鴨骨髓源樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及功能分析

李玲，祝博森，朱婷，鐘睿，郭子杰，李睿婷，洪偉鳴，徐海

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

自從上世紀(jì)70年代Steinman等[1]發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)以來，研究人員對(duì)DC及其功能的認(rèn)知不斷深入，作為機(jī)體最重要的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，DC在啟動(dòng)獲得性免疫和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是連接先天免疫與獲得免疫之間的重要橋梁[2-3]。根據(jù)DC的來源、功能及其表面標(biāo)志物的不同，可分為經(jīng)典DC、漿細(xì)胞樣DC和單核細(xì)胞來源DC[4-5]。根據(jù)抗原的來源和性質(zhì)，DC主要通過MHCⅠ、Ⅱ類和交叉提呈途徑對(duì)抗原進(jìn)行加工和遞呈。內(nèi)源性抗原被DC降解成抗原多肽并裝載于MHCⅠ類分子，提呈給CD8+T細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主；而外源性抗原通過吞噬、胞飲、受體介導(dǎo)等內(nèi)吞作用被DC攝取，加工后裝載到MHCⅡ類分子，提呈給CD4+T細(xì)胞，主要激發(fā)體液免疫[3，6]。

雖然DC在機(jī)體內(nèi)分布較為廣泛，但細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量小，且難以與其他類型細(xì)胞進(jìn)行有效地分離純化[7]，因此需要建立體外培養(yǎng)方法來獲得大量高純度的DC，從而便于開展生物學(xué)、免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究工作。目前，體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物DC的技術(shù)已相對(duì)成熟，鼠源、豬源和人源DC均有成功報(bào)道的案例[8-10]。而家禽DC體外培養(yǎng)的報(bào)道相對(duì)較少，僅見付佳等[11]、張淑君等[12]利用白細(xì)胞介素4(IL-4)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出雞骨髓源DC。由于缺乏鴨源的誘導(dǎo)因子以及鴨DC表面標(biāo)志物特異性二抗，制約了鴨DC誘導(dǎo)培養(yǎng)方法的建立及后續(xù)鑒定工作的開展。因此，建立鴨DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法對(duì)進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及鴨其他相關(guān)疾病的研究工作均具有重要意義。

本研究嘗試?yán)檬笤吹闹亟MIL-4、GM-CSF作為誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)鴨骨髓源單核細(xì)胞向DC定向分化，從而建立鴨骨髓源DC的體外培養(yǎng)方法，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、DC表面標(biāo)志物檢測(cè)以及生物學(xué)功能測(cè)定對(duì)制備的DC做進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF鴨胚購于山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，本實(shí)驗(yàn)室自行孵化，并飼養(yǎng)至7日齡用于后續(xù)試驗(yàn)。

重組鼠IL-4 (貨號(hào)214-14，PeproTech公司)，重組鼠GM-CSF (貨號(hào)315-03，PeproTech公司)，PE Anti-CD11c抗體(貨號(hào)ab210309，Abcam公司)，F(xiàn)ITC Anti-CD86抗體(貨號(hào)ab2342237，Abcam公司)，F(xiàn)ITC Anti-MHC Ⅱ抗體(貨號(hào)ab24882，Abcam公司)，淋巴細(xì)胞分離液和配套分離管(天津?yàn)蠊?，CCK-8溶液(貨號(hào)CA1210，Solarbio公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)，脂多糖(LPS)(貨號(hào)L5293，Sigma公司)，鴨白細(xì)胞介素2 (IL-2)和鵝γ干擾素 (IFN-γ) (南京森貝伽生物科技有限公司)，mRNA提取試劑盒及分子生物學(xué)(大連寶生物公司)。其余試劑均為分析純。

光學(xué)倒置顯微鏡(日本尼康公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，ELSIA酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，臺(tái)式離心機(jī)(美國Beck-man公司)，熒光定量PCR儀(美國ThermoFisher公司)。

1.2 鴨骨髓細(xì)胞的分離培養(yǎng)

翅靜脈注入空氣處死7日齡雛鴨，然后浸泡于75%酒精2～5 min，轉(zhuǎn)至無菌水中浸泡1 min以去除酒精。在潔凈工作臺(tái)內(nèi)剝離出所有股骨和脛骨，剔除骨頭上粘連的肌肉組織，再浸泡于含2%雙抗的PBS中5 min。剪去骨頭兩端，用無菌PBS反復(fù)沖洗出骨髓至平皿中，直至骨髓腔變白。收集骨髓懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾小碎片和肌肉組織。濾過液用PBS洗滌2次并重懸至3 mL，按照等體積比將骨髓細(xì)胞緩緩加入預(yù)先裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1 500 r/min離心25 min，小心吸取中間白霧層細(xì)胞至另一離心管中，PBS洗滌2次，用3 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3 DC誘導(dǎo)分化條件的優(yōu)化

如表1所示，選擇血清、IL-4和GM-CSF這3個(gè)因素，每個(gè)因素對(duì)應(yīng)2個(gè)濃度水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)比A、B、C、D共4個(gè)培養(yǎng)組中DC的吞噬能力。用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整制備的骨髓單核細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL，2 mL每孔鋪細(xì)胞至6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。每隔1 d更換50%的培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)足工作濃度的IL-4、GM-CSF，并于誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第5天加入工作濃度為1 μg/mL的LPS，刺激48 h后收集細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)期間，用光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4 DC吞噬功能的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)后第1、3、5、7天從4個(gè)培養(yǎng)組收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，轉(zhuǎn)移500 μL細(xì)胞至12孔細(xì)胞板，加入等體積0.1%中性紅生理鹽水溶液，37 ℃孵育2 h，收集細(xì)胞并用PBS緩沖液洗滌3次，加入500 μL 1% SDS溶液，室溫作用2 h裂解細(xì)胞，取100 μL至ELISA板中，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)，測(cè)定波長570 nm處吸光值，以O(shè)D值表示DC的吞噬能力。

1.5 流式檢測(cè)DC表面標(biāo)志物

采用最佳培養(yǎng)條件，收集培養(yǎng)至第7天的DC，1 000 r/min離心10 min后棄上清液，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL；調(diào)整未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓單核細(xì)胞至相同濃度。分別將2種細(xì)胞分成4等份，取其中3份分別加入工作濃度的抗CD11c、CD80和MHCⅡ熒光二抗，室溫避光孵育30 min，另1份不做處理用作空白對(duì)照。孵育后的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次(1 000 r/min離心5 min)，最后用200 μL PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.6 DC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞含量測(cè)定

選擇最佳培養(yǎng)條件，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)第1、3、5、7天細(xì)胞中收集200 μL培養(yǎng)配液，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩８鶕?jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒操作說明書，分別測(cè)定DC培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-γ的含量。

1.7 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

分離雛鴨外周血淋巴細(xì)胞[14]，調(diào)整細(xì)胞濃度并以每100 μL 1×105個(gè)接入96孔板作為應(yīng)答細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)DC至第5天，將細(xì)胞等分成2組，其中1組添加工作濃度的LPS來促進(jìn)DC成熟，另1組不做任何處理。48 h后分別收集2組DC作為刺激細(xì)胞。按照1∶1、1∶5和1∶10的比例混合刺激細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞，置于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并同時(shí)設(shè)置應(yīng)答細(xì)胞、刺激細(xì)胞的對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，讀取450 nm處吸光值(OD450)。按照公式計(jì)算刺激指數(shù)(SI)，SI=(試驗(yàn)組OD450值-刺激細(xì)胞對(duì)照OD450值)/應(yīng)答細(xì)胞OD450值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用SPSS 19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，One-way ANOVA法檢驗(yàn)差異顯著性，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外培養(yǎng)鴨骨髓源DC形態(tài)觀察

從鴨骨髓中分離的單核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)后逐漸向DC定向分化。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示：剛分離的骨髓單核細(xì)胞呈球狀，直徑較小自然沉降于細(xì)胞板底部，輕輕晃動(dòng)即重新懸浮。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第3天，部分細(xì)胞貼壁、拉伸，可見短小刺突(圖1A)；繼續(xù)培養(yǎng)至第5天，大部分細(xì)胞貼壁生長，且以菱形結(jié)構(gòu)為主，刺突增多(圖1B)；經(jīng)LPS刺激后，DC趨于成熟且呈多形性，刺突明顯增多且粗壯(圖1C)。經(jīng)誘導(dǎo)分化，體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)上呈現(xiàn)出典型的DC特性，初步說明已成功培養(yǎng)出目的細(xì)胞。

A、 B、 C. 分別為誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、5和7天的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 不同培養(yǎng)體系中DC吞噬能力的比較

如圖2所示，用15%胎牛血清、20 ng/mL IL-4和40 ng/mL GM-CSF的C組所誘導(dǎo)的DC吞噬能力最強(qiáng)。此外，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)的增加，其DC吞噬能力亦相應(yīng)增強(qiáng)，并在培養(yǎng)后第5天達(dá)到高峰；而LPS刺激熟化48 h后的DC，其吞噬能力有所下降。上述吞噬能力的差異，間接說明通過優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件可以提高單位時(shí)間內(nèi)DC的活力和數(shù)量，且成熟后的DC吞噬能力較成熟前略有下降。

圖2 不同培養(yǎng)條件的DC吞噬能力比較

2.3 DC表面標(biāo)志物檢測(cè)

分別用抗雞源、鼠源DC表面標(biāo)志物的熒光抗體標(biāo)記制備的鴨骨髓源DC，經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化至第7天的DC表面標(biāo)志物的表達(dá)量(圖3D、E、F)較起始的骨髓單核細(xì)胞(圖3A、B、C)有顯著上調(diào)，DC表面標(biāo)志物CD11c、CD80、MHC Ⅱ的表達(dá)量分別為80.08%、81.27%和91.47%。該結(jié)果表明成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，且具有較高的純度。

2.4 DC分泌細(xì)胞因子的含量

根據(jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑操作說明書，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-γ的含量變化。從表2可以看出，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，2種細(xì)胞因子的分泌量整體呈上升趨勢(shì)，IL-2的含量在第3、5天差異不顯著。培養(yǎng)至第5天的DC經(jīng)LPS刺激后，在第7天DC分泌細(xì)胞因子量顯著上升，IL-2和IFN-γ的含量分別達(dá)到(51.28±2.16)和(113.36±8.64)pg/mL，比刺激前提高約2倍。

表2 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量測(cè)定 pg/mL

2.5 DC激活淋巴細(xì)胞的能力

DCs作為刺激細(xì)胞與淋巴細(xì)胞按照不同比例混合培養(yǎng)，從圖4可以看出，DC作為刺激細(xì)胞可以刺激淋巴細(xì)胞增殖，但LPS刺激成熟后的DC激活淋巴細(xì)胞的能力更強(qiáng)。成熟前后的DC與淋巴細(xì)胞以1∶5比例混合培養(yǎng)時(shí)，其刺激能力較強(qiáng)，SI值分別達(dá)到1.3和1.7。

注：*表示P<0.05。

3 討論

現(xiàn)在普遍認(rèn)為絕大多數(shù)的DC發(fā)育起源于骨髓造血干細(xì)胞，然后在多種細(xì)胞因子(GM-CSF、FLT3L)和轉(zhuǎn)錄因子(PU.1、E2-2、Id2、Batf3、IRF4、IRF8)的共同作用下，骨髓造血干細(xì)胞定向分化成髓系和淋巴系DC前體細(xì)胞，這些前體細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，最后在淋巴組織和非淋巴組織中進(jìn)一步分化成熟[15-16]。在體內(nèi)，GM-CSF對(duì)DC的分化是非必需的，但在體外，該因子可以促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞或單核細(xì)胞向DC定向分化，是維持DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子[17]。此外，IL-4能夠協(xié)同GM-CSF增強(qiáng)細(xì)胞集落的生產(chǎn)，刺激細(xì)胞增殖并維持DC的成熟狀態(tài)，TNF-α可以刺激DC趨于成熟[18]。目前，已經(jīng)建立的DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法都必需有細(xì)胞因子的參與。

本試驗(yàn)中首次采用鼠源GM-CSF和IL-4聯(lián)合刺激培養(yǎng)鴨骨髓單核細(xì)胞向DC的定向分化。劉迪[19]利用重組人源GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)出雞骨髓源DC，說明異源細(xì)胞因子也可以用于DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)。為了確保DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的成功，本試驗(yàn)針對(duì)培養(yǎng)體系中的血清、GM-CSF和IL-4這3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，通過評(píng)價(jià)不同時(shí)間點(diǎn)DC的吞噬能力最終確定最佳培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清、20 ng/mL的IL-4和40 ng/mL的GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC吞噬能力最強(qiáng)。在培養(yǎng)后3 d，可以在顯微下觀察到細(xì)胞從球形向菱形的轉(zhuǎn)變，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天可以明顯看到典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物是鑒定細(xì)胞的關(guān)鍵，本試驗(yàn)中由于缺乏鴨DC表面標(biāo)志物的熒光二抗，故選擇抗雞MHCⅡ、抗鼠CD11c和CD80的抗體進(jìn)行替代，用于流式檢測(cè)鴨DC的純度，從結(jié)果可以看出，3個(gè)抗體均能與鴨表面標(biāo)志物結(jié)合，其CD11c、CD80和MHC Ⅱ的表達(dá)量分別達(dá)到80.08%、81.27%和91.47%，顯現(xiàn)出較高的純度。綜合DC形態(tài)學(xué)變化和表面標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，表明已經(jīng)在體外成功培養(yǎng)出高品質(zhì)的鴨骨髓源樹突狀細(xì)胞。

有研究表明，未成熟的DC能夠高效地?cái)z取病原體、死亡細(xì)胞和其他抗原物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行加工處理[20]，此時(shí)DC表面的MHCⅠ、Ⅱ類分子，T細(xì)胞共刺激因子以及黏附分子的表達(dá)量較低[21]；而成熟的DC的抗原攝取能力下降，但MHCⅠ、Ⅱ類分子，共刺激分子和黏附分子等表達(dá)量上調(diào)，此外還會(huì)分泌和表達(dá)一些細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)控T細(xì)胞分化[22]。本試驗(yàn)中用LPS刺激培養(yǎng)至第5天的DC以促進(jìn)其成熟，成熟后的DC吞噬能力下降，而培養(yǎng)上清液中分泌的IL-2、IFN-γ量顯著增加，并且成熟的DC更能刺激淋巴細(xì)胞的增殖。這些試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相符，說明制備的細(xì)胞具備了樹突狀細(xì)胞的基本生物學(xué)功能，進(jìn)一步證明了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)鴨骨髓源DC取得成功。

綜上，本研究誘導(dǎo)培養(yǎng)的鴨骨髓源DC具備較高的純度，能夠滿足后續(xù)科學(xué)研究的需求，為鴨DC相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。