金櫻子多糖、車前子多糖和冬葵果多糖體內外抗炎效果比較

彭松，盧炫圻，林芳竹，毛寧寧，于亞明，于琳，施宗傲，王德云*

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 南京中獸醫藥研究中心，江蘇 南京 210018)

炎癥是一種適應性反應，由有害刺激和條件觸發，如果急性炎癥無法調節，則會導致慢性炎癥、自身免疫和過度組織損傷。在一些疾病的臨床治療過程中，往往需要通過抗炎類藥物來阻止炎癥所帶來的損傷[1]。中藥抗炎在近年來已成為一個重要的研究領域，針對一些炎癥疾病，傳統中藥制劑在臨床治療以及試驗研究中均表現出了良好的抗炎功效[2]。多糖作為大多數中藥的主要成分，由重復單糖殘基通過糖苷鍵聚合而成，具有豐富的生物活性，其中多糖抗炎活性研究引起越來越多人的關注[3]。

金櫻子(RosalaevigataMichx)多糖是從薔薇科薔薇屬金櫻子的干燥果實中提取的一種酸性雜多糖，具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤和抑菌抗炎等作用[4]；冬葵果(FructusMalvaepolysaccharide)多糖從錦葵科植物冬葵的干燥成熟果實中提取，含有中性多糖、酸性多糖、肽聚糖和低聚糖，具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用[5]；車前子(PlantaginisSemenGrowth)多糖是從車前子中提取的一種酸性雜多糖，具有整腸通便、調節血糖、降低血脂、抗氧化、抗炎及防治動脈粥樣硬化的作用[6]。因此，本試驗以細胞炎癥模型和小鼠腸道炎癥模型為研究對象，探討金櫻子多糖、車前子多糖和冬葵果多糖的抗炎作用，篩選出抗炎效果最好的多糖，以期為多糖類抗炎劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

5-氨基水楊酸購于上海畢得醫藥科技股份有限公司；金櫻子、車前子、冬葵果藥材購于南京大華中藥店。

1.1.2 細胞系和實驗動物

RAW264.7細胞購于上海紀寧生物科技有限公司。8周齡ICR小鼠購自揚州大學比較醫學中心，在試驗前適應性飼養7 d。所有動物相關試驗均嚴格按照試驗動物福利倫理的要求及南京農業大學IACUC實驗動物護理和使用指南進行。

1.1.3 主要試劑

脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)；RNA反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)；葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量36～50 kDa，美國MP公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，南京奧青生物技術有限公司)；10× PBS 緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；D-無水葡萄糖(分析純，中國藥品生物制品檢定所)；其余試劑均為分析純。

1.1.4 試驗儀器

旋轉蒸發儀SY-5000(上海亞榮生化儀器廠)；冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；離心機(美國Thermo公司)；Multiskan FC酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)

1.2 多糖的提取及含量測定

金櫻子多糖的提取：將干燥的去核金櫻子果肉粉末按質量比1∶5加入95%的乙醇，80 ℃冷凝回流脫除脂質，烘干，加入質量20倍的蒸餾水，95 ℃提取2.5 h，重復3次，收集濾液濃縮，按體積比1∶4與100%乙醇混合，靜置過夜后4 000g離心10 min，收集沉淀，Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1)重復10 次。把沉淀加蒸餾水重新溶解后，透析，凍干，獲得金櫻子多糖。

冬葵果多糖的提取：將冬葵果粉末，按藥材∶石油醚=1∶3(體積比)，60 ℃水浴加熱，回流脫脂；過濾，按濾渣∶乙醇=1∶3(體積比)，80 ℃水浴加熱，回流除醇溶物；過濾，按濾渣∶水=1∶9(體積比)，80 ℃提取2 h，提取3 次，合并濾液，濃縮至原來體積的1/4。在濾液中加入一定量無水乙醇至最終醇濃度為80%，進行醇沉，收集沉淀，揮發有機溶劑，蒸餾水溶解，按Sevage試劑∶多糖溶液=1∶3(體積比)，除蛋白，重復10 次，離心取水相，透析，凍干，得到冬葵果多糖。

車前子多糖的提?。簩⒏稍锏能嚽白佑?0%乙醇浸泡24 h，濾渣乙醇。干燥后，加入10倍體積蒸餾水，沸水浴回流提取3 h，重復3 次，離心，合并濾液，濃縮至濾液體積的1/5。濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度達80%，4 ℃醇沉過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，蒸餾水溶解，Sevage法除蛋白，重復10 次，透析，醇沉，凍干，得精制車前子多糖。

所有多糖均采用硫酸-苯酚法測定多糖含量，以葡萄糖為基準物質，校正系數為0.999 7。測得金櫻子多糖含量為78.9%，車前子多糖含量為68.1%，冬葵果多糖含量為77.4%。

1.3 RAW264.7細胞存活率的測定

取處于對數生長期的RAW264.7細胞，接種到96孔板中，每孔100 μL，細胞密度約為5×105個/mL，在37 ℃和5%的CO2條件下培養12 h。在處理組中加入不同濃度的多糖溶液(31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL)，培養24 h，加入MTT溶液(5 mg/mL)，培養4 h，在490 nm處測量吸光度。細胞存活率=藥物組OD值/空白組OD值×100%。

1.4 細胞上清液中NO、IL-6、TNF-α、IL-1β含量的測定

取處于對數生長期的RAW264.7細胞，接種到24孔板中，每孔1 mL，細胞密度約為5×105個/mL，在培養箱中培養過夜。加入不同濃度的多糖溶液(500、250、125 μg/mL)，2 h后，加入LPS(1 μg/mL)培養24 h。收集細胞上清液，用Griess方法測量上清液中的NO含量。根據ELISA試劑盒說明書，測定細胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。

1.5 細胞因子mRNA表達量的測定

同1.3方法處理細胞后，根據試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在NCBI數據庫中檢索相關基因序列，使用Primer 6.0設計引物(引物由北京擎科生物技術有限公司合成)，基因引物如表1。配置10 μL體系，包括2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL、前引物0.4 μL、后引物0.4 μL、50×ROX Reference Dye2為0.4 μL、cDNA模板1 μL，無菌雙蒸水7.8 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，4 ℃終止反應。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt計算基因表達的相對量。

表1 相關基因引物

1.6 動物模型構建及分組

ICR小鼠適應性飼養1周后，平均分為6組，每組6只，分別為空白對照組，模型組(葡聚糖硫酸鈉，DSS)，陽性藥組(5-氨基水楊酸)，金櫻子多糖組，車前子多糖組和冬葵果多糖組。試驗期間除空白對照組給予蒸餾水外，其余各試驗組均給予5% (重量/體積)，DSS飲水，連續飲用7 d。同時各治療組每天分別灌服5-氨基水楊酸(200 mg/kg)或某種多糖(200 mg/kg)，空白組與模型組灌服等量生理鹽水，持續7 d。

1.7 疾病活動指數(DAI)評分和結腸長度測定

參考文獻[7]進行DAI評分。評分標準包括：體重減輕評分，糞便成型程度和糞便隱血程度。具體來說，體重無明顯減輕計為0分；減輕1%～5%計為1分；減輕5%～10%時計為2分；減輕10%～15%則計為3分；減輕15%以上計為4分。糞便呈正常顆粒狀計為0分；當糞便稍松軟時計為1分；糞便呈中度松軟時計為2分；當糞便不成形時計3分；呈水樣糞便時則計為4分。通過糞便潛血試驗檢測，當糞便潛血試驗為陰性時計0分；糞便檢測弱陽性時計1分；當糞便呈隱血陽性時計2分；糞便隱血試驗檢測結果呈強陽性時計3分；若肉眼可見小鼠明顯血便則計4分。三者相加即為DAI評分。

末次給藥后，禁食不禁水24 h，麻醉小鼠后采集全段結直腸，測量結直腸長度。

1.8 結腸病理組織學觀察

采集小鼠結腸組織置于4%多聚甲醛固定，用石蠟包埋并切片，HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。組織病理學評分則通過評價炎癥、黏膜損傷和腺體損傷程度進行評分，三者評分之和進行計算。具體評分細則如下：炎癥程度不明顯計為0分；輕度計為1分；中度計為2分；重度計為3分。黏膜損傷程度不明顯計為0分；損傷在黏膜層計為1分；損傷到達黏膜下層計為2分；損傷到達肌層和漿膜層計為3分。腺體損傷程度不明顯計為0分；少量腺體擴張計為1分；多灶性腺體擴張計為2分；部分腺體消失計為3分。

1.9 結腸組織中炎性細胞因子的檢測

稱取結腸組織，加入5倍體積PBS(含1% PMSF)，充分研磨，離心，收集上清液，-20 ℃保存。根據ELISA試劑盒說明書，測定結腸組織中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10的濃度。

1.10 數據統計與分析

試驗數據用Excel初步整理計算，用SPASS 18.0進行分析，設定P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異，用GraphPad Prism 9.0軟件作圖，結果均以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 多糖對RAW264.7細胞存活率的影響

如圖1所示，當3種多糖濃度≤1 mg/mL時，各組細胞存活率與空白組無顯著性差異(P>0.05)，安全性好?？梢钥闯鲈?00 μg/mL時均有增殖趨勢，故3種多糖均選擇濃度為500、250和125 μg/mL進行后續細胞試驗。

注：與空白組相比，***表示P<0.001；ns表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 多糖對LPS誘導的RAW264.7細胞上清液中炎性介質含量的影響

如圖2所示，與空白組相比，LPS組NO、IL-6、TNF-α和IL-1β含量極顯著增高(P<0.001)；與LPS組相比，金櫻子多糖組在濃度為500 μg/mL時，可極顯著降低NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量(P<0.01)，250 μg/mL時可顯著降低NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05)；車前子多糖組在濃度為500 μg/mL時，可顯著降低NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05)；冬葵果多糖不同劑量組有降低趨勢，但與LPS組相比無顯著性差異(P>0.05)。

注：與LPS組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下同。

2.3 多糖對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌細胞因子mRNA含量的影響

如圖3所示，與空白組相比，LPS組顯著提高了炎性細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的 mRNA的表達量(P<0.001)。與LPS組相比，3種多糖都不同程度地抑制了促炎細胞因子的表達。金櫻子多糖組在濃度為500 μg/mL時，能夠極顯著抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達量(P<0.001)，在濃度為250 μg/mL時，能夠極顯著抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達量(P<0.01)；車前子多糖組在濃度為500 μg/mL時，能夠顯著抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α的mRNA的表達量(P<0.05)；冬葵果多糖不同劑量組有抑制促炎細胞因子mRNA表達的趨勢，但與LPS組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 多糖對細胞因子IL-6(A)、TNF-α(B)和IL-1β(C)基因mRNA表達水平的影響

2.4 多糖對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠DAI評分和結腸長度的影響

試驗期間通過檢測小鼠體重變化、糞便性狀、便血情況對各組小鼠進行疾病活動指數評分。結果表明，從造模第4天開始，除空白組外，其余試驗組小鼠體重下降、便血，至第7 天，DSS組仍有明顯便血，而使用5-氨基水楊酸和3種多糖治療后，便血情況有不同程度的緩解，以此進行DAI評分。如圖4 A所示，與空白組小鼠相比，DSS組小鼠DAI評分在試驗期間升高。與DSS組相比，金櫻子多糖組和陽性藥組的DAI評分顯著下降(P<0.05)，而車前子多糖組和冬葵果多糖組呈下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。如圖4B所示，與空白組相比，DSS組小鼠的結腸長度顯著縮短(P<0.001)，而金櫻子多糖和陽性藥治療后可極顯著緩解DSS引起的結腸長度縮短(P<0.01)，車前子多糖可顯著緩解DSS引起的結腸長度縮短(P<0.05)，冬葵果多糖有緩解趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。

注：與DSS組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下同。

2.5 多糖對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸病理組織學評分的影響

如圖5所示，與空白組小鼠相比，DSS組小鼠結腸黏膜上皮破損嚴重，腺體排列不規則甚至消失，炎性細胞浸潤和隱窩大量缺失，組織病理學評分顯著升高。與DSS組相比，多糖組和陽性藥組的小鼠結腸組織整體結構較正常，黏膜下層水腫和炎性細胞浸潤減少，腸黏膜和腺體更清晰。如圖6所示，與DSS組相比，金櫻子多糖組和陽性藥組的結腸病理組織學評分極顯著降低(P<0.001)，車前子多糖組的結腸病理組織學評分顯著降低(P<0.05)，而冬葵果多糖組的結腸病理組織學評分有降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。

A. 空白組；B. 模型組；C. 陽性藥組；D. 金櫻子多糖組；E. 車前子多糖組；F. 冬葵果多糖組；黑色箭頭代表炎性細胞浸潤，紅色箭頭代表隱窩。

圖6 小鼠結腸組織病理學評分

2.6 多糖對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸細胞因子分泌的影響

如圖7所示，與空白組相比，DSS組小鼠結腸組織中IL-6、TNF-α及IL-1β的含量極顯著升高(P<0.001)，IL-10顯著降低(P<0.05)。與DSS組小鼠相比，金櫻子多糖組和陽性藥組IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-10含量均表現出極顯著差異(P<0.001)；車前子多糖組的IL-6和IL-10含量表現出極顯著性差異(P<0.01)，TNF-α和IL-1β含量表現出顯著性差異(P<0.05)。冬葵果多糖組的細胞因子含量與DSS組相比表現出差異，但差異不顯著性(P>0.05)。

圖7 多糖對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織細胞因子分泌的影響

3 討論

炎癥是一種復雜的免疫反應，可保護器官免受感染和組織損傷。受控的炎癥反應對宿主有益，可清除宿主組織中免疫刺激并恢復正常生理功能。然而，細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的上調可誘導血管內皮細胞外的黏附因子表達，導致中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞募集，然后從血管中移出到損傷組織，促進炎癥的發生[8]。IL-10可以阻止活化的巨噬細胞釋放炎癥介質，從而緩解炎癥[9]。

多糖是許多植物的主要成分之一，已被證實具有免疫增強、抗炎、抗腫瘤和神經保護活性。金櫻子多糖是從中藥金櫻子(性平，味酸、甘、澀，歸腎經、膀胱經、大腸經)中提取，由阿拉伯糖(26.5%)、鼠李糖(7.6%)、木糖(3.5%)、甘露糖(0.9%)、半乳糖(31.9%)、葡萄糖(5.7%)和半乳糖醛酸(23.9%)組成[10]；冬葵果多糖是從蒙藥冬葵果(性涼，味甘、澀，歸大腸經、小腸經、膀胱經)中提取，主要由阿拉伯糖(18.75%)、半乳糖(37.5%)和葡萄糖(43.75%)組成[11]；車前子多糖是從中藥車前子(性寒，味甘，歸腎經、肝經、肺經、小腸經)中提取，主要由木糖(56.7%)、阿拉伯糖(21.6%)、半乳糖(3%)、葡萄糖和半乳糖醛酸(18.4%)等組成的酸性雜多糖[12]。研究表明[13]，植物多糖可以用作天然抗炎藥，其通過對趨化因子、黏附因子表達和相關酶活性的抑制，調節細胞因子的生成，從而影響白細胞向炎癥部位的募集、黏附以及滲出，達到抗炎效果。

本研究的體外試驗通過MTT法確定3種多糖的安全濃度范圍(≤1 mg/mL)，并選擇細胞最佳生長濃度，在LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型中進行體外抗炎作用的探討。結果表明，LPS可顯著提高NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量以及促炎細胞因子mRNA的表達，說明體外炎癥模型成功。同時，在多糖濃度為500 μg/mL，金櫻子多糖對炎性介質表達的抑制作用強于車前子多糖和冬葵果多糖；在多糖濃度為250 μg/mL時，只有金櫻子多糖有顯著抑制炎性介質表達，提示金櫻子多糖的體外抗炎效果優于車前子多糖和冬葵果多糖。體內試驗基于中藥的歸經，選擇DSS誘導的潰瘍性結腸炎模型探討3種多糖的體內抗炎作用，結果表明，以相同濃度的3種多糖干預小鼠潰瘍性結腸炎模型后，相較于車前子多糖和冬葵果多糖，金櫻子多糖可明顯提高結腸長度，IL-10含量，降低DAI評分，促炎細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)含量，保護結腸組織完整性。提示金櫻子多糖有最佳的抑制炎癥發生的效果，改善結腸炎狀況。據報道[14]，糖醛酸的含量對多糖的抗炎活性有很大的影響，高糖醛酸含量的多糖具有更強的抗炎活性。金櫻子多糖中的糖醛酸含量占比高于車前子多糖和冬葵果多糖，推測金櫻子多糖的抗炎活性強于車前子多糖和冬葵果多糖可能與其高糖醛酸含量有關，此論點需進一步試驗驗證。

綜上所述，本研究提取了3種植物多糖，借助體內、體外炎癥模型初步探討并對比了其抗炎作用。結果表明，金櫻子多糖能通過下調體內外模型炎性介質的水平發揮較好的抗炎作用，為多糖類抗炎劑的研發和防治潰瘍性結腸炎的發生提供了試驗依據。