杭州地區牛乳源大腸桿菌的分離鑒定及木糖醇聯用抗菌肽對生物被膜形成的干預

賴文韜，余茂林，姜中其

(浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種常見的奶牛乳房炎病原體，可導致奶牛產奶量減少、乳品質下降以及提高淘汰率、死亡率。該菌主要的毒力因子脂多糖(LPS)可以引發內毒素休克和免疫反應，促進炎癥因子的表達并影響抗菌藥物的功效[1]。此外，大腸桿菌通過形成生物被膜(BBF)加強了對宿主免疫系統和抗菌藥物的耐受性[2]。因此，研究新的治療辦法十分必要。

木糖醇是一種天然的五碳糖醇，具有許多優良的特性，包括能夠替代蔗糖作為天然的甜味劑以及防止齲齒等[3]。在畜牧業中，木糖醇可用于治療奶牛酮病[4-5]，促進免疫應激狀態下肉雞生長[6-7]等。有研究顯示，木糖醇能夠抑制許多病原菌的生長和附著，如大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌等[8]，不僅能干預生物被膜的形成，而且也能破壞已經成熟的生物被膜[9]?？咕?AMPs)是一種小分子多肽類生物活性物質，是宿主先天性免疫防御系統的重要組成部分?？咕膸д姾桑軌蚺cLPS靜電結合并破壞細胞膜的完整性。研究表明，某些抗菌肽具有抗生物被膜的特性，能夠破壞生物被膜并防止其形成?？咕膸д姾?，能夠與脂多糖靜電結合并破壞細胞膜的完整性[10]。通過比較一系列具有抗BBF活性的AMPs，篩選出抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，研究表明，其抗BBF活性最強，在低濃度(1/2 MIC)下，能使BBF形成減少78%[11]。

本試驗分析木糖醇聯用抗菌肽1037對大腸桿菌生物被膜最小抑菌濃度(MBIC)和最小殺菌濃度(MBEC)的影響，并進一步探究2種藥物聯合應用對大腸桿菌生物被膜的作用。研究結果可為臨床治療大腸桿菌引起的奶牛乳房炎及耐藥性的控制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

木糖醇(USP grade，批號：XB0997)，生工生物工程(上海)股份有限公司；抗菌肽1037(氨基酸序列為：KRFRIRVRV，通過標準固相方法合成，反相高效液相層析檢測純度均為99%以上)，吉爾生化生物科技有限公司；血瓊脂平板、剛果紅、結晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司；Luria-Bertani(LB)肉湯培養基、Nutrient Broth(NB)瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、腸桿菌科細菌生化試驗管，杭州濱河微生物試劑有限公司；乙醇、戊二醛、鋨酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

卡爾加里生物被膜發生裝置，光景生物科技(蘇州)有限公司；聚氯乙烯(PVC)薄片，迎佳橡膠絕緣材料廠；ZEISS Gemini SEM 300場發射掃描電子顯微鏡，卡爾蔡司(上海)管理有限公司；Hitachi HCP-2型臨界點干燥儀，日本日立公司。

1.3 菌株分離鑒定

采集杭州地區近江、富倫、正興等6個規模較大的奶牛場奶樣共200份，劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃培養24 h，再挑取單菌落至麥康凱平板，37 ℃培養24 h；挑取麥康凱平板上的單菌落革蘭染色后鏡檢，同時進行生化試驗。之后采用PCR法鑒定大腸桿菌，根據文獻報道的PCR引物[12]，引物序列為F：5′-ATCAACCGAGATTCCCCCAGT-3′，R：5′-TCACTATCGGTCAGTCAGGAG-3′，擴增目標條帶232 bp，引物由生工生物工程有限公司(上海)股份有限公司合成。

1.4 藥液配制

取抗菌肽溶于無菌去離子水，配制成4 098 μg/mL的儲備液；取木糖醇溶于LB肉湯，配制成5%的儲備液，121 ℃高溫高壓滅菌后冷卻備用。

1.5 菌懸液制備

將大腸桿菌接種于LB液體培養基，37 ℃振蕩培養12 h，調整濃度為0.5個麥氏濁度，作為生物被膜待接種菌懸液備用。

1.6 生物被膜形成能力的測定

1.6.1 剛果紅(CRA)定性檢測

將菌懸液劃線接種于剛果紅瓊脂平板37 ℃培養24 h，置室溫72 h，觀察菌落的顏色和形態。粗糙、干燥、水晶樣的黑色菌落判定為被膜陽性菌株；紅色光滑型菌落為生物被膜陰性菌株。

1.6.2 結晶紫(SQAA)半定量檢測

將菌懸液加入卡爾加里生物被膜發生裝置平板的孔中，以LB肉湯為陰性對照，37 ℃培養48 h；將平板中液體移除，無菌生理鹽水充分漂洗除去浮游菌，室溫干燥后用95%乙醇固定5 min；再用1%結晶紫染色5 min；用滅菌生理鹽水漂洗除去剩余的染液；再用35%乙醇脫色30 min，釋放釘柱板上生物被膜中的結晶紫；測定570 nm波長處的吸光值。重復3次，OD值取3組平均值。OD570 nm≥0.1的為生物被膜陽性菌株，OD570 nm<0.1的為生物被膜陰性菌株。

1.7 MBIC的測定

選擇CRA與SQAA檢測中均呈現生物被膜陽性的大腸桿菌臨床分離株ZX-45，參考虞惠貞[9]的方法，進行MBIC、MBEC的測定以及藥物干預生物被膜試驗。

2個月規培結束后,對PBL組及SBME-PBL組學員進行理論知識與實踐成績考核,實踐考核主要包括病例分析與神經系統檢查結果的評估。并由學員填寫問卷調查表,問卷內容包括是否有助于提高自學能力、學習興趣、臨床思維能力、知識的系統性掌握、臨床實踐的適應操作能力、基礎知識的掌握、團隊協作能力等。各項調查回答為同意或不同意,兩組問卷結果以百分比形式呈現。

①取生物被膜待接種菌液，200 μL/孔加入MBEC發生裝置板的96孔里，共加入2排，蓋上釘柱蓋，37 ℃靜置培養24 h，培養生物被膜；②棄去培養液，用無菌生理鹽水小心沖洗釘柱蓋的釘子，除去浮游菌；③另取1塊新的MBEC發生裝置板，第1排每孔加入100 μL無菌LB培養基，取100 μL抗菌肽加入第1孔，混合均勻后，連續2倍倍比稀釋至第12孔，使每孔抗菌肽濃度為1～2 048 μg/mL；第2排孔加入100 μL無菌5%木糖醇-LB培養基，取100 μL抗菌肽同法稀釋，使每孔抗菌肽濃度為1～2 048 μg/mL；④將沖洗好的釘柱蓋蓋到加有藥品的MBEC發生裝置板上，37 ℃靜置培養24 h；⑤肉眼觀察MBEC發生裝置板，培養液澄清無菌生長的孔最低稀釋度藥物濃度為MBIC。

1.8 MBEC的測定

從MBEC板上表現澄清未長菌的孔里，每孔吸取100 μL培養液涂于NB瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h，平板菌落數小于5的最低稀釋度作為MBEC。

1.9 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌干預的掃描電鏡觀察

1.9.1 生物被膜的培養

①取12孔細胞培養板，放入PVC；②取3 mL大腸桿菌菌懸液加入4孔，另外1孔加入3 mL無菌LB液體培養基，37 ℃培養24 h；③另取1塊新的12孔細胞培養板，分別向對應孔里加入3 mL無菌液體LB培養基，3 mL 5%木糖醇-LB培養基，3 mL抗菌肽-LB培養基(濃度為MBIC)，3 mL抗菌肽-5%木糖醇LB培養基(濃度為MBIC)；④將步驟②中培養的PVC薄片用無菌鑷子取出，生理鹽水沖洗正反面，然后正面朝上，放入步驟③中加有新培養基的12孔細胞培養板里，將步驟②中加無菌液體培養基作對照培養的PVC板放入步驟③的無菌液體培養基中，37 ℃，培養24 h。

1.9.2 掃描電鏡觀察的前處理

取1塊新的96孔板，每孔加入3 mL 2.5%戊二醛；取出PVC薄片，正面朝上，放入戊二醛里，4 ℃，過夜固定；按掃描電鏡要求進行處理后，在Hitachi HCP-2型臨界點干燥儀中進行干燥、鍍膜，最后在ZEISS Gemini SEM 300場發射掃描電子顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定

從200份乳房炎奶樣中共分離出303株細菌，經麥康凱培養基選擇性培養、革蘭染色、生化試驗以及PCR，鑒定出大腸桿菌98株。麥康凱培養基上分離出的菌落邊緣整體成圓形、粉紅色(圖1)；革蘭染色鏡檢呈兩端鈍圓、散在或成對存在、紅色的革蘭陰性直短桿菌(圖2)；生化試驗結果見表1，除尿素、苯丙氨酸、枸櫞酸鹽及硫化氫呈陰性外，其余均呈陽性，符合大腸桿菌生化特性；PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳見圖3，陽性對照和所有臨床分離株均擴增出232 bp的目標條帶，而陰性對照未見任何條帶。

表1 分離菌株生化特性鑒定結果

圖1 分離菌落形態(麥康凱瓊脂平板)

圖2 革蘭染色鏡檢形態(400×)

M.DNA標準DL1000；1. 陰性對照；2. 陽性對照；3～6. 分離菌株。

2.2 大腸桿菌生物被膜形成能力的測定

大腸桿菌生物被膜形成能力測定結果如圖4所示，根據剛果紅平板觀察(圖5)，98株臨床分離株中，生物被膜陽性菌株有57株，生物被膜陰性菌株有41株。根據OD570 nm測定結果，生物被膜陽性菌株有67株，生物被膜陰性菌株有31株。

圖4 大腸桿菌生物被膜形成能力

A.生物被膜陽性菌株；B.生物被膜陰性菌株。

2.3 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌生物被膜的MBIC和MBEC

抗菌肽1037對大腸桿菌生物被膜單獨作用的MBIC和MBEC相對較高，但是結合5%木糖醇以后，其MBIC和MBEC都明顯降低。

2.4 木糖醇和抗菌肽對成熟大腸桿菌生物被膜干預的掃描電鏡觀察

通過圖6的觀察可知，空白對照組中的大腸桿菌數量較多，且表面覆蓋了黏稠的膜狀物，提示其形成了明顯的生物被膜。在5%木糖醇處理組中，在低倍鏡下可見大腸桿菌數量有輕微減少，高倍鏡下見菌體表面的膜狀物較空白對照組稍薄，菌體間呈現出絲狀連接的特點。在抗菌肽處理組中，細菌數量較空白對照組和5%木糖醇處理組明顯減少，且菌體的短桿形態基本正常，表面沒有黏稠的生物被膜覆蓋，菌體間呈現出絲狀連接的特點，甚至可見部分被破壞的菌體。在5%木糖醇聯用抗菌肽處理組中，細菌數量較空白對照組和5%木糖醇處理組明顯減少，表面沒有黏稠的生物被膜覆蓋，絲狀連接較抗菌肽處理組明顯減少，菌體變形嚴重，呈現出短球狀、長桿狀、桿狀等不同形態，且可見裂解的菌體碎片。

圖6 大腸桿菌生物被膜掃描電鏡觀察

綜上可以得出以下結論：木糖醇和抗菌肽聯用能夠減少大腸桿菌的數量并破壞生物被膜的形成，其中抗菌肽能夠更有效地抑制大腸桿菌的數量，并且能夠破壞菌體表面的生物被膜。同時，聯用處理還可能導致大腸桿菌菌體的形態變化和菌體碎片的產生。

3 討論

大腸桿菌廣泛存在于奶牛的體表和環境中，是引起奶牛乳房炎的主要環境性致病菌。在早先的研究中，Yu等[13]收集了我國4個地區的750份來自乳房炎病例的牛源奶樣，大腸桿菌分離率為11.1%。廖智慧等[14]報道，衡水地區乳源大腸桿菌的分離率為33.3%，而本研究發現杭州地區的乳源大腸桿菌分離率高達49%，高于之前的報道。此外，我們還發現大腸桿菌在杭州地區的奶牛群體中的流行率為32.2%，高于陜西省西安、楊凌、寶雞和咸陽地區的流行率(15.8%)[15]，但低于河北規?；膛龅牧餍新?64.28%)[16]。李芬等[17]從患乳房炎的牛奶樣中分離的35株大腸桿菌發現，BBF陽性率為54.29%，本試驗測得臨床分離的大腸桿菌中有58.2%為BBF陽性菌株，與該報道結果接近。此次研究對大腸桿菌的流行情況以及BBF形成能力進行了更深入地了解。

近年來，細菌性奶牛乳房炎治療越來越困難，細菌耐藥性的產生是主要原因之一，而BBF形成又為細菌的生存提供了一層保障，為疾病的治療增加了難度。抗菌肽是宿主先天性免疫防御系統產生的一類抵抗外界病原體感染的小分子多肽類生物活性物質，具有一定的抗菌作用以及抗生物被膜作用[18-20]。天然抗菌肽通常是由12～60個氨基酸組成的小分子陽離子多肽[21]，Fuente-Núez等[11]發現一系列具有抗BBF活性的抗菌肽，一級結構中均有序列(FRIRVRV)，以此為基礎合成了僅由9個氨基酸組成的抗菌肽1037(KRFRIRVRV)，在保持其抗BBF活性的情況下，盡量減少了肽的大小，研究顯示，抗菌肽1037能顯著減少革蘭陰性(銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌)和革蘭陽性(李斯特菌)細菌BBF形成。本研究表明，抗菌肽1037能明顯減少大腸桿菌BBF形成，體現出的抗BBF作用與以上結果相一致，抗菌肽1037與其他具有抗菌特性的藥物聯用有一定的開發前景。

此外，本研究發現5%木糖醇聯用抗菌肽1037在降低大腸桿菌對抗菌肽1037耐藥性方面具有協同作用。與單獨使用抗菌肽1037相比，聯用后的抗菌效果明顯增強，菌體的絲狀連接更少，菌體嚴重變形甚至破裂，呈現出短球狀、長桿狀、桿狀等不同形態。虞惠貞[9]研究發現，5%木糖醇聯用環丙沙星和恩諾沙星后，同樣可以顯著降低抗菌藥物MBIC以及MBEC。有研究指出，木糖醇可以擴散到BBF內部，積累形成一種有毒的非代謝糖醇磷酸，從而抑制細菌生長或者BBF中應激蛋白的產生，表現出明顯的抗BBF活性[22-24]。由于抗菌肽作用方式與常規抗生素不同，其靶向細菌膜，產生膜不穩定或形成穿膜孔，最終導致細胞破裂[25]。因此，在聯用抗生素時，抗菌肽1037有可能促進抗生素進入細菌細胞，增強其殺菌效果。如寧亞維等[26]研究發現，抗菌肽brevilaterin與檸檬酸可通過破環細胞膜的完整性與降解菌體DNA以發揮協同抑制大腸桿菌的作用。

總之，本研究發現大腸桿菌在杭州地區奶牛乳房炎病例中分離率和BBF陽性率較高，抗菌肽1037能夠明顯減少大腸桿菌對生物被膜的形成，而5%木糖醇能夠協同增強抗菌肽1037對細菌的殺菌作用并破壞已形成的生物被膜。聯用抗菌肽和木糖醇或其他抗生素，有望用于臨床上大腸桿菌引起的奶牛乳房炎治療及生物被膜的清除。此外，抗菌肽1037是否通過破壞細菌細胞膜為木糖醇進入細菌創造了條件，值得進一步深入研究。