豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型TaqMan MGB探針熒光定量PCR方法的建立

徐之恒，孫少輝，董友富，唐偉明，徐孝宙，邢軍，李豪，孫劉妹，萬進，王聰*，張振東*

(1. 揚州大學醫(yī)學院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院)，江蘇 揚州 215001；2. 中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070；3. 江蘇科技大學生物技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；4. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 句容 212400)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙、生長豬的呼吸道疾病以及感染豬的繼發(fā)感染為主要臨床表現(xiàn)的重要疫病，給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。PRRSV分為PRRSV1(歐洲型)與PRRSV2(美洲型)兩個種，我國主要以PRRSV2的流行為主[3]。根據(jù)ORF5基因序列，PRRSV2共分為9個譜系，我國主要流行4個譜系(譜系1、3、5、8)[4]。2006年我國暴發(fā)高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，其nsp2基因存在30個氨基酸的缺失(1+29)[5]；2013年類NADC30毒株傳入我國，其nsp2基因存在131個氨基酸的缺失(111+1+19)[6]；2017年開始，類NADC34毒株在我國多個省份被檢出，其nsp2基因的缺失特征為連續(xù)的100個氨基酸[7]。近年來，疫苗演化毒株、譜系1的類NADC30/NADC34毒株及不同譜系之間的重組毒株頻繁檢出[8-9]，使得PRRSV田間流行毒株呈現(xiàn)出明顯的多樣性和復雜性，嚴重困擾著我國豬場的生產(chǎn)發(fā)展，尤其在生物安全防控較差的豬場，PRRS時有暴發(fā)流行。為做好PRRS的預警、防控及凈化工作，臨床生產(chǎn)中往往通過對新生仔豬睪丸處理液、家豬口水液、臨斷奶弱仔豬血液等樣本的檢測，及時了解豬群PRRSV的感染狀態(tài)，進而適時采取不同的控制措施。因此，建立一種特異性強、靈敏度高、操作簡單的檢測方法對PRRS的篩查、診斷、防控及凈化工作意義重大[10]。本研究根據(jù)國內(nèi)PRRSV2不同譜系流行毒株的情況，選取ORF6基因保守區(qū)域設計合成了1對引物和1條MGB探針，建立了一種通用型的TaqMan MGB熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測方法，以期為臨床上PRRS的快速診斷及科學防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸與臨床樣品

豬瘟病毒(CSFV)、PRRSV(歐洲型與美洲型)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)、豬細小病毒(PPV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的核酸樣本均由本實驗室保存；30份PRRSV陽性病料(RT-PCR初檢陽性)來自江蘇省不同地區(qū)規(guī)模化豬場。

1.2 主要試劑

Bio Flux Simply P病毒 DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；PrimeScript RT reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)反應酶購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；DL2000 Plus DNA Marker、FastPure Plasmid Mini Kit及AceQ?qPCR Probe Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pMD19-T 載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器

PCR擴增儀，購自美國 Applied Biosystems 公司；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，購自南京麥高德生物科技有限公司。

1.4 引物與探針的設計合成

選取PRRSV2不同譜系常見參考毒株ORF6基因的保守區(qū)域，設計并合成熒光定量PCR方法的上下游引物及探針序列。PRRSV2-F：5′-TTGCTAGGCCGCAAGTACAT-3′；PRRSV2-R：5′-GGACGACAAATGCGTGGTTA-3′；PRRSV2-P：5′ FAM-TCTGGCCCCTGCCCA-MGB-3′。引物和探針由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 標準陽性質(zhì)粒的制備

以PRRSV2陽性樣品的 cDNA作為模板，使用上述引物進行PCR 擴增。將PCR 產(chǎn)物凝膠回收并純化后克隆至pMD19-T載體，送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測序鑒定，測序成功的陽性質(zhì)粒命名為p19T-PRRSV2-M。使用微量紫外分光光度計測定陽性質(zhì)粒濃度，并計算質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度(μg/mL)×6.02×1023(copies/mol)/質(zhì)粒堿基數(shù)×660(g/mol)。隨后按照泊松分布的原理進行10倍倍比稀釋質(zhì)粒標準品，稀釋至1×108～1×101copies/μL，每次稀釋樣品時，渦旋儀震蕩30 s，移液槍吹打50次，重復3次，使質(zhì)粒充分溶解于ddH2O中，做好標記，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.6 RT-qPCR反應體系、反應條件的優(yōu)化及標準曲線的建立

采用20 μL反應體系，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)分別設置3個體積，即0.4、0.6、0.8 μL以優(yōu)化反應體系，模板1 μL，ddH2O 補齊至20 μL。反應條件為：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，分別設置56 ℃、58 ℃和 60 ℃以優(yōu)化反應的退火溫度，退火時間31 s，循環(huán)數(shù)40個。將標準質(zhì)粒10倍倍比稀釋后，按照已優(yōu)化的方法進行擴增，每個梯度設置3個重復，以Ct值為Y軸，標準品拷貝指數(shù)為X軸，由熒光定量PCR儀自動生成標準曲線。

1.7 特異性試驗

用本實驗室保存的PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸樣本為模板，進行RT-qPCR反應，驗證該方法的特異性。

1.8 重復性試驗

用1×107～1×104copies/μL的陽性標準質(zhì)粒進行RT-qPCR，每個梯度設置 3 個重復，根據(jù)檢測所得Ct值計算組內(nèi)標準差和變異系數(shù)；在不同時間段(間隔1周)對不同稀釋度(107、106、105、104copies/μL)的標準質(zhì)粒進行3次檢測，根據(jù)所得Ct值計算組間標準差和變異系數(shù)(CV)。

1.9 臨床樣品的檢測

取本實驗室從江蘇省部分豬場收集的30份PRRSV陽性病料，利用Bio Flux Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒提取PRRSV RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，按照本研究建立的方法進行RT-qPCR擴增，以驗證本研究建立方法的有效性。

2 結(jié)果

2.1 標準質(zhì)粒的制備

使用本研究設計的上下游引物擴增出目的片段(圖略)，將其克隆至pMD19-T載體上，測序后與所選區(qū)域的基因序列完全一致。測定陽性質(zhì)粒濃度為203.64 ng/μL，根據(jù)拷貝數(shù)計算公式得出陽性質(zhì)粒原始拷貝數(shù)為4.74×1010copies/μL，先將陽性質(zhì)粒稀釋至1×1010copies/μL，再按照泊松分布的原理對其進行10倍倍比稀釋，取1×108～1×101copies/μL陽性質(zhì)粒進行RT-qPCR檢測。

2.2 反應體系和條件的確定

經(jīng)過退火溫度和引物探針配比的優(yōu)化，最終確定了PRRSV2 TaqMan MGB實時熒光PCR擴增反應體系：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，探針(10 μmol/L)0.3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O補充至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，采集 FAM 通道熒光，共進行40個循環(huán)。

2.3 標準曲線的建立

使用拷貝數(shù)為1×108～1×101copies/μL的標準品進行RT-qPCR，每組3個重復，設置1組陰性對照(模板為ddH2O )。結(jié)果顯示，該基因的擴增曲線均呈現(xiàn)較為典型的S型(圖1)，不同稀釋度下的擴增曲線間距均勻，陰性對照無擴增。以起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸，繪制標準曲線，可見不同稀釋度下呈現(xiàn)出良好的線性關系(圖2)。以不同稀釋度下的Ct值(表1)繪制標準曲線回歸方程：y=-3.563x+41.659，R2=0.994，最低檢測下限為10 copies/μL。

表1 熒光定量PCR批內(nèi)重復性試驗

圖1 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR擴增曲線

圖2 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR標準曲線

2.4 特異性試驗

使用本研究建立的PRRSV2 ORF6基因 TaqMan MGB RT-qPCR方法對PRRSV1、PRRSV2、CSFV、 PRV、PCV2、PCV3、PEDV、PPV的核酸及陰性對照(ddH2O)進行擴增，結(jié)果如圖3所示，只有PRRSV檢測為陽性，其他核酸和陰性對照均為陰性，表明本研究建立的方法具有良好的特異性。

圖3 PRRSV2 ORF6基因TaqMan MGB RT-qPCR方法的特異性檢測結(jié)果

2.5 重復性試驗

將p19T-PRRSV2-M質(zhì)粒原液稀釋至1×107～1×104copies/μL進行批內(nèi)與批間重復性試驗。結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.55%、0.16%、0.34%和0.31%(表1)；批間變異系數(shù)分別為1.68%、1.32%、1.28%和1.07%(表2)。

表2 熒光定量PCR批間重復性試驗結(jié)果

2.6 PRRSV臨床陽性樣品的檢測

使用本研究建立的方法對30份PRRSV陽性樣品進行檢測，結(jié)果顯示，30份陽性樣品均具有明顯的擴增曲線，陽性率100%，Ct值區(qū)間范圍在22～36(圖4)，表明本試驗所建立的方法可用于臨床樣品的檢測。

圖4 臨床陽性樣品的RT-qPCR檢測結(jié)果

3 討論

目前PRRS的防控依然是我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的最重大問題之一。不管是后備豬的更新入群，還是仔豬的保健免疫，通過實驗室手段進行早期PRRSV的評估篩查，及時發(fā)現(xiàn)隱性帶毒豬，對PRRS的防控具有非常重要的意義[11-12]。2017年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對全國核心育種場提出了PRRS的凈化要求和標準，即連續(xù)24個月以上無PRRS臨床病例，且野毒感染病原學和抗體陰性，所以PRRS的凈化工作更是離不開實驗室檢測。匈牙利通過實驗室連續(xù)檢測，結(jié)合滅活苗免疫及后備豬更新的方式實現(xiàn)了PRRS的凈化[13]。2018年非洲豬瘟傳入我國，為做好病原的早期篩查及精準剔除，RT-qPCR檢測方法被廣泛應用[14]，極大地推動了我國動物疫病檢測領域的發(fā)展，這也更有利于我國PRRS等疫病的防控與凈化工作。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，全長約15 kb，具有快速變異與演化的特性[3-4]。近年來，我國PRRSV2的流行毒株發(fā)生變化，且多樣性和復雜性明顯增多[15]，因此，建立一種特異性強、敏感度高的通用型檢測方法對當前PRRS的診斷監(jiān)控非常重要。PRRSV至少含有10個開放閱讀框，編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白[16]，本研究通過大量比對GenBank上登錄的PRRSV2不同譜系毒株的片段序列，發(fā)現(xiàn)編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白M的ORF6基因上存在一段高度保守序列，設計了特異性擴增PRRSV2不同譜系毒株ORF6基因的引物對和探針。TaqMan-MGB探針是在經(jīng)典TaqMan方法上經(jīng)改良后發(fā)展而來的一種水解型探針，特異性大大增強，目前多種動物病原的RT-qPCR檢測方法對TaqMan-MGB探針進行了更新與優(yōu)化，且表現(xiàn)出了非常好的應用效果[17-19]。本研究通過優(yōu)化反應條件和反應體系，在進行敏感性、特異性、重復性試驗后，建立了檢測PRRSV2 ORF6基因的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法，該方法對CSFV、PRV、PCV2等常見的病原均無交叉反應，對不同滴度的陽性標準質(zhì)粒模板均具有典型的擴增曲線，Ct值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系，最低檢出濃度為10 copies/μL，相比于已報道的普通PCR方法，敏感性顯著提高且檢測時間大大縮短[20-21]。重復性試驗顯示組間與組內(nèi)的離散度小，表明該方法具有良好的重復性。對30份PRRSV陽性樣品(血樣、唾液樣、組織樣、睪丸處理液等)進行檢測，結(jié)果均為陽性，但與初檢Ct值存在0.5～1.2的差異，這可能與樣品長期存放的核酸降解有關。

綜上，本研究所建立的TaqMan MGB探針RT-qPCR方法是一種特異、靈敏、高效且可應用于臨床上不同種類樣品的檢測方法，為PRRSV2感染的快速診斷及防控凈化提供了技術(shù)手段。