刻點血蜱成蜱中腸菌群結構的分析

劉龍江，劉瀟雨，程天印，段德勇，吳平順*

(1. 甘肅省迭部縣動物疫病預防控制中心，甘肅 迭部 747400；2. 湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128)

刻點血蜱(Haemaphysalispunctata)屬于硬蜱科、血蜱屬，常寄生于牛、馬、羊等家畜，廣泛分布于英國、美國、西班牙、意大利、以色列等國[1]，在我國其主要分布于新疆地區[2]。已有研究表明，刻點血蜱可傳播大巴貝斯蟲(Babesiamajor)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、伯納特氏立克次氏體(Rickettsiaburneti)、斑點熱群立克次體(Spotted fever group rickettsiae)、羊泰勒蟲(Theileriasp.)等病原體[2-3]。由于雌、雄蜱生活習性、生活周期、吸血特性的不同，常導致由致病菌、共生菌組成的蜱菌群結構表現不同[4]，如Choubdar等[5]證實小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)雌蜱中腸菌群多樣性高于雄蜱；Kim等[6]發現不同性別長角血蜱(H.longicornis)體內的菌群結構存在顯著差異，其雌蜱體內的柯克斯氏體共生菌(Coxiellaendosymbiont)相對豐度高于雄蜱。因此，了解不同性別蜱中腸菌群結構及差異對防控蜱和蜱傳病意義重大。

近年來，隨著高通量測序技術的發展，學者們對不同蜱種的不同發育階段、不同組織器官、不同地域來源、不同飽血狀態中腸菌群結構進行了大量研究[7-10]。Portillo等[11]利用Illumina Miseq高通量測序技術，對來源于西班牙拉里奧哈地區不同性別刻點血蜱的中腸菌群結構進行了研究，發現在雌、雄刻點血蜱中變形菌門(Proteobacteria)為優勢菌門，埃立克體屬(Ehrlichia)為優勢菌屬，宮本疏螺旋體(Borreliamiyamotoi)為優勢菌種，且立克次體屬(Rickettsia)在雌蜱中腸內的相對豐度高于雄蜱，埃立克體屬、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)在雄蜱中腸內的含量高于雌蜱。但有研究證實，地域及宿主不同將影響蜱菌群結構的組成[12-13]。因此，本研究運用Illiumina NovaSeq高通量測序技術對采自于我國新疆地區綿羊體表的不同性別刻點血蜱中腸菌群結構進行分析，探究其特征和差異，為蜱和蜱傳病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

帶Barcode的細菌16S rDNA V3-V4區擴增引物，341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。DNA片段快速純化/回收試劑盒購自Qiagen公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix、NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit均購自New England Biolabs公司。

1.2 刻點血蜱樣本

20只飽血刻點血蜱雌蜱和30只刻點血蜱雄蜱采自于新疆沙灣市綿羊體表，并送至湖南農業大學動物醫學院寄生蟲與媒介中心保存。

1.3 細菌DNA提取

取雌蜱5只、雄蜱10只，75%酒精對蟲體表面進行消毒，無菌水沖洗，去除體表雜質。在超凈工作臺中用滅菌眼科剪沿蜱腹部剪開體壁，將雌蜱、雄蜱中腸內容物分別收集至2個含有1 mL 3.8% 檸檬酸鈉無菌生理鹽水溶液的滅菌離心管中，800 r/min離心10 min；取上清液，12 000 r/min離心1 min；棄去上清液，將雌蜱和雄蜱中腸內容物沉淀物分別編號為Hp.F和Hp.M。按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取各樣品細菌基因組DNA。

1.4 16S rDNA基因擴增及高通量測序

以雌、雄蜱中腸細菌總DNA為模板，以341F和806R為擴增引物擴增細菌16S rDNA V3-V4區。反應體系(50 μL)：DNA模板1 μL，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各2 μL，ddH2O 20 μL。擴增條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將擴增片段經NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit修飾、加測序接頭，并用Qubit@2.0 Fluorometer定量和qPCR檢測合格后，運用Illiumina NovaSeq平臺進行雙末端測序。

1.5 數據處理

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.11, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)軟件[14]對樣本的reads進行拼接，得到Raw Tags。隨后使用fastp軟件對Raw Tags進行質控，得到Clean Tags。最后使用Vsearch軟件將Clean Tags與數據庫進行比對以檢測嵌合體并進行去除[15]，得到Effective Tags。

1.6 擴增子序列變異(ASVs)降噪和物種注釋

對以上得到的Effective Tags，使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進行降噪，并過濾掉豐度小于5的序列[16]，獲得ASVs以及特征表。隨后，使用QIIME2軟件中的classify-sklearn[17-18]模塊將ASVs與數據庫比對，得到每個ASV的物種信息，并分別在不同分類水平上統計2個樣本的群落組成，以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，進行Alpha 多樣性分析。

1.7 Alpha多樣性分析

使用QIIME2軟件計算Observed otus(直觀觀測到的物種數目)，Shannon(樣品中的分類總數及其占比)，Simpson(表征群落內物種分布的多樣性和均勻度)，Chao1(估計群落樣品中包含的物種總數)，Goods coverage(覆蓋度)和Pielou_e(均勻度)指數，并繪制稀釋曲線。

2 結果

2.1 數據處理和ASVs統計

經測序雌蜱樣本(Hp.F)獲得原始序列106 252條，雄蜱樣本(Hp.M)獲得原始序列114 803條。經過質控和去除嵌合體后，Hp.F和Hp.M 2組樣本獲得的有效序列分別為87 395條和98 740條，數據有效率分別達到82.3%和86.1%。將有效序列進行降噪后，Hp.F、Hp.M獲得的ASVs數分別為523和415個，其中219個為2個樣本所共有(圖1)。

圖1 刻點血蜱2個腸內容樣本ASVs分布韋恩圖

2.2 細菌在門水平上的分布

獲得的ASVs 經物種注釋后，在門水平上，Hp.F和Hp.M中共發現11個門，每個細菌門在2組樣品中的相對豐度見表1。從表1中可見，Hp.F與Hp.M中含有的共有菌門為8個，包括：變形菌門，厚壁菌門(Firmicutes)，異常球菌門(Deinococcota)，擬桿菌門(Bacteroid-ota)，放線菌門(Actinobacteriota)，藍細菌門(Cyanobacteria)，脫硫菌門(Desulfobacterota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)，其中變形菌門的相對豐度最高，且在Hp.M內的含量(81.1%)高于Hp.F(65.2%)，為2組樣本的優勢菌門；厚壁菌門、異常球菌門(Deinococcota)、擬桿菌門在Hp.F中的相對豐度(16.9%、10.5%、4.7%)高于Hp.M(13.0%、0.2%、2.3%)；放線菌門在Hp.M中的相對豐度(2.4%)高于Hp.F(1.1%)。除共有菌門外，彎曲菌門(Campilobacter-ota)和螺旋體門(Spirochaetota)為Hp.F特有菌門；梭桿菌門(Fusobacteriota)為Hp.M獨有菌門。

表1 2組樣品在門水平上的物種相對豐度

2.3 細菌在屬水平上的分布

Hp.F和Hp.M 2組樣本共檢測到189個細菌屬，其中共有菌屬為119個，相對豐度前10的共有細菌屬在2組樣本中的分布特點見圖2，前50除前10 之外的其余40種共有細菌屬相對豐度見表2。從圖2可見，2組樣本中相對豐度較高的細菌屬主要為Schlegelella屬，不動桿菌屬(Acinetobacter)，擬桿菌屬(Bacteroides)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，短波單胞菌屬(Brevundimonas)和羅姆布茨菌屬(Romboutsia)等，且以上菌屬在Hp.F中的相對豐度均高于Hp.M。除上述豐度較高的菌屬外，在2組樣本中均檢測到了柯克斯體屬(Coxiella)，立克次體屬(Rickettsia)，寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，泛菌屬(Pantoea)，腸桿菌屬(Enterobacter)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)等相對豐度較低的共生菌和致病菌屬。另外，Hp.F內特有菌屬39種，其中相對豐度較高的菌屬有：八疊球菌屬(Sarcina)，螺桿菌屬(Helicobacter)，RikenellaceaeRC9gutgroup屬，Quinella屬，PrevotellaceaeUCG-003屬和小桿菌屬(Dialister)等；Hp.M內特有菌屬31種，其中相對豐度較高菌屬包括：CAG-352菌屬，巨單胞菌屬(Megamonas)，勞森菌屬(Lawsonia)，細桿菌屬(Microbacterium)，Rubellimicrobium屬和土地芽胞桿菌屬(Terribacillus)等，這表明雌、雄蜱中腸內菌群結構在屬水平上存在較大差異。

表2 前50中40個共有菌屬(前10除外)的相對豐度

圖2 Hp.F(A)和Hp.M(B)樣品前10共有菌屬的相對豐度

2.4 細菌在種水平上的分布

注釋到種水平且Hp.F和Hp.M 2個樣本中共有的菌種有28個，各菌種相對豐度見表3。相對豐度較高的菌種包括：西爾瓦諾斯亞棲熱菌(Meiothermussilvanus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、柯克斯氏體共生菌(Coxiellaendosymbiont)、腸乳桿菌(Lactobacillusintestinalis)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、巴氏桿菌擬桿菌(B.barnesiae)等。除以上共有菌種外，2個樣本中還分別存在獨有菌種，如雙環瘤胃球菌(Ruminococcusbicirculans)、多氏擬桿菌(B.dorei)、糞便乳桿菌(Lactobacillusfaecis)、Butyricicoccussp.、Paenibacillusdarwinianus、Dialisterinvisus等僅在Hp.F被檢測到；類芽胞桿菌(Paenibacilluspasadenensis)、單形擬桿菌(B.uniformis)、馬葡萄球菌(S.equorum)、普通擬桿菌(B.vulgatus)、糞便擬桿菌(B.stercoris)、產黑素普氏菌(Prevotellamelaninogenica)等僅在Hp.M中被檢測到。

表3 2組樣品在種水平上的物種相對豐度

2.5 Alpha多樣性分析

對Hp.F和Hp.M 2個樣本的Alpha 多樣性指數進行統計，結果表明(表4)：2個樣本的Goods coverage均為1即100%，表明本研究的測序覆蓋率高，測序結果具有高精確性、高有效性和高可信度。Hp.F的Simpson指數和Shannon指數均大于Hp.M，表明雌蜱菌群多樣性大于雄蜱。

表4 樣品的Alpha多樣性分析指數

3 討論

本研究利用Illumina NovaSeq高通量測序技術，對刻點血蜱雌、雄蜱中腸菌群結構進行了分析，發現2組樣本菌群結構之間存在顯著差異，共鑒定到11個細菌門、189個細菌屬、28個細菌種。在門水平上，變形菌門為刻點血蜱雌、雄蜱中腸內的優勢菌門，這與微小扇頭蜱[10]、長角血蜱[19]、褐黃血蜱(H.flava)[20]的研究結果相一致。Portillo等[11]發現雌、雄刻點血蜱在屬水平上存在明顯差異，這與本研究的部分研究結果相一致，如本研究中的立克次體屬在刻點血蜱雌蜱體內的相對豐度遠高于雄蜱。而立克次體屬中諸多菌種作為蜱傳病原，已在不同地域的革蜱屬(Dermacentor)、血蜱屬(Haemaphysalis)、硬蜱屬(Ixodes)、扇頭蜱屬(Rhipicephalus)、璃眼蜱屬(Hyalomma)等蜱中被相繼檢測到[21-22]。本研究中雌、雄刻點血蜱中腸內均檢測到該菌屬，說明不同性別刻點血蜱可攜帶立克次體，但由于高通量測序技術的局限性，未能將該菌屬鑒定到種水平。

不動桿菌屬為革蘭陰性菌，已被正式命名的菌種達38個，其中大部分為非致病菌，常分布于潮濕的土壤和水域中；少部分菌種為條件性致病菌，可導致呼吸系統、泌尿系統、中樞神經系統等的感染[23]。該菌屬已在長角血蜱雌蜱中被檢測到，且為優勢菌屬[24]，這與本研究結果相一致。除此之外，本研究還發現刻點血蜱雌蜱中腸內的不動桿菌屬相對豐度(8.1%)高于雄蜱(1.3%)。有研究表明[25]，不動桿菌廣泛存在于土壤中，其在蜱體內的出現通常是由于蜱長時間暴露于宿主體表所致，這與雌蜱寄生在宿主體表至飽血的時間遠大于雄蜱的生活習性相一致。

鞘氨醇單胞菌屬為好氧型革蘭陰性桿菌，包括103余種菌種，廣泛分布于各種水體、沉積物和土壤中，對重金屬環境的生物修復與多環芳烴的生物降解具有一定作用[26]。少動鞘氨醇單胞菌(S.paucimobilis)是一種條件致病菌，由其污染的水體或土壤可引發社區及醫院內感染，常引起關節炎、骨髓炎、敗血癥及局部化膿性潰瘍等病癥，該菌種已在西方蜜蜂(Apismellifera)體內被檢測到[27]。本研究雖未檢測到少動鞘氨醇單胞菌，但發現鞘氨醇單胞菌屬在刻點血蜱雌、雄蜱中腸內均存在，說明刻點血蜱可攜帶該菌屬，這與在微形血蜱(H.wellingtoni)、豪豬血蜱(H.hystricis)、二棘血蜱(H.bispinosa)中的發現相一致[28]。

與Portillo等[11]未檢測到葡萄球菌屬的研究結果不同，本研究在雌、雄刻點血蜱中皆檢測到了葡萄球菌屬，且其在雄蜱中腸內的相對豐度高于雌蜱。葡萄球菌屬中的菌種多為條件性致病菌，是臨床上最常見的革蘭陽性菌，其中金黃色葡萄球菌(S.aureus)是一種能引起肺炎、菌血癥等多種感染性疾病的化膿性病原菌[29]，且已在黃粉蟲(Tenebriomolitor)[30]，黑水虻(Hermetiaillucens)[31]，大蠟螟(Galleriamellonella)[32]等昆蟲體內被檢測到。本試驗檢測出的葡萄球菌為馬葡萄球菌，且該菌種只在刻點血蜱雄蜱中存在，該菌種同樣被報道在微小扇頭蜱(R.microplus)和一些血蜱屬、璃眼蜱屬蜱體內存在[33]。

本研究將刻點血蜱雌、雄蜱中腸內的柯克斯體屬注釋為柯克斯氏體共生菌，且雌蜱中腸內的相對豐度大于雄蜱。柯克斯氏體共生菌已在微小扇頭蜱[34]，Amblyommanuttalli[35]，Ornithodorosmaritimus，邊緣革蜱(D.marginatus)和六角硬蜱(I.hexagonus)[36]等蜱種體內被檢測到。有研究表明[37-38]，蜱在寄生吸血過程中，由于進食條件不平衡，導致其體內缺乏部分必需營養元素，如B族維生素，而柯克斯氏體共生菌正好可為蜱提供 B族維生素，從而促進蜱的生長發育，發揮互利共生的作用。本研究還發現，柯克斯氏體共生菌在刻點血蜱雌蜱中的含量遠高于雄蜱，可能是由于雌蜱生長發育速度較雄蜱快，且與雌蜱在新陳代謝、生理活動時物質消耗量高于雄蜱有關[39]。

綜上，通過對比不同性別刻點血蜱中腸菌群結構，發現其在門、屬、種水平上存在較大差異，這可能與雌、雄蜱吸血及生理特性不同有關。