TNF-α和TGF-β1在胚胎停育患者蛻膜組織中的表達*

崔 莉,劉 杰,鄒 歌,王怡佳,陳 燕,董建新

(華北理工大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北唐山 063000)

胚胎停育指妊娠早期胚胎因各種原因停止發(fā)育,滯留于宮腔內(nèi)未自然排出的一種病理性妊娠[1]。造成胚胎停育的病因機制復雜多樣,不僅與子宮解剖結構、外在環(huán)境、內(nèi)分泌失調(diào)等有關,還可能受飲食或生活習慣的影響,但目前仍然有約50%的胚胎停育患者尚未明確發(fā)病原因[2]。近年來研究表明,胚胎停育可能與滋養(yǎng)細胞侵入異常、胎盤形成過程中絨毛血管異常、胚胎滋養(yǎng)細胞凋亡異常及免疫調(diào)節(jié)異常等因素有關[3]。有學者發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種重要的炎性細胞因子,能夠通過控制滋養(yǎng)細胞的生長來影響胚胎的增殖、生長和發(fā)育。此外,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)作為一種具有多功能的細胞因子,可以調(diào)節(jié)免疫應答、介導炎癥發(fā)生,并調(diào)控細胞增殖和分化,參與胚胎的生長發(fā)育。本研究通過分析TNF-α、TGF-β1及其mRNA在孕早期胚胎停育患者及正常妊娠孕婦蛻膜組織中的表達,探討二者對于胚胎停育的影響,給孕早期胚胎停育的診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年11月至2021年10月就診于該院婦產(chǎn)科門診并經(jīng)B超確診的40例早期胚胎停育患者為觀察組,另選取40例同期正常妊娠并自愿要求人工流產(chǎn)的孕婦為對照組。兩組均停經(jīng)12周以內(nèi),無生殖系統(tǒng)感染或自身免疫性疾病。兩組年齡、BMI、血小板計數(shù)、血紅蛋白、白細胞計數(shù)、流產(chǎn)史、吸煙史、既往慢性病史等均無明顯差異(P>0.05),兩組既往胚胎停育史有明顯差異(P<0.05),見表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(202112070028),患者均知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1標本的收集與儲存

在人工流產(chǎn)期間分別收集兩組患者的蛻膜組織,無菌生理鹽水多次清洗后,放入凍存管于液氮中凍存。

1.2.2免疫組織化學法檢測蛻膜組織TNF-α和TGF-β1的表達

取蛻膜組織用4%多聚甲醛組織固定液,梯度乙醇脫水,石蠟包埋切片;將切片脫蠟水化,檸檬酸鹽修復液(pH 6.0)高壓煮沸后放入切片,加熱2 min進行抗原修復,蒸餾水和磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后,用3%過氧化氫(H2O2)去離子水進行封閉,室溫放置15 min;滴加TGF-β1抗體及TNF-α單克隆抗體(一抗,北京中衫金橋有限公司),放入4 ℃冰箱過夜,次日復溫,PBS沖洗3次后加入山羊抗兔IgG抗體(二抗),室溫孵育30 min后PBS沖洗5 min,重復3次;經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色3～5 min,蘇木素復染、沖洗;脫水、透明、封片。光學顯微鏡[蔡司科技(蘇州)有限公司]下觀察分析。細胞染色程度評分:無色計0分,淺黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分;陽性細胞比例評分:0～5%計0分,>5%～25%計1分,>25%～50%計2分,>50%～75%計3分,>75%計4分。細胞染色程度評分及陽性細胞比例評分相乘為最終得分,最終判定標準:0分代表陰性(-),1～4分代表弱陽性(+),5～8分代表中度陽性(++),9～12分代表強陽性(+++)。總陽性表達率=弱陽性+中度陽性+強陽性/總例數(shù)×100%。

1.2.3實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)法檢測蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA的表達

將待測蛻膜組織倒入液氮研磨至粉狀,加入1 mL TRIzol裂解液充分混勻,振蕩后靜置 5～10 min;加入0.2 mL氯仿,室溫靜置3 min;4 ℃、12 000 r/min離心15 min;取上清液加入等體積異丙醇,搖勻靜置10 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min;棄上清液,加1 mL提前預冷好的無水乙醇進行沉淀,再次混勻;4 ℃、12 000 r/min離心5 min,棄上清液待用;加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA,采用紫外分光光度計(德國Eppendorf公司)測量260和280 nm處吸光度值,測量RNA溶液濃度;使用TIANS cript RT試劑盒(北京天根生物科技有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈;使用SYBR Green試劑盒(北京天根生物科技有限公司)在熒光定量 PCR 儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司]上進行實時熒光定量PCR,引物如下:TNF-α正向為5′-CAC AGT GAA GTG CTG GCA AC-3′,反向為5′-GAT CAA AGC TGT AGG CCC CA-3′;TGF-β1正向為5′-CAC CTT GGG CAC TGT TGA AGT-3′,反向為5′-TCC CTG CAT CTC AGA GTG TTG-3′;3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正向為5′-GAA TGG GCA GCC GTT AGG AA-3′,反向為5′-ATC ACC CGG AGG AGA AAT CG-3′。反應程序:95 ℃預變性15 min;95 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法測定目的基因的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1的表達

TNF-α和TGF-β1在兩組蛻膜組織中均有陽性表達,主要分布在滋養(yǎng)細胞的細胞膜或細胞質(zhì)中,呈現(xiàn)棕黃色顆粒。TNF-α在觀察組蛻膜組織呈強陽性表達,在對照組蛻膜組織呈弱陽性表達,見圖1A、B;TGF-β1在觀察組蛻膜組織呈弱陽性表達,在對照組蛻膜組織呈強陽性表達,見圖1C、D。觀察組TNF-α總陽性表達率為80.0%(32/40),對照組為47.5%(19/40);觀察組TGF-β1總陽性表達率為52.5%(21/40),對照組為75.0%(30/40);兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1表達情況比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

A、B:分別為觀察組、對照組蛻膜組織TNF-α的表達;C、D:分別為觀察組、對照組蛻膜組織TGF-β1的表達。

表2 兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1表達情況比較(n)

2.2 兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA表達水平比較

觀察組TNF-α mRNA相對表達水平高于對照組,TGF-β1 mRNA相對表達水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA相對表達水平比較

2.3 蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA表達水平與胚胎停育的關系

采用兩組蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA相對表達水平的均值為臨界值(TNF-α、TGF-β1 mRNA分別為3.59、0.81),高于臨界值為高表達水平,低于臨界值為低表達水平,進一步分析TNF-α和TGF-β1表達與胚胎停育之間的關系,結果提示:蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA相對表達水平均與胚胎停育的發(fā)生有關(P<0.05),見表4。

表4 蛻膜組織TNF-α和TGF-β1 mRNA相對表達水平與胚胎停育的關系(n)

3 討 論

為了保證妊娠過程的順利,母體與胚胎之間需協(xié)調(diào)一致[4]。在正常妊娠過程中,滋養(yǎng)細胞通過入侵并著床子宮內(nèi)膜及肌層,侵入母體血管,促進胎盤錨定,形成生理性子宮血管重鑄,為胚胎發(fā)育提供需求[5-6],期間滋養(yǎng)細胞會有一定程度的凋亡,若凋亡過度,會影響胚胎植入、著床及生長,從而導致流產(chǎn)[7]。此外,妊娠是一種獨特的半同種移植過程[8],正常狀態(tài)下胚胎在母體中生長發(fā)育不受排斥,但若母胎界面免疫耐受失衡則會導致胚胎停育的發(fā)生。

TNF-α是一種由巨噬細胞生成并且具有多種生物學功能的細胞因子,可參與機體免疫調(diào)節(jié)、體內(nèi)雌孕激素調(diào)節(jié)、炎癥反應及器官生成等,對腫瘤與病毒感染具有抑制作用[9-10],并在女性胚胎植入過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,適量的TNF-α可以促進滋養(yǎng)細胞的正常增殖、分化及凋亡,改善孕婦的能量代謝,維持妊娠[11-12]。胚胎對于母體而言相當于同種異源物質(zhì),在著床過程中,由于輔助性T淋巴細胞(Th)1/Th2細胞免疫調(diào)節(jié)的存在,母體對胚胎不會產(chǎn)生排斥。Th1/Th2在胚胎發(fā)育過程中起到關鍵作用,具體表現(xiàn)為早期妊娠排斥與耐受的平衡。Th1主要分泌TNF-α、白細胞介素(IL)-2等細胞因子,介導細胞免疫反應,產(chǎn)生胚胎排斥作用;Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6等細胞因子,介導體液免疫反應,形成母-胎免疫耐受,保護胎兒不被母體攻擊[13-14]。妊娠的良好結局依賴于Th1和Th2的功能平衡,其失衡可能導致妊娠結局改變[15-16]。據(jù)王麗麗等[17]研究表明,自然流產(chǎn)患者蛻膜組織TNF-α表達水平高于正常妊娠并要求人工流產(chǎn)者,可能是由于TNF-α表達升高,Th1/Th2平衡被打破,偏向Th1,產(chǎn)生胚胎排斥作用引發(fā)不良妊娠結局。鄭玫等[18]研究發(fā)現(xiàn),稽留流產(chǎn)患者血清TNF-α表達水平高于正常早孕婦女,考慮TNF-α表達升高時破壞了Th1/Th2平衡,誘發(fā)免疫過度,從而導致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。本研究結果發(fā)現(xiàn),兩組蛻膜組織滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中均可見TNF-α陽性表達,且觀察組蛻膜組織TNF-α陽性表達程度、TNF-α mRNA相對表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)。分析TNF-α過表達激發(fā)Th1型免疫反應,引起母體對胚胎的免疫反應,產(chǎn)生不利于妊娠的因素,破壞母體與胚胎的內(nèi)平衡,從而導致胚胎停育的發(fā)生。此外,TNF-α還能促進炎癥血栓形成,導致胚胎植入過程障礙,從而產(chǎn)生胚胎停育。總之,TNF-α表達升高可能破壞母體免疫耐受的建立,使胚胎植入過程受到影響,從而導致胚胎停育。

TGF-β1作為一種多功能的細胞因子,可以通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化、滋養(yǎng)細胞侵入和黏附、母胎免疫耐受的建立等過程,參與妊娠早期胚胎細胞增殖、生長及發(fā)育[19-21]。有學者發(fā)現(xiàn),E-鈣黏連蛋白(E-cadherin,E-Cad)可出現(xiàn)在蛻膜上皮細胞及絨毛滋養(yǎng)細胞中[22],E-Cad能夠維持細胞系統(tǒng)穩(wěn)定,參與細胞的分化與侵襲[23]。當E-Cad異常表達可降低子宮內(nèi)膜容受性,改變滋養(yǎng)細胞的入侵深度和黏附度,影響胚胎著床,從而影響胚胎的發(fā)育過程[24-25]。王冬亮等[26]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1主要通過TGF-β/Smads信號傳導通路下調(diào)E-Cad表達,當TGF-β1水平下調(diào)時,E-Cad 表達水平升高,胚胎著床失敗,從而導致胚胎停育的發(fā)生。子宮內(nèi)膜完成蛻膜化是胚胎成功植入的必要條件,在此過程中還需要多種細胞因子參加。TGF-β1表達升高可以增強蛻膜基質(zhì)細胞趨化因子和配體的表達,改變子宮內(nèi)膜容受性,有利于子宮內(nèi)膜完成蛻膜化[27]。在本研究中,TGF-β1在早期胚胎停育患者蛻膜組織中的表達水平較低,而在早期正常妊娠孕婦蛻膜組織中表達水平較高。這可能是由于TGF-β1作為其家族中免疫性最強的一種因子,能夠調(diào)節(jié)母胎免疫平衡,使胎兒不被母體的免疫系統(tǒng)攻擊。當TGF-β1表達降低時,免疫調(diào)節(jié)功能失衡,免疫耐受建立受阻,從而使母體排斥胚胎,最終導致胚胎停育。

綜上所述,TNF-α和TGF-β1在維持胚胎發(fā)育的過程中起著重要作用,當TNF-α表達高于正常水平或TGF-β1 表達低于正常水平,可能導致母胎免疫耐受失調(diào),從而導致胚胎停育。TNF-α和TGF-β1的測定可能為早期胚胎停育的預測和治療提供臨床依據(jù)。但由于胚胎停育的病因和發(fā)病機制復雜,還需要進一步研究。