豬流行性腹瀉病毒熒光免疫層析檢測(cè)試紙條的研制和應(yīng)用

陳芷珊，陳瀅鍇，陳中婷，蒙淑玲，江明生，陳海蘭，3，4*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心，廣西 南寧 530004；3. 廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；4. 廣西高校動(dòng)物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的單股正鏈RNA病毒，可感染各日齡各品系的豬，引發(fā)豬流行性腹瀉(PED)。PED是一種以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的高度接觸性腸道傳染病，對(duì)哺乳仔豬危害最大，死亡率可高達(dá)100%[1]。豬流行性腹瀉在1971年首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)，隨后在歐洲和亞洲的部分國(guó)家相繼流行，各地的哺乳仔豬大量被感染并發(fā)生死亡[2]。2007年在泰國(guó)暴發(fā)PED，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[3]。2004年杜堅(jiān)等[4]首次用血清學(xué)方法證實(shí)了廣西豬場(chǎng)存在PEDV感染，但未出現(xiàn)大規(guī)模疫情暴發(fā)。2010年，中國(guó)首先于南方地區(qū)出現(xiàn)PED暴發(fā)，隨后遍及全國(guó)各地，給中國(guó)的養(yǎng)豬企業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失和影響[5]。近幾年的調(diào)查結(jié)果表明，PEDV在廣西的平均檢出率最高為58.26%，表明PED在廣西生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中的危害不容忽視[6]。對(duì)PEDV感染的早期篩查是控制該病毒傳播和PED疫情蔓延的關(guān)鍵，因此，建立一種PEDV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法對(duì)PED的防制有著重要意義。

常用的PEDV檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)方法和血清學(xué)檢測(cè)方法，其中病原學(xué)檢測(cè)方法包括常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，而血清學(xué)檢測(cè)方法主要有間接免疫熒光(IFA)、病毒中和檢測(cè)(VN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫層析技術(shù)等[7]。RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法有較好的特異性和靈敏度，但是需要較高水平的專業(yè)能力和昂貴的設(shè)備支持，不適用于養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。RT-LAMP具有引物特異性強(qiáng)，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但由于反應(yīng)需要多條引物，且相關(guān)試劑價(jià)格較高，限制了該方法在基層檢測(cè)的普及[8]。VN檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便且無(wú)需專門設(shè)備，但檢測(cè)結(jié)果的判斷具有主觀性，并且檢測(cè)的重復(fù)性易受影響[9]。ELISA可用于大規(guī)模臨床檢測(cè)，但仍需要嚴(yán)格的操作技術(shù)和昂貴的儀器，不適用于PEDV急性感染的一線臨床檢測(cè)[10-11]。免疫層析技術(shù)具有檢測(cè)快速、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、安全無(wú)污染等特點(diǎn)，適用于臨床快速檢測(cè)，但傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)的準(zhǔn)確性和靈敏度有待提高[12]。熒光免疫層析技術(shù) (LFIA) 是以熒光物質(zhì)為信號(hào)源，建立在層析膜上的基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)技術(shù)將免疫熒光和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)膠體金免疫層系技術(shù)靈敏度較低的不足，且保留了快捷簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、不依賴儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于疾病檢測(cè)、食品安全監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面[13-16]。

本研究以羧基化量子點(diǎn)微球?yàn)闃?biāo)記材料，建立了一種用于PEDV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)，可由養(yǎng)殖人員在現(xiàn)場(chǎng)直接完成PEDV感染的快速篩查，對(duì)及時(shí)制定正確有效的疫病防控措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

鼠抗PEDV單克隆抗體(貨號(hào)：JN1401，批號(hào)：M20201109)購(gòu)于北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG多克隆抗體(貨號(hào)：D111024，批號(hào)：H318AA0001)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜，貨號(hào)：500774047，批號(hào)：S019110264)由德國(guó)Sartorius公司提供；羧基化量子點(diǎn)微球購(gòu)于北京納晶生物科技有限公司；2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)，碳二亞胺(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，牛血清白蛋白(BSA)，硼酸鈉和硼酸由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙和聚氯乙烯(PVC)底板等購(gòu)于上海金標(biāo)生物科技有限公司。

PEDV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和偽狂犬病毒(PRV)，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離保存；腸炎沙門菌(ATCC 14028)購(gòu)于北京保藏生物科技有限公司；大腸桿菌(CMCC(B)44102)和金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)，由中國(guó)微生物菌種保藏中心提供；副溶血弧菌由廣西大學(xué)水產(chǎn)病害實(shí)驗(yàn)室分離保存；豬輪狀病毒(PoRV)和豬丁型冠狀病毒(PDCoV)強(qiáng)陽(yáng)性糞便樣品，由廣西獸醫(yī)研究所收集和提供。

1.2 主要儀器和設(shè)備

ZQ2002微電腦自動(dòng)斬切機(jī)、CTS300XYZ數(shù)控裁條機(jī)和HM3035三維化膜噴金儀由上海金標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)；熒光試紙條讀值儀由北京納諾金生物科技有限公司研制。

1.3 熒光免疫層析試紙條的制備和優(yōu)化

1.3.1 量子點(diǎn)微球標(biāo)記抗體的制備

取25 μL濃度為1 μmol/L的羧基化量子點(diǎn)微球，加入25 μL 20 mmol/L MES(pH=6.0)，混勻后分別加入現(xiàn)配的0.5 μL 20 mg/mL EDC和0.5 μL 20 mg/mL NHS，混勻后超聲5 min，再于37 ℃活化15 min。然后于8 000g離心20 min，棄去上清液。用25 μL 10 mmol/L MES(pH=6.0)重懸沉淀，加入10 μg PEDV抗體，混勻后置于37 ℃避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)后用0.1 mol/L甘氨酸封閉30 min。5 510g離心15 min，棄去上清液后，用50 μL硼酸鹽緩沖液(BB)重懸沉淀，再次離心棄去上清液。用復(fù)溶液(濃度為10 mmol/L的Tris緩沖液，pH=8.5，添加有10%蔗糖、10%海藻糖、0.5% BSA和0.2%吐溫20)重懸沉淀，涂于結(jié)合墊上，37 ℃真空烘干3 h。

1.3.2 熒光免疫層析試紙條的組裝與樣品檢測(cè)

利用接觸式自動(dòng)劃膜儀將鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別包被在NC膜上作為檢測(cè)線及質(zhì)控線，37 ℃烘干3 h。然后將固定有T線和C線抗體的NC膜、噴涂有量子點(diǎn)微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、樣品墊和吸水紙依次粘貼到PVC底板上，并采用數(shù)控裁條機(jī)裁成3.0 mm寬的試紙條。

將60 μL樣品滴加到樣品墊上，室溫放置10 min后，用波長(zhǎng)為365 nm的紫外手電筒觀察結(jié)果。若T線、C線均有條帶出現(xiàn)，判定為陽(yáng)性；若T線沒有條帶，C線有條帶，則判定為陰性；若C線沒有條帶，則判定試紙條無(wú)效，需重新檢測(cè)。

1.3.3 量子點(diǎn)微球標(biāo)記抗體最佳復(fù)溶液體積的確定

將采用25 μL量子點(diǎn)微球體系標(biāo)記好的抗體離心后，分別用150、300、600和900 μL復(fù)溶液重懸后，制備熒光試紙條，并用于樣品的檢測(cè)，根據(jù)試紙條顯色程度確定最佳復(fù)溶液體積。

1.3.4 檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體包被濃度的確定

分別采用0.3、0.5和1.0 mg/mL的鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體包被T線和C線，并以PBST和稀釋后的病毒液上樣，測(cè)試試紙條T線、C線的顯色程度。用不同濃度的抗體劃膜，以相同樣品上樣測(cè)試，以試紙條顯色程度確定T線、C線的劃膜抗體濃度。

1.4 熒光免疫層析試紙條的性能考察

1.4.1 敏感性考察

1.4.2 特異性考察

利用熒光試紙條分別檢測(cè)PoRV(強(qiáng)陽(yáng)性豬糞便樣品)，PDCoV(強(qiáng)陽(yáng)性豬糞便樣品)，PCV2病毒液(1.0×106TCID50/mL)，PRV病毒液(1.0×106TCID50/mL)，沙門菌(1.0×107CFU/mL)，大腸桿菌(1.0×107CFU/mL)，金黃色葡萄球菌(1.0×107CFU/mL)及副溶血球菌(1.0×107CFU/mL)，并設(shè)置PEDV陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，根據(jù)T線熒光信號(hào)判斷試紙條的特異性。

1.4.3 臨床樣品檢測(cè)

分別采用熒光試紙條和RT-PCR對(duì)50份樣品(腸道組織或肛門拭子，由生豬養(yǎng)殖公司和第三方檢測(cè)公司提供)中的PEDV進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率。使用試紙條進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，取臨床樣品1 g，加入1 mL的樣品稀釋液，震蕩混勻后離心，取60 μL上清液滴于樣品墊位置，待10 min時(shí)觀察C、T線顯色結(jié)果及測(cè)定熒光值。對(duì)于RT-PCR，取臨床樣品1 g，加入3 mL PBS，反復(fù)凍融3后，提取核酸，反轉(zhuǎn)錄后分別以5′-AAGGCTCCATCATCTTTACG-3′和5′-ACTCCGATACGAG-TCTAGCG-3′為上下游引物，對(duì)PEDV的N基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 量子點(diǎn)標(biāo)記最佳復(fù)溶液體積的確定

將25 μL羧基化量子點(diǎn)體系標(biāo)記的抗體分別用150、300、600和900 μL復(fù)溶液重懸后涂布于結(jié)合墊上制備試紙條，檢測(cè)PEDV陰性和陽(yáng)性樣品后根據(jù)試紙條顯色程度確定最適復(fù)溶液體積。圖1顯示，各試紙條的C線的熒光顯色均清晰，均無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)，膜面干凈。但從陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用600 μL和900 μL體積的復(fù)溶液會(huì)導(dǎo)致T線不顯色。用150 μL和300 μL復(fù)溶液重懸標(biāo)記抗體制備的試紙條T線清楚，但用300 μL體積復(fù)溶液的試紙條結(jié)合墊比用150 μL體積復(fù)溶液的釋放更全，可得出最佳復(fù)溶液體積為300 μL。

1～4. 復(fù)溶液體積分別為150、300、600和900 μL。

2.2 檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體包被濃度的確定

采用不同濃度的鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別包被T線和C線，并對(duì)陰性樣品和陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)。由圖2和圖3可見，當(dāng)試紙條T線包被濃度為0.5 mg/mL，C線包被濃度為0.3 mg/mL時(shí)，試紙條的顯色清晰，且所耗抗體量少。因此，后續(xù)研究采用的T線包被濃度均為0.5 mg/mL，C線包被濃度均為0.3 mg/mL。

1. T線包被濃度0.3 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；2. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；3. T線包被濃度1.0 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL。

1. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；2. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.5 mg/mL；3. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度1.0 mg/mL。

2.3 敏感性考察

將載毒量為1.0×104TCID50/mL的PEDV病毒液以1∶10、1∶20、1∶30、1∶35、1∶40和1∶50的比例進(jìn)行稀釋后，采用制備好的PEDV熒光試紙條對(duì)PEDV稀釋液進(jìn)行檢測(cè)，平行重復(fù)5次，考察試紙條的靈敏度。根據(jù)圖4試紙條顯色程度，可知當(dāng)病毒以1∶10、1∶20、1∶30和1∶35稀釋時(shí)，T線均顯色清晰；當(dāng)病毒以1∶40和1∶50稀釋時(shí)，T線顯色不清晰，與陰性對(duì)照相似。采用熒光試紙條讀值儀測(cè)定T線熒光值，結(jié)果如表1所示。對(duì)陰性樣品重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果為294，故檢測(cè)閾值確定為336。由表1可見，當(dāng)病毒以1∶50稀釋時(shí)，T線熒光值為369，大于閾值。因此，所制備的熒光試紙條基于肉眼觀察和熒光試紙條讀值儀的檢測(cè)限分別確定為2.9×102TCID50/mL和2.0×102TCID50/mL。

1～6. 病毒液稀釋倍數(shù)為10、20、30、35、40、50；7. 陰性對(duì)照。

表1 試紙條靈敏度試驗(yàn)熒光值

2.4 特異性測(cè)定

使用所制備的熒光免疫層析試紙條對(duì)PoRV、PDCoV、PCV2、PRV、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及副溶血球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。可見，只有檢測(cè)PEDV陽(yáng)性樣品時(shí)，試紙條T線清晰可見；而檢測(cè)其他病原時(shí)，結(jié)果如檢測(cè)陰性樣品一致，均無(wú)T線顯示，說(shuō)明試紙條特異性較好。

1～10. 分別為陰性樣品、PEDV、PoRV、PDCoV、PCV2、PRV、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血球菌。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

分別采用熒光試紙條和RT-PCR對(duì)50份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2結(jié)果，計(jì)算得到的PEDV熒光免疫層析試紙條與RT-PCR的陽(yáng)性符合率為76.2%，陰性符合率為89.7%，總符合率為90.0%，說(shuō)明所制備的PEDV熒光試紙條具有較高的準(zhǔn)確性。

表2 試紙條和RT-PCR臨床樣品檢測(cè)

3 討論

PED主要經(jīng)糞-口傳播，隨糞便排出的病毒可形成氣溶膠顆粒隨空氣進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播感染其他仔豬，最遠(yuǎn)傳播距離可達(dá)10英里[17-18]。PEDV感染后，豬可出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、厭食、脫水和體重減輕等臨床癥狀，哺乳仔豬大量死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染早期的治愈率遠(yuǎn)高于后期，所以PEDV感染的早期診斷對(duì)PED的防控尤其重要[21]。

量子點(diǎn)又稱半導(dǎo)體納米晶體，是一種穩(wěn)定的納米晶粒，具有發(fā)光率高、壽命長(zhǎng)、光穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[22]。近年來(lái)，量子點(diǎn)制備和表面修飾技術(shù)得到了快速發(fā)展，量子點(diǎn)作為熒光探針在生物醫(yī)學(xué)、食品安全等領(lǐng)域中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[22-23]。PEDV熒光免疫層析將免疫熒光和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，在保留膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單、不依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和設(shè)備、快速方便的優(yōu)勢(shì)的前提下，通過(guò)包含有大量量子點(diǎn)粒子的羧基化量子點(diǎn)微球作為標(biāo)記材料，可有效提高試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)PEDV的現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

量子點(diǎn)標(biāo)記抗體時(shí)，使用不同體積的復(fù)溶液會(huì)導(dǎo)致單位體積內(nèi)的量子點(diǎn)量標(biāo)記抗體量的變化，進(jìn)而使每根試紙條上所包含的量子點(diǎn)微球標(biāo)記抗體的含量不同。量子點(diǎn)和標(biāo)記抗體量較少時(shí)，會(huì)影響T、C線的顯色程度，易產(chǎn)生假陰性；量子點(diǎn)和標(biāo)記抗體量較多時(shí)，會(huì)影響量子點(diǎn)的擴(kuò)散，導(dǎo)致較多的量子點(diǎn)留在結(jié)合墊或使膜面不清晰，造成量子點(diǎn)和抗體的浪費(fèi)，甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，對(duì)復(fù)溶液的用量進(jìn)行優(yōu)化能使試紙條檢測(cè)在耗費(fèi)最少的情況下獲得最優(yōu)結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，在25 μL量子點(diǎn)微球標(biāo)記體系下，600 μL以上的復(fù)溶液會(huì)導(dǎo)致T線不顯色，而150 μL以下的復(fù)溶液會(huì)造成釋放不充分，300 μL復(fù)溶液重懸標(biāo)記抗體制備的試紙條T線清楚，釋放完全，膜面干凈。

本研究制備的PEDV量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條，基于肉眼觀察和熒光試紙條讀值儀的檢測(cè)限分別為2.9×102TCID50/mL和2.0×102TCID50/mL。邊紅芬等[24]基于細(xì)胞表面熒光免疫吸附法制備單克隆抗體，研制出一種用于PEDV現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的新型免疫層析方法，最低檢測(cè)限為7.8×103TCID50/mL。王華俊等[25]建立了一種快速、定量檢測(cè)PEDV的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)方法，對(duì)PEDV的最低檢測(cè)限為3 896 997 TCID50/mL。Lyoo等[26]開發(fā)了一種用于PEDV檢測(cè)的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)限為1.0×104TCID50/mL。因此，本研究制備的免疫層析試紙條具有更高的靈敏度，有望用于PEDV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。