豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型TaqMan MGB探針熒光定量PCR方法的建立

徐之恒，孫少輝，董友富，唐偉明，徐孝宙，邢軍，李豪，孫劉妹，萬進，王聰*，張振東*

(1. 揚州大學醫學院(轉化醫學研究院)，江蘇 揚州 215001；2. 中牧實業股份有限公司，北京 100070；3. 江蘇科技大學生物技術學院，江蘇 鎮江 212018；4. 江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙、生長豬的呼吸道疾病以及感染豬的繼發感染為主要臨床表現的重要疫病，給我國生豬產業帶來了巨大的經濟損失[1-2]。PRRSV分為PRRSV1(歐洲型)與PRRSV2(美洲型)兩個種，我國主要以PRRSV2的流行為主[3]。根據ORF5基因序列，PRRSV2共分為9個譜系，我國主要流行4個譜系(譜系1、3、5、8)[4]。2006年我國暴發高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，其nsp2基因存在30個氨基酸的缺失(1+29)[5]；2013年類NADC30毒株傳入我國，其nsp2基因存在131個氨基酸的缺失(111+1+19)[6]；2017年開始，類NADC34毒株在我國多個省份被檢出，其nsp2基因的缺失特征為連續的100個氨基酸[7]。近年來，疫苗演化毒株、譜系1的類NADC30/NADC34毒株及不同譜系之間的重組毒株頻繁檢出[8-9]，使得PRRSV田間流行毒株呈現出明顯的多樣性和復雜性，嚴重困擾著我國豬場的生產發展，尤其在生物安全防控較差的豬場，PRRS時有暴發流行。為做好PRRS的預警、防控及凈化工作，臨床生產中往往通過對新生仔豬睪丸處理液、家豬口水液、臨斷奶弱仔豬血液等樣本的檢測，及時了解豬群PRRSV的感染狀態，進而適時采取不同的控制措施。因此，建立一種特異性強、靈敏度高、操作簡單的檢測方法對PRRS的篩查、診斷、防控及凈化工作意義重大[10]。本研究根據國內PRRSV2不同譜系流行毒株的情況，選取ORF6基因保守區域設計合成了1對引物和1條MGB探針，建立了一種通用型的TaqMan MGB熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測方法，以期為臨床上PRRS的快速診斷及科學防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸與臨床樣品

豬瘟病毒(CSFV)、PRRSV(歐洲型與美洲型)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬圓環病毒3型(PCV3)、豬細小病毒(PPV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的核酸樣本均由本實驗室保存；30份PRRSV陽性病料(RT-PCR初檢陽性)來自江蘇省不同地區規模化豬場。

1.2 主要試劑

Bio Flux Simply P病毒 DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；PrimeScript RT reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)反應酶購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；DL2000 Plus DNA Marker、FastPure Plasmid Mini Kit及AceQ?qPCR Probe Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pMD19-T 載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器

PCR擴增儀，購自美國 Applied Biosystems 公司；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠；凝膠成像分析系統，購自南京麥高德生物科技有限公司。

1.4 引物與探針的設計合成

選取PRRSV2不同譜系常見參考毒株ORF6基因的保守區域，設計并合成熒光定量PCR方法的上下游引物及探針序列。PRRSV2-F：5′-TTGCTAGGCCGCAAGTACAT-3′；PRRSV2-R：5′-GGACGACAAATGCGTGGTTA-3′；PRRSV2-P：5′ FAM-TCTGGCCCCTGCCCA-MGB-3′。引物和探針由浙江尚亞生物技術有限公司合成。

1.5 標準陽性質粒的制備

以PRRSV2陽性樣品的 cDNA作為模板，使用上述引物進行PCR 擴增。將PCR 產物凝膠回收并純化后克隆至pMD19-T載體，送至浙江尚亞生物技術有限公司測序鑒定，測序成功的陽性質粒命名為p19T-PRRSV2-M。使用微量紫外分光光度計測定陽性質粒濃度，并計算質粒拷貝數。質粒拷貝數=質粒濃度(μg/mL)×6.02×1023(copies/mol)/質粒堿基數×660(g/mol)。隨后按照泊松分布的原理進行10倍倍比稀釋質粒標準品，稀釋至1×108～1×101copies/μL，每次稀釋樣品時，渦旋儀震蕩30 s，移液槍吹打50次，重復3次，使質粒充分溶解于ddH2O中，做好標記，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.6 RT-qPCR反應體系、反應條件的優化及標準曲線的建立

采用20 μL反應體系，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)分別設置3個體積，即0.4、0.6、0.8 μL以優化反應體系，模板1 μL，ddH2O 補齊至20 μL。反應條件為：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，分別設置56 ℃、58 ℃和 60 ℃以優化反應的退火溫度，退火時間31 s，循環數40個。將標準質粒10倍倍比稀釋后，按照已優化的方法進行擴增，每個梯度設置3個重復，以Ct值為Y軸，標準品拷貝指數為X軸，由熒光定量PCR儀自動生成標準曲線。

1.7 特異性試驗

用本實驗室保存的PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸樣本為模板，進行RT-qPCR反應，驗證該方法的特異性。

1.8 重復性試驗

用1×107～1×104copies/μL的陽性標準質粒進行RT-qPCR，每個梯度設置 3 個重復，根據檢測所得Ct值計算組內標準差和變異系數；在不同時間段(間隔1周)對不同稀釋度(107、106、105、104copies/μL)的標準質粒進行3次檢測，根據所得Ct值計算組間標準差和變異系數(CV)。

1.9 臨床樣品的檢測

取本實驗室從江蘇省部分豬場收集的30份PRRSV陽性病料，利用Bio Flux Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒提取PRRSV RNA，反轉錄cDNA為模板，按照本研究建立的方法進行RT-qPCR擴增，以驗證本研究建立方法的有效性。

2 結果

2.1 標準質粒的制備

使用本研究設計的上下游引物擴增出目的片段(圖略)，將其克隆至pMD19-T載體上，測序后與所選區域的基因序列完全一致。測定陽性質粒濃度為203.64 ng/μL，根據拷貝數計算公式得出陽性質粒原始拷貝數為4.74×1010copies/μL，先將陽性質粒稀釋至1×1010copies/μL，再按照泊松分布的原理對其進行10倍倍比稀釋，取1×108～1×101copies/μL陽性質粒進行RT-qPCR檢測。

2.2 反應體系和條件的確定

經過退火溫度和引物探針配比的優化，最終確定了PRRSV2 TaqMan MGB實時熒光PCR擴增反應體系：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O補充至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，采集 FAM 通道熒光，共進行40個循環。

2.3 標準曲線的建立

使用拷貝數為1×108～1×101copies/μL的標準品進行RT-qPCR，每組3個重復，設置1組陰性對照(模板為ddH2O )。結果顯示，該基因的擴增曲線均呈現較為典型的S型(圖1)，不同稀釋度下的擴增曲線間距均勻，陰性對照無擴增。以起始模板拷貝數的對數為X軸，Ct值為Y軸，繪制標準曲線，可見不同稀釋度下呈現出良好的線性關系(圖2)。以不同稀釋度下的Ct值(表1)繪制標準曲線回歸方程：y=-3.563x+41.659，R2=0.994，最低檢測下限為10 copies/μL。

表1 熒光定量PCR批內重復性試驗

圖1 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR擴增曲線

圖2 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR標準曲線

2.4 特異性試驗

使用本研究建立的PRRSV2 ORF6基因 TaqMan MGB RT-qPCR方法對PRRSV1、PRRSV2、CSFV、 PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸及陰性對照(ddH2O)進行擴增，結果如圖3所示，只有PRRSV檢測為陽性，其他核酸和陰性對照均為陰性，表明本研究建立的方法具有良好的特異性。

圖3 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR方法的特異性檢測結果

2.5 重復性試驗

將p19T-PRRSV2-M質粒原液稀釋至1×107～1×104copies/μL進行批內與批間重復性試驗。結果顯示批內變異系數分別為1.55%、0.16%、0.34%和0.31%(表1)；批間變異系數分別為1.68%、1.32%、1.28%和1.07%(表2)。

表2 熒光定量PCR批間重復性試驗結果

2.6 PRRSV臨床陽性樣品的檢測

使用本研究建立的方法對30份PRRSV陽性樣品進行檢測，結果顯示，30份陽性樣品均具有明顯的擴增曲線，陽性率100%，Ct值區間范圍在22～36(圖4)，表明本試驗所建立的方法可用于臨床樣品的檢測。

圖4 臨床陽性樣品的RT-qPCR檢測結果

3 討論

目前PRRS的防控依然是我國養豬業面臨的最重大問題之一。不管是后備豬的更新入群，還是仔豬的保健免疫，通過實驗室手段進行早期PRRSV的評估篩查，及時發現隱性帶毒豬，對PRRS的防控具有非常重要的意義[11-12]。2017年，農業農村部對全國核心育種場提出了PRRS的凈化要求和標準，即連續24個月以上無PRRS臨床病例，且野毒感染病原學和抗體陰性，所以PRRS的凈化工作更是離不開實驗室檢測。匈牙利通過實驗室連續檢測，結合滅活苗免疫及后備豬更新的方式實現了PRRS的凈化[13]。2018年非洲豬瘟傳入我國，為做好病原的早期篩查及精準剔除，RT-qPCR檢測方法被廣泛應用[14]，極大地推動了我國動物疫病檢測領域的發展，這也更有利于我國PRRS等疫病的防控與凈化工作。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，全長約15 kb，具有快速變異與演化的特性[3-4]。近年來，我國PRRSV2的流行毒株發生變化，且多樣性和復雜性明顯增多[15]，因此，建立一種特異性強、敏感度高的通用型檢測方法對當前PRRS的診斷監控非常重要。PRRSV至少含有10個開放閱讀框，編碼多種非結構蛋白和結構蛋白[16]，本研究通過大量比對GenBank上登錄的PRRSV2不同譜系毒株的片段序列，發現編碼主要結構蛋白M的ORF6基因上存在一段高度保守序列，設計了特異性擴增PRRSV2不同譜系毒株ORF6基因的引物對和探針。TaqMan-MGB探針是在經典TaqMan方法上經改良后發展而來的一種水解型探針，特異性大大增強，目前多種動物病原的RT-qPCR檢測方法對TaqMan-MGB探針進行了更新與優化，且表現出了非常好的應用效果[17-19]。本研究通過優化反應條件和反應體系，在進行敏感性、特異性、重復性試驗后，建立了檢測PRRSV2 ORF6基因的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法，該方法對CSFV、PRV、PCV2等常見的病原均無交叉反應，對不同滴度的陽性標準質粒模板均具有典型的擴增曲線，Ct值與濃度之間呈現良好的線性關系，最低檢出濃度為10 copies/μL，相比于已報道的普通PCR方法，敏感性顯著提高且檢測時間大大縮短[20-21]。重復性試驗顯示組間與組內的離散度小，表明該方法具有良好的重復性。對30份PRRSV陽性樣品(血樣、唾液樣、組織樣、睪丸處理液等)進行檢測，結果均為陽性，但與初檢Ct值存在0.5～1.2的差異，這可能與樣品長期存放的核酸降解有關。

綜上，本研究所建立的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法是一種特異、靈敏、高效且可應用于臨床上不同種類樣品的檢測方法，為PRRSV2感染的快速診斷及防控凈化提供了技術手段。