能會(huì)增加其DVT的發(fā)生率。本研究旨在探討血液輻照后SRBC中RMP的變化特點(diǎn),分析輻照SRBC輸血與創(chuàng)傷患者DVT形成之間的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1獻(xiàn)血員資料

收集2022年本院輸血科獻(xiàn)血員未輻照SRBC和輻照SRBC血辮各105例,輻照由重慶市血液中心采用德國(guó)Biobeam GM8000輻照儀25 Gy γ射線照射10 min。按保存時(shí)間分成3、7、14、21、28、35、42 d共7組,取血辮血液1.5 mL經(jīng)1 550 g×5 min離心,留取上層血漿于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2創(chuàng)傷患者資料

收集2018年1月至2023年4月本院急救部297例創(chuàng)傷患者,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)主要診斷為骨折、多發(fā)傷、高墜傷、擠壓傷、摔傷;(2)行動(dòng)受限,需要臥床治療;(3)住院超過3 d。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前已臥床超過3 d;(2)入院前使用雌激素治療;(3)合并腫瘤;(4) 合并炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等靜脈血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)增加的疾病;(5)入院時(shí)已有DVT;(6)拒絕簽訂知情同意書。其中未輸血患者148例(未輸血組),入院至確診DVT之間有SRBC輸血的患者149例(RBC輸血組),其中未輻照SRBC輸血的患者76例(未輻照組),含有輻照SRBC輸血的患者73例(輻照組),對(duì)患者年齡、性別、創(chuàng)傷類型、是否長(zhǎng)骨骨折、是否脊髓損傷、入院時(shí)(血壓、心率、體溫、Hb)、住院時(shí)間、住院期間死亡率、SRBC總輸血量(入院至確診DVT期間)、RBC儲(chǔ)存時(shí)間、DVT發(fā)生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。DVT診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]:患肢出現(xiàn)脹痛、壓痛、皮膚呈暗紅色、淺表靜脈怒張等癥狀,經(jīng)血管超聲或造影確診存在DVT(管腔內(nèi)探及實(shí)性回聲,充盈缺損,管腔不能完全壓閉,非期相性血流,連續(xù)探測(cè)血管腔、管徑)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2020年科倫審第(178)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RMP

取5管ABO、RhD均同型且儲(chǔ)存時(shí)間相同的凍存標(biāo)本,經(jīng)冰上緩慢解凍后取1 mL離心20 000 g×90 min沉淀RMP,棄掉上層900 μL,留取底部包含紅色沉淀液體100 μL。5個(gè)標(biāo)本混合后再加入1 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)混勻,20 000 g×90 min洗滌1次,留取底部100 μL制成RMP懸液。取1 mL健康體檢者新鮮全血用2 mL PBS 1 000 g×2 min洗滌2次,重懸至總體積1 mL。30 μL標(biāo)本中加入265 μL PBS和5 μL熒光抗體,抗體異硫氰酸熒光素(fluoresce in isothiocyante,FITC) anti-235a(559943)、PE膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ,560930)、FITC鼠IgG2b(556655)和Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液(556454)均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司,1.0～1.4 μm 質(zhì)控微球(Beads)(FH-1056-2)購(gòu)自美國(guó)Spherotech公司,混勻后暗室孵育15 min,1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)(CytoFLEX流式分析儀,美國(guó)Beckmancoulter公司)。檢測(cè)速度10 μL/min,連續(xù)記數(shù)1 min。取儲(chǔ)存時(shí)間相同的3個(gè)富集標(biāo)本的平均值作為最終結(jié)果。

1.2.2血漿電解質(zhì)測(cè)定

血辮血液1.5 mL經(jīng)1 550 g×5 min離心,留取上層血漿,用美國(guó)Beckmancoulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)K+、Na+、Cl-的濃度,取儲(chǔ)存時(shí)間相同的3個(gè)不同標(biāo)本的平均值作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RMP的分離鑒定

采用流式細(xì)胞術(shù)通過顆粒的大小和形態(tài)區(qū)分RBC和RMP顆粒群。紅細(xì)胞群比Beads直徑大,且96.8%表達(dá)紅細(xì)胞系標(biāo)志物CD235a,4.7%表達(dá)膜損傷標(biāo)志物Annexin Ⅴ。而RMP群比Beads直徑小,且97.4%表達(dá)紅細(xì)胞系標(biāo)志物CD235a,98.1%表達(dá)膜損傷標(biāo)志物Annexin Ⅴ(圖1)。無(wú)論是顆粒大小還是表面標(biāo)志物表達(dá)特點(diǎn)均符合RMP的特征,說(shuō)明通過流式細(xì)胞術(shù)分離的這群較小顆粒屬于RMP。

A:根據(jù)大小和形態(tài)區(qū)分三個(gè)顆粒群的門;B、C:分別為RBC群細(xì)胞膜表面CD235a、Annexin Ⅴ的表達(dá)水平;D、E:分別為RMP群膜表面CD235a、Annexin Ⅴ的表達(dá)水平。

2.2 輻照對(duì)SRBC血辮中RMP釋放的影響

在所有相同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn),輻照SRBC的RMP均明顯高于未輻照SRBC(P<0.01),見表1。

表1 不同儲(chǔ)存時(shí)間SRBC血辮血液中RMP數(shù)量個(gè)/μL)

2.3 輻照對(duì)SRBC血辮中其他電解質(zhì)的影響

無(wú)論是否輻照,隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng),SRBC血辮中的Cl-含量沒有明顯的變化(P>0.05),Na+含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而降低,且輻照SRBC血辮中的Na+含量略低于未輻照SRBC(除28 d外)。SRBC血辮中的K+含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而升高,第28天達(dá)峰后略有下降;與未輻照SRBC血辮相比,除了第28天和35天,每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)輻照SRBC血辮中的K+含量更高(P<0.05),見表2。

表2 輻照前后SRBC血辮血液中部分電解質(zhì)隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化

2.4 輻照SRBC輸注對(duì)創(chuàng)傷患者DVT形成的影響

RBC輸血組(45/149,30.2%)比未輸血組(17/148,11.5%)的DVT發(fā)生率更高(P<0.001),同時(shí)也有更高的長(zhǎng)骨骨折率、入院心率、住院時(shí)間、住院死亡率。在RBC輸血組患者中,未輻照組和輻照組的年齡、性別、損傷類型、入院時(shí)基本指標(biāo)、住院時(shí)間、住院死亡率均沒有明顯差異(P>0.05),輻照組的DVT發(fā)生率高于未輻照組(P<0.05)。輻照組中的平均儲(chǔ)存天數(shù)低于未輻照組(P<0.001)。此外輻照組的RBC輸血量明顯高于未輻照組(P<0.001),見表3。

表3 不同輸血組的病例特點(diǎn)及DVT發(fā)生率

為了闡明RBC輸血量、RBC儲(chǔ)存時(shí)間、輻照SRBC輸血等與DVT發(fā)生的關(guān)系,進(jìn)一步進(jìn)行多因素邏輯回歸分析,結(jié)果顯示:輻照SRBC輸血是DVT的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=2.16,P<0.05),而且DVT發(fā)生率隨著所輸注輻照SRBC的含量增加而升高,含量超過50%時(shí)有顯著差異(P<0.05),見圖2。

A:對(duì)RBC輸血組DVT發(fā)生率進(jìn)行多因素邏輯回歸分析;B:總輸入RBC含量輻照SRBC與DVT發(fā)生率的關(guān)系;a:P<0.05,與輻照SRBC含量為0比較。

3 討 論

1933年AUER首次報(bào)道RBC產(chǎn)生絲狀物的現(xiàn)象,20世紀(jì)70年代人們分離了RBC產(chǎn)生的微粒,并描述了其特點(diǎn),至此拉開了RMP研究的帷幕[15]。研究表明,健康人外周血RMP約為8.5×108個(gè)/L,其生成速度約為RBC生成速度的8 120倍。儲(chǔ)存過程中RMP隨儲(chǔ)存時(shí)間逐漸增多,保存20 d以后,RMP產(chǎn)生速度會(huì)逐漸加快[5]。由于γ射線在滅活淋巴細(xì)胞的同時(shí)也加速紅細(xì)胞K+滲漏[16],而K+升高是RMP產(chǎn)生的原因之一,因此推測(cè)輻照可能通過K+變化引起RMP釋放加快。本研究檢測(cè)了輻照前后SRBC中的RMP含量,發(fā)現(xiàn)輻照SRBC比相同儲(chǔ)存時(shí)間未輻照SRBC中的RMP含量更高,且SRBC中的RMP隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而增加。進(jìn)一步檢測(cè)輻照SRBC中的電解質(zhì),輻照后K+在短時(shí)間內(nèi)迅速升高,與其他研究報(bào)道相似[16]。推測(cè)K+可能是促進(jìn)RMP釋放的重要原因之一。

研究發(fā)現(xiàn),RMP會(huì)以組織因子依賴的方式增強(qiáng)體內(nèi)凝血過程,也可促進(jìn)蛋白C系統(tǒng)的抗凝反應(yīng),具有廣泛的止血活性,在自發(fā)性高血壓大鼠中注射RMP可以控制其顱內(nèi)出血的程度[17]。RMP也可以作為止血?jiǎng)┮种苹颊吆痛笫箫B內(nèi)血腫的形成[18-19]。此外,RMP可以調(diào)節(jié)免疫和抑制一氧化氮引起的血管舒張功能[20-21]。由于SRBC保存過程中RMP的增加及RMP的促凝血活性,一些研究認(rèn)為RMP與輸血后某些不良反應(yīng)有關(guān)。RMP既可以通過結(jié)合大量補(bǔ)體和免疫球蛋白活化白細(xì)胞,進(jìn)而可能誘發(fā)輸血相關(guān)性急性肺損傷,也可以與大多數(shù)CD40L相結(jié)合,進(jìn)而活化PMC氧化酶,引起肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷[22]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷患者輸注儲(chǔ)存時(shí)間更長(zhǎng)的RBC,DVT發(fā)生率更高,說(shuō)明RBC儲(chǔ)存損傷確實(shí)與DVT的發(fā)生有關(guān),而RMP可能在DVT形成過程中發(fā)揮了一定作用[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),RMP可以通過P-選擇素促進(jìn)微血栓的形成[24]。也有研究報(bào)道,向小鼠直接輸入RMP提取物可以引起血液高凝狀態(tài)[25],但RMP與DVT直接的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究在輻照SRBC中檢測(cè)到RMP升高,輻照SRBC輸血者DVT發(fā)生率較高,但RMP與DVT的關(guān)系尚需體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證,RMP在創(chuàng)傷患者DVT形成中的作用和機(jī)制也需進(jìn)一步研究。受限于更早時(shí)間的數(shù)據(jù)缺失及創(chuàng)傷患者使用輻照SRBC次數(shù)不多,統(tǒng)計(jì)的病例有限,因此下一步將納入更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

綜上所述,隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng),輻照SRBC中RMP和K+含量會(huì)逐漸升高,K+可能是促進(jìn)RMP釋放的因素之一。此外輻照SRBC輸血是創(chuàng)傷患者發(fā)生DVT的風(fēng)險(xiǎn)因素之一,應(yīng)嚴(yán)格把控輻照SRBC的輸血適應(yīng)證。