辣木葉通過NF-κB 通路介導血管性癡呆小鼠mTOR、Cdc42的表達對學習記憶功能及海馬神經元的保護機制

劉媛媛 孫楊 李超 尹帥 隋月林 張海峰 劉冀

(1滄州醫學高等專科學校解剖教研室,河北 滄州 061001;2河北省滄州中西醫結合醫院)

血管性癡呆(VD)是全球第二大最常見的癡呆形式,是由腦血管疾病引起,患者往往表現出高級認知能力的嚴重損害〔1〕。氧化應激反應是引起VD患者海馬神經元凋亡損害學習、記憶功能的重要病理基礎,核因子(NF)-κB 作為一種關鍵性因子,在細胞受到氧化應激等信號刺激后被活化〔2〕。研究報道在大鼠腦缺血模型中,海馬NF-κB表達升高,進而誘導過量興奮性氨基酸,導致神經元損傷,同時釋放氧化自由基、一氧化氮,引起細胞的毒性損害〔3〕。因此抗氧化也是治療VD的主要策略。作為一種天然藥物,辣木葉具多種生物學活性,包括抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗缺血、抗瘧原蟲等〔4〕。研究顯示辣木葉可體外保護牛乳腺上皮細胞免受過氧化氫誘導的氧化應激損傷〔5〕。也有研究發現辣木葉提取物能夠減輕同型半胱氨酸誘導的阿爾茨海默病動物模型的神經損傷,緩解認知障礙〔6〕。但辣木葉對VD的作用尚不明確。本研究基于氧化應激反應分析辣木葉對改善VD小鼠學習記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級雄性BALB/c小鼠,6～8周齡,體質量(20±2) g(河北醫科大學實驗動物中心,合格證為:醫動字第04057號)。水迷宮購于上海新軟信息技術有限公司。蘇木素-伊紅(HE)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于碧云天公司。Trizol試劑購于Aidlab公司。RNAspin Mini試劑盒購于GE Healthcare公司。BestarTMqPCR試劑盒購于DBI Bioscience公司。抗體購于Abcam公司。聚偏二氟乙烯膜購于EMD Millipore。化學發光法顯色試劑盒購于Thermo Fisher公司。顯微鏡購于Carl Zeiss公司。

1.2動物分組、建模和干預 參照Himori法制備VD小鼠模型〔7〕,通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉(濃度為20 g/L,劑量為2 ml/kg)麻醉小鼠,麻醉完成后將小鼠仰臥固定,將頸部毛發剔除后切開暴露雙側頸動脈,利用栓線阻斷雙側頸總動脈10 min,然后再灌注24 h。通過水迷宮實驗檢測目標象限停留時間<20 s且穿越平臺次數<4次為建模成功。將建模成功的120只小鼠隨機分為VD組,辣木葉低、中、高劑量組,每組30只。根據參考文獻〔8〕制備辣木葉提取液并灌胃,劑量分別為100、200、400 mg/kg,1次/d,連續28 d。另取30只健康BALB/c小鼠作為對照組,對照組僅暴露雙側頸動脈。對照組及VD組每日使用等體積雙蒸水灌胃。

1.3水迷宮實驗 用水注滿水迷宮,水迷宮溫度維持在(25±1)℃。平臺浸入水下1 cm。定位導航:各組置于水迷宮四象限,觀察90 s內是否登上平臺。頻率為4次/d,每次間隔時間>2 min。探索:各組小鼠置于同一個象限中,觀察90 s內靠墻運動軌跡,并記錄各組平臺停留時間、穿越平臺次數。

1.4HE染色 固定海馬神經元組織,時間48 h,流水進行沖洗。使用多濃度乙醇脫水,使海馬神經元浸入石蠟中,切片,厚度為4～7 μm。脫蠟、水化、HE染色。蘇木素細胞核染色5 min,伊紅細胞質染色1～2 min。光學顯微鏡(ECLIPSE Ni,Nikon USA)下觀察。

1.5ELISA ELISA檢測氧化應激指標,包括血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛 (MDA)。研磨海馬組織4 ℃ 2 000 r/min離心20 min后取上清,抗體孵育2 h,加入顯色劑,時間10 min。450 nm下測定吸光度。

1.6RT-qPCR 提取總RNA,逆轉轉錄為cDNA,qPCR實驗使用BestarTMqPCR預混液,RT-qPCR分析使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統。計算mRNA的相對表達量。

1.7Western印跡檢測蛋白 裂解海馬組織,離心,收集總蛋白,分離蛋白質,轉膜,脫脂牛奶封閉2 h。一抗4 ℃孵育24 h,二抗室溫孵育1 h。顯影后計算灰度值。

1.8統計學處理 每個檢測設立3個平行實驗,重復3次。采用SPSS21.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1辣木葉提取液對VD小鼠學習、記憶功能的影響 5組學習記憶能力比較差異顯著(P<0.05)。VD組目標象限停留時間和穿越平臺次數顯著低于對照組(P<0.05);辣木葉低劑量組顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著高于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著高于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結果及NF-κB通路蛋白表達比較

2.2辣木葉提取液對VD小鼠海馬組織損傷的影響 對照組海馬神經元清晰,細胞核大而圓,位于細胞中央。VD組海馬神經元表現為核凝聚、空泡化、炎癥細胞浸潤。辣木葉低劑量組核凝聚、空泡化情況較VD組有所減輕。辣木葉中劑量組核凝聚、空泡化情況顯著減少。辣木葉高劑量組海馬組織神經元基本恢復,僅有少量空泡化。見圖1。

圖1 HE染色檢測辣木葉提取液對VD小鼠海馬組織損傷的影響(小圖×400,大圖×200)

2.3辣木葉提取液對VD小鼠氧化應激水平的影響 5組海馬組織中SOD和MDA水平差異顯著(P<0.05)。VD組較對照組SOD水平顯著降低,而MDA顯著升高(P<0.05)。辣木葉提取液干預后,3組SOD顯著升高,而MDA顯著降低(P<0.05),其中SOD水平辣木葉高劑量組>辣木葉中劑量組>辣木葉低劑量組;MDA水平辣木葉高劑量組<辣木葉中劑量組<辣木葉低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組氧化應激水平mTOR和Cdc42水平

2.4辣木葉提取液對VD小鼠NF-κB通路的影響 5組NF-κB通路水平比較差異顯著(P<0.05)。VD組的IKK、NF-κB mRNA和蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)。辣木葉低劑量組顯著低于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著低于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著低于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見表1、圖2。

1～5:對照組、VD組、辣木葉低、中、高劑量組

2.5辣木葉提取液對VD小鼠mTOR和Cdc42表達水平的影響 5組mTOR和Cdc42轉錄和翻譯水平比較差異顯著(P<0.05)。VD組的mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)。辣木葉低劑量組顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉中劑量組顯著高于辣木葉低劑量組(P<0.05);辣木葉高劑量組顯著高于辣木葉中劑量組(P<0.05)。見圖2、表2。

3 討 論

缺血-再灌注是誘發VD的主要原因之一,其發病率逐年攀升〔9〕。VD的發病機制涉及膽堿能系統、氧化自由基產生、一氧化氮、興奮性氨基酸等多方面損傷,且與認知功能相關〔10〕。目前關于VD的治療主要通過改善腦循環和腦代謝、腦保護、 抗氧化及增強腦內神經系統功能來實現,但臨床上尚無治療VD的特效藥物。

VD臨床表現包括認知功能障礙、人格改變和記憶功能減退,VD還會增加腦卒中死亡率,延長恢復期,并增加經濟負擔〔11〕。氧化應激是VD的重要機制,研究顯示缺血-再灌注損傷、高齡、吸煙、血壓異常等是VD的主要誘因,而這些損傷均會造成腦組織中氧化-抗氧化失衡,引起SOD降低和MDA升高〔12〕。而氧化應激反應不但會促進炎性反應損害海馬神經元,還會導致神經元凋亡,從而引起神經功能障礙〔13〕。文獻證明,辣木具有抗氧化、提高記憶力、促進神經元存活等作用,在辣木的不同部位中,葉的抗氧化活性最強,研究顯示,辣木葉可通過抗氧化調控細胞的存活和凋亡〔14〕。Adebayo等〔15〕研究結果顯示,辣木葉的生物氧化鋅納米粒子通過調節氧化應激和乙酰膽堿酯酶活性消除魚藤酮誘導的神經內分泌毒性。動物研究結果顯示,長期食用辣木葉補充飲食可促進抗氧化能力、增強大鼠海馬的神經認知并保護神經功能〔16〕,本研究結果提示,辣木葉提取液能夠改善VD小鼠神經功能,促進海馬組織中SOD水平并抑制MDA水平,且隨著辣木葉提取液干預劑量的升高,保護作用更顯著。本研究結果說明,辣木葉提取液能夠顯著改善VD小鼠學習記憶功能,且抑制海馬組織中氧化應激水平。

NF-κB通路與氧化應激和神經元損傷密切相關,一方面NF-κB會調控mTOR表達,進而調控下游SOD、MDA水平,從而調節氧化應激〔17,18〕;另一方面,氧化應激會激活IKK和NF-κB促進炎性損傷和神經元凋亡,引起海馬體受損〔19〕。mTOR作為信號通路的效應分子,其通過活化后介導下游信號通路,調節細胞生長和增殖〔20〕。Cdc42是質膜相關小GTP酶,調控活性GTP結合狀態和非活性GDP結合狀態之間循環,在活躍狀態下與多種效應蛋白結合以調節細胞反應,研究顯示其是反映海馬體功能的關鍵蛋白,Cdc42降低提示海馬神經元功能受損〔21〕。本研究結果顯示,VD小鼠海馬神經元中NF-κB通路升高,而mTOR、Cdc42水平降低,而辣木葉提取液能夠抑制IKK、NF-κB轉錄和翻譯,促進mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白的表達,且高劑量辣木葉提取液的干預作用更顯著。Abdel-Daim等〔22〕研究表明,辣木葉提取物會通過 NF-κB 信號通路緩解鈷介導的氧化損傷和炎癥保護大鼠腎臟組織。本研究結果提示,辣木葉提取液能夠調控氧化應激反應,抑制NF-κB通路,促進mTOR和Cdc42蛋白表達,從而促進海馬神經元存活并幫助維持神經元功能,從而緩解VD。

綜上,辣木葉可能通過調控VD小鼠氧化應激狀態,抑制NF-κB通路,引起海馬中mTOR、Cdc42表達增加,進而減少細胞凋亡數,保護受損神經元細胞,從而改善學習記憶功能。然而,本研究結果初步得到辣木葉能夠保護VD小鼠神經功能的機制可能與NF-κB通路有關,仍需體內或體外驗證實驗,此外,辣木葉提取液緩解VD的作用和安全性仍需臨床研究。