鴨骨髓源樹突狀細胞的誘導培養及功能分析

李玲，祝博森，朱婷，鐘睿，郭子杰，李睿婷，洪偉鳴，徐海

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300)

自從上世紀70年代Steinman等[1]發現樹突狀細胞(dendritic cell，DC)以來，研究人員對DC及其功能的認知不斷深入，作為機體最重要的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)，DC在啟動獲得性免疫和維持免疫耐受方面發揮重要作用，同時也是連接先天免疫與獲得免疫之間的重要橋梁[2-3]。根據DC的來源、功能及其表面標志物的不同，可分為經典DC、漿細胞樣DC和單核細胞來源DC[4-5]。根據抗原的來源和性質，DC主要通過MHCⅠ、Ⅱ類和交叉提呈途徑對抗原進行加工和遞呈。內源性抗原被DC降解成抗原多肽并裝載于MHCⅠ類分子，提呈給CD8+T細胞，以誘導細胞免疫為主；而外源性抗原通過吞噬、胞飲、受體介導等內吞作用被DC攝取，加工后裝載到MHCⅡ類分子，提呈給CD4+T細胞，主要激發體液免疫[3，6]。

雖然DC在機體內分布較為廣泛，但細胞的實際數量小，且難以與其他類型細胞進行有效地分離純化[7]，因此需要建立體外培養方法來獲得大量高純度的DC，從而便于開展生物學、免疫學以及醫學等領域的研究工作。目前，體外培養哺乳動物DC的技術已相對成熟，鼠源、豬源和人源DC均有成功報道的案例[8-10]。而家禽DC體外培養的報道相對較少，僅見付佳等[11]、張淑君等[12]利用白細胞介素4(IL-4)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)成功誘導培養出雞骨髓源DC。由于缺乏鴨源的誘導因子以及鴨DC表面標志物特異性二抗，制約了鴨DC誘導培養方法的建立及后續鑒定工作的開展。因此，建立鴨DC體外誘導培養方法對進一步研究其生物學功能及鴨其他相關疾病的研究工作均具有重要意義。

本研究嘗試利用鼠源的重組IL-4、GM-CSF作為誘導因子，誘導鴨骨髓源單核細胞向DC定向分化，從而建立鴨骨髓源DC的體外培養方法，并結合形態學觀察、DC表面標志物檢測以及生物學功能測定對制備的DC做進一步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SPF鴨胚購于山東昊泰實驗動物繁育有限公司，本實驗室自行孵化，并飼養至7日齡用于后續試驗。

重組鼠IL-4 (貨號214-14，PeproTech公司)，重組鼠GM-CSF (貨號315-03，PeproTech公司)，PE Anti-CD11c抗體(貨號ab210309，Abcam公司)，FITC Anti-CD86抗體(貨號ab2342237，Abcam公司)，FITC Anti-MHC Ⅱ抗體(貨號ab24882，Abcam公司)，淋巴細胞分離液和配套分離管(天津灝洋公司)，CCK-8溶液(貨號CA1210，Solarbio公司)，RPMI 1640培養液和胎牛血清(美國Gibco公司)，脂多糖(LPS)(貨號L5293，Sigma公司)，鴨白細胞介素2 (IL-2)和鵝γ干擾素 (IFN-γ) (南京森貝伽生物科技有限公司)，mRNA提取試劑盒及分子生物學(大連寶生物公司)。其余試劑均為分析純。

光學倒置顯微鏡(日本尼康公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，ELSIA酶標儀(美國Bio-Rad公司)，臺式離心機(美國Beck-man公司)，熒光定量PCR儀(美國ThermoFisher公司)。

1.2 鴨骨髓細胞的分離培養

翅靜脈注入空氣處死7日齡雛鴨，然后浸泡于75%酒精2～5 min，轉至無菌水中浸泡1 min以去除酒精。在潔凈工作臺內剝離出所有股骨和脛骨，剔除骨頭上粘連的肌肉組織，再浸泡于含2%雙抗的PBS中5 min。剪去骨頭兩端，用無菌PBS反復沖洗出骨髓至平皿中，直至骨髓腔變白。收集骨髓懸液，經200目尼龍網過濾小碎片和肌肉組織。濾過液用PBS洗滌2次并重懸至3 mL，按照等體積比將骨髓細胞緩緩加入預先裝有淋巴細胞分離液的離心管中，1 500 r/min離心25 min，小心吸取中間白霧層細胞至另一離心管中，PBS洗滌2次，用3 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸細胞，臺酚藍染色計數并計算細胞活力。

1.3 DC誘導分化條件的優化

如表1所示，選擇血清、IL-4和GM-CSF這3個因素，每個因素對應2個濃度水平，設計正交試驗，對比A、B、C、D共4個培養組中DC的吞噬能力。用RPMI 1640培養液調整制備的骨髓單核細胞濃度至2×105個/mL，2 mL每孔鋪細胞至6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中持續培養。每隔1 d更換50%的培養液，同時補足工作濃度的IL-4、GM-CSF，并于誘導培養后的第5天加入工作濃度為1 μg/mL的LPS，刺激48 h后收集細胞。誘導培養期間，用光學倒置顯微鏡觀察細胞形態變化并拍照記錄。

表1 細胞培養條件優化

1.4 DC吞噬功能的測定

參照文獻[13]，分別在誘導培養后第1、3、5、7天從4個培養組收集細胞，計數后調整細胞濃度至1×105個/mL，轉移500 μL細胞至12孔細胞板，加入等體積0.1%中性紅生理鹽水溶液，37 ℃孵育2 h，收集細胞并用PBS緩沖液洗滌3次，加入500 μL 1% SDS溶液，室溫作用2 h裂解細胞，取100 μL至ELISA板中，并設置3個重復，測定波長570 nm處吸光值，以OD值表示DC的吞噬能力。

1.5 流式檢測DC表面標志物

采用最佳培養條件，收集培養至第7天的DC，1 000 r/min離心10 min后棄上清液，用PBS緩沖液重懸細胞，并調整細胞濃度至5×105個/mL；調整未經誘導培養的骨髓單核細胞至相同濃度。分別將2種細胞分成4等份，取其中3份分別加入工作濃度的抗CD11c、CD80和MHCⅡ熒光二抗，室溫避光孵育30 min，另1份不做處理用作空白對照。孵育后的細胞用PBS緩沖液洗滌細胞3次(1 000 r/min離心5 min)，最后用200 μL PBS重懸細胞，經流式細胞儀檢測DC表面標志物的表達情況。

1.6 DC培養上清液中細胞含量測定

選擇最佳培養條件，分別在誘導培養第1、3、5、7天細胞中收集200 μL培養配液，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃凍存備用。根據細胞因子檢測試劑盒操作說明書，分別測定DC培養上清液中IL-2和IFN-γ的含量。

1.7 同種異體混合淋巴細胞反應

分離雛鴨外周血淋巴細胞[14]，調整細胞濃度并以每100 μL 1×105個接入96孔板作為應答細胞。誘導培養DC至第5天，將細胞等分成2組，其中1組添加工作濃度的LPS來促進DC成熟，另1組不做任何處理。48 h后分別收集2組DC作為刺激細胞。按照1∶1、1∶5和1∶10的比例混合刺激細胞和應答細胞，置于37 ℃繼續培養48～72 h，每個樣品設置3個重復，并同時設置應答細胞、刺激細胞的對照。培養結束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育4 h，讀取450 nm處吸光值(OD450)。按照公式計算刺激指數(SI)，SI=(試驗組OD450值-刺激細胞對照OD450值)/應答細胞OD450值。

1.8 數據統計和分析

采用SPSS 19.0軟件包對數據進行分析，One-way ANOVA法檢驗差異顯著性，試驗結果以“平均數±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 體外培養鴨骨髓源DC形態觀察

從鴨骨髓中分離的單核細胞經GM-CSF和IL-4誘導后逐漸向DC定向分化。每天于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，結果顯示：剛分離的骨髓單核細胞呈球狀，直徑較小自然沉降于細胞板底部，輕輕晃動即重新懸浮。誘導培養至第3天，部分細胞貼壁、拉伸，可見短小刺突(圖1A)；繼續培養至第5天，大部分細胞貼壁生長，且以菱形結構為主，刺突增多(圖1B)；經LPS刺激后，DC趨于成熟且呈多形性，刺突明顯增多且粗壯(圖1C)。經誘導分化，體外培養的細胞形態上呈現出典型的DC特性，初步說明已成功培養出目的細胞。

A、 B、 C. 分別為誘導培養第3、5和7天的細胞形態。

2.2 不同培養體系中DC吞噬能力的比較

如圖2所示，用15%胎牛血清、20 ng/mL IL-4和40 ng/mL GM-CSF的C組所誘導的DC吞噬能力最強。此外，隨著誘導培養天數的增加，其DC吞噬能力亦相應增強，并在培養后第5天達到高峰；而LPS刺激熟化48 h后的DC，其吞噬能力有所下降。上述吞噬能力的差異，間接說明通過優化誘導培養條件可以提高單位時間內DC的活力和數量，且成熟后的DC吞噬能力較成熟前略有下降。

圖2 不同培養條件的DC吞噬能力比較

2.3 DC表面標志物檢測

分別用抗雞源、鼠源DC表面標志物的熒光抗體標記制備的鴨骨髓源DC，經過流式細胞儀檢測發現，誘導分化至第7天的DC表面標志物的表達量(圖3D、E、F)較起始的骨髓單核細胞(圖3A、B、C)有顯著上調，DC表面標志物CD11c、CD80、MHC Ⅱ的表達量分別為80.08%、81.27%和91.47%。該結果表明成功誘導培養出DC，且具有較高的純度。

2.4 DC分泌細胞因子的含量

根據細胞因子檢測試劑操作說明書，測定不同時間點細胞培養上清液中IL-2和IFN-γ的含量變化。從表2可以看出，隨著培養天數的增加，2種細胞因子的分泌量整體呈上升趨勢，IL-2的含量在第3、5天差異不顯著。培養至第5天的DC經LPS刺激后，在第7天DC分泌細胞因子量顯著上升，IL-2和IFN-γ的含量分別達到(51.28±2.16)和(113.36±8.64)pg/mL，比刺激前提高約2倍。

表2 樹突狀細胞培養上清液中細胞因子含量測定 pg/mL

2.5 DC激活淋巴細胞的能力

DCs作為刺激細胞與淋巴細胞按照不同比例混合培養，從圖4可以看出，DC作為刺激細胞可以刺激淋巴細胞增殖，但LPS刺激成熟后的DC激活淋巴細胞的能力更強。成熟前后的DC與淋巴細胞以1∶5比例混合培養時，其刺激能力較強，SI值分別達到1.3和1.7。

注：*表示P<0.05。

3 討論

現在普遍認為絕大多數的DC發育起源于骨髓造血干細胞，然后在多種細胞因子(GM-CSF、FLT3L)和轉錄因子(PU.1、E2-2、Id2、Batf3、IRF4、IRF8)的共同作用下，骨髓造血干細胞定向分化成髓系和淋巴系DC前體細胞，這些前體細胞進入血液循環，最后在淋巴組織和非淋巴組織中進一步分化成熟[15-16]。在體內，GM-CSF對DC的分化是非必需的，但在體外，該因子可以促進骨髓造血干細胞或單核細胞向DC定向分化，是維持DC發育和分化的最根本的細胞因子[17]。此外，IL-4能夠協同GM-CSF增強細胞集落的生產，刺激細胞增殖并維持DC的成熟狀態，TNF-α可以刺激DC趨于成熟[18]。目前，已經建立的DC體外誘導培養方法都必需有細胞因子的參與。

本試驗中首次采用鼠源GM-CSF和IL-4聯合刺激培養鴨骨髓單核細胞向DC的定向分化。劉迪[19]利用重組人源GM-CSF、IL-4體外誘導培養出雞骨髓源DC，說明異源細胞因子也可以用于DC的誘導培養。為了確保DC體外誘導培養的成功，本試驗針對培養體系中的血清、GM-CSF和IL-4這3個關鍵因素進行正交試驗優化，通過評價不同時間點DC的吞噬能力最終確定最佳培養條件，發現在培養基中添加15%胎牛血清、20 ng/mL的IL-4和40 ng/mL的GM-CSF誘導培養的DC吞噬能力最強。在培養后3 d，可以在顯微下觀察到細胞從球形向菱形的轉變，繼續培養至第7天可以明顯看到典型的樹突狀細胞形態。細胞表面特異性標志物是鑒定細胞的關鍵，本試驗中由于缺乏鴨DC表面標志物的熒光二抗，故選擇抗雞MHCⅡ、抗鼠CD11c和CD80的抗體進行替代，用于流式檢測鴨DC的純度，從結果可以看出，3個抗體均能與鴨表面標志物結合，其CD11c、CD80和MHC Ⅱ的表達量分別達到80.08%、81.27%和91.47%，顯現出較高的純度。綜合DC形態學變化和表面標志物的檢測結果，表明已經在體外成功培養出高品質的鴨骨髓源樹突狀細胞。

有研究表明，未成熟的DC能夠高效地攝取病原體、死亡細胞和其他抗原物質，并對其進行加工處理[20]，此時DC表面的MHCⅠ、Ⅱ類分子，T細胞共刺激因子以及黏附分子的表達量較低[21]；而成熟的DC的抗原攝取能力下降，但MHCⅠ、Ⅱ類分子，共刺激分子和黏附分子等表達量上調，此外還會分泌和表達一些細胞因子和趨化因子來調控T細胞分化[22]。本試驗中用LPS刺激培養至第5天的DC以促進其成熟，成熟后的DC吞噬能力下降，而培養上清液中分泌的IL-2、IFN-γ量顯著增加，并且成熟的DC更能刺激淋巴細胞的增殖。這些試驗結果與上述報道相符，說明制備的細胞具備了樹突狀細胞的基本生物學功能，進一步證明了體外誘導培養鴨骨髓源DC取得成功。

綜上，本研究誘導培養的鴨骨髓源DC具備較高的純度，能夠滿足后續科學研究的需求，為鴨DC相關研究奠定了堅實的基礎。