玉米ACO基因家族生物信息學及表達模式分析

王程澤，張燕，付偉，賈京哲，董金皋，申珅，郝志敏

玉米基因家族生物信息學及表達模式分析

1河北農業大學生命科學學院/華北作物改良與調控國家重點實驗室/河北省農業微生物生物信息利用技術創新中心/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北保定 071000；2邯鄲學院，河北邯鄲 056005

【目的】對玉米1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶基因家族進行全基因組鑒定，分析其在玉米不同器官和不同發育時期以及響應外源激素和病菌侵染中的表達模式，為明確玉米基因家族功能打下基礎。【方法】利用生物信息學方法，在玉米B73自交系基因組中鑒定，對其基因結構、蛋白質理化性質、家族成員間的親緣關系以及保守基序進行分析，利用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）技術分析基因家族的表達模式。【結果】除ZmACO11外，ZmACO家族成員均具有Fe2+離子結合位點和底物抗壞血酸結合位點。系統發育分析顯示，與在同一分支，親緣關系較近，Bootstrap值達98。基因表達分析表明，、、、在各發育時期均活躍表達，且在葉片中呈優勢表達，因此選擇上述6個基因進行下一步檢測。噴施乙烯利后，上述6個基因的表達均有所波動，其中的表達量受影響較大，變化幅度在8倍左右。在乙烯利處理的0—24 h內這6個基因的表達量存在波動，但在處理后24 h，6個基因的表達量均接近0。水楊酸處理后，的表達量受影響較大，變化倍數在2倍左右。其他基因的表達量在處理后24 h均接近0。、在3—12 h的表達量存在波動，、、表達量呈下調趨勢。在響應生物脅迫方面，接種玉米大斑病菌（）后，的表達量變化幅度最大，在接種后第10天，這兩個基因的表達量分別升至對照組的50和60倍。接種玉米小斑病菌（）后，的表達量變化幅度較大，變化倍數在40—90倍。接種立枯絲核菌（）后，、表達量變化幅度最大，在病菌接種的第3天達到200倍。【結論】、、、在玉米生長發育過程中表達變化最活躍；施加外源乙烯利和水楊酸可以對的表達水平造成顯著影響。病菌侵染玉米后的表達水平產生顯著變化，與生物脅迫應答關系密切。

玉米基因家族；實時熒光定量PCR；基因表達；乙烯利；水楊酸；玉米大斑病菌；玉米小斑病菌；立枯絲核菌

0 引言

【研究意義】玉米（）是世界上重要的糧食作物之一。生物與非生物脅迫是影響玉米健康生長的主要問題，提高其抗逆能力已成為玉米產業提質增效的迫切需求[1]。乙烯是在植物中第一個發現的氣體激素，其調控植物種子休眠、萌發、開花、營養生長、果實成熟和葉片衰老等生理過程[2-3]，在抵御生物和非生物脅迫中也發揮重要作用[4]。在高等植物中，乙烯的生物合成前體是甲硫氨酸，在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）催化下合成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），在1-氨基環丙烷-1-羧酸合酶（ACS）作用下合成1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC），最后經過1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）催化生成乙烯[5]。ACO是非血紅素鐵離子氧化酶家族中的一員，是乙烯生物合成途徑中的限速酶[6]。明確在玉米響應逆境脅迫中的表達模式，可加深對乙烯與玉米抗病性之間關系的理解，為挖掘玉米抗性資源打下基礎。【前人研究進展】ACO最初由Mattoo等發現，并將其命名為乙烯形成酶（EFE）[7]。后續研究發現ACO起作用時需要抗壞血酸鹽和O2作為輔助底物，同時還需要Fe2+和CO2作為輔助因子，所以更名為ACO（ACC氧化酶）[8]。首次被克隆是在番茄（）中[9]，隨后，在桑樹（）、甜瓜（）、煙草（）、擬南芥（）等多種植物中也被克隆，并開展了的全基因組鑒定、表達以及生物學特性的分析[10-11]，但這些研究主要圍繞果實開展。在楊樹（）中過表達可導致楊樹幼苗變矮[12]。在棉花（spp.）中發現表達上調誘導棉花纖維細胞的伸長[13]。對旱柳（）的研究證實，在林木莖的生長中發揮著至關重要的作用[14]。有研究表明，ACO是由多基因家族編碼，不同成員在植物的時空表達、轉錄和翻譯水平上呈現出差異[15]。菠蘿（）、蜻蜓鳳梨（）均可受外源乙烯利的誘導[16-17]。桑樹的表達量可在NaCl、ABA和SA處理以及機械損傷后上調[18]。甜瓜和8在授粉后30 d的表達量比授粉后10 d明顯上升[19]。煙草啟動子區含有激素反應、低溫反應、抗性和脅迫反應、損傷反應和干旱誘導等不同種類的順式作用元件。玉米基因家族成員啟動子區存在植物激素調控元件和逆境脅迫相關元件，黏蟲取食玉米后，玉米基因家族成員的表達水平會產生變化[20]。煙草、西來稗（）在二氯喹啉酸誘導后呈現不同程度的上調表達[21-22]。0.01 g·L-1的SA處理會抑制杏（）果實貯藏期間的ACO活性[23]。灰葡萄孢（）侵染番茄果實會使其乙烯產量快速增加，ACO活性升高，表達水平也會升高[24]。香蕉（）被枯萎病菌侵染后，在感染初期（3 h）的表達量急劇升高，且抗病植株中的表達量比感病植株的低[25]。但目前關于玉米的家族基因功能，尤其是其在玉米響應生物脅迫中的作用仍知之甚少。【本研究切入點】大量研究表明，ACO蛋白是一個家族蛋白，同一植株中有多種ACO蛋白，它們存在時空差異性，在植物生長發育的不同時期行使著不同功能。的啟動子區存在不同種類的順式作用元件，包括激素反應、脅迫反應及損傷反應等。乙烯是植物響應生物脅迫的重要信號分子，植物在受到病菌侵害時，其體內與乙烯合成的相關酶基因表達水平也會產生變化[26-27]。目前對玉米基因家族與生物脅迫響應之間的關系未見系統研究。【擬解決的關鍵問題】利用生物信息學方法明確玉米B73自交系基因家族的組成及各基因與其編碼產物的結構特征、理化性質；分析基因家族在玉米生長發育過程中的表達模式，明確外源信號物質以及病菌侵染對表達的影響，為解析基因家族在響應生物脅迫中的功能提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2023年在河北農業大學生命科學學院/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室完成。

1.1 供試材料

玉米B73自交系、玉米大斑病菌（）、小斑病菌（）、立枯絲核菌（）均由河北省植物生理與分子病理學實驗室保存。

1.2 ZmACO家族基因生物信息學分析

從玉米基因組數據庫（http://ensembl.gramene.org/ Zea_mays/Info/Index）提取家族基因信息，經過篩選鑒定其家族成員。利用NCBI進行同源比對，整理氨基酸序列。利用MEGA-X構建系統發育樹。利用DNAMAN進行序列比對，對ZmACO蛋白進行保守基序分析。利用ExPASy（http://web.expasy.org/ protparam/）對ZmACO的分子量、理論等電點、氨基酸長度等進行預測分析。

1.3 ZmACO家族基因組織/器官表達分析

通過玉米基因組數據庫查詢玉米生長發育時期不同器官和組織中家族基因的表達量，其中包括授粉后20、38 d的胚，授粉后12 d的胚乳，授粉后27 d的胚乳頂端、果皮和糊粉層，2—4和6—8 mm的穗原基，6—7和7—8節間，16—19 d的營養分生組織，播種后2 d的萌發種子，葉片對稱區，葉片氣孔區，幼嫩葉片，成熟葉，5 d的初生根、根皮層、根伸長區和根分生區，7—8 d的次生根，成熟花粉，雌花小穗，穗絲，利用MeV 4.9.0繪制熱圖。

1.4 ZmACO家族基因在外源乙烯利和水楊酸處理下的表達分析

挑選顆粒飽滿的玉米種子，種于花盆（蛭石﹕營養土=1﹕3），定期澆灌營養液。利用乙烯利和水楊酸處理玉米，其中乙烯利濃度為300 mg·L-1，水楊酸濃度為1.0 mmol·L-1。在玉米3—6葉期進行噴霧處理，分別在處理后3、6、12、24 h取玉米葉片，將樣品在液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存。利用Trizol試劑盒提取處理好的玉米樣品總RNA，采用UEIrisII RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis（with dsDNase）反轉錄試劑盒合成cDNA。

利用NEBuilder（https://nebuilderv1.neb.com/）設計引物（表1），選擇作為內參基因，以經過乙烯利和水楊酸處理的玉米組織cDNA為模板，使用Super Eva Green? qPCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR擴增（表2），采用美國Bio-Rad CFX96 TouchTM型熒光定量PCR系統進行試驗。每組重復3次，采用Excel 2010和GraphPad Peism8繪制圖表。

1.5 病菌侵染過程中ZmACO家族基因的表達模式分析

玉米長至6葉期，分別將玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、立枯絲核菌的菌盤置于玉米不同植株同一位置的葉片上，保濕24 h。分別取處理前（0 d）、處理后1、2、3、5、7和10 d的葉片，保存于-80 ℃冰箱中。參考方法1.4合成cDNA，進行表達模式分析。

表1 實時熒光定量PCR所用引物序列

表2 qRT-PCR反應體系

2 結果

2.1 ZmACO家族基因的獲取

從玉米基因組數據庫提取到16個。對其基因結構及蛋白質理化性質分析表明，該家族基因開放閱讀框（ORF）長度介于372—1 599 bp，最短，最長，對應的編碼產物長度為123—376 aa，蛋白相對分子質量為13 700.64—40 606.00 Da，不同成員的理論等電點介于4.89—9.52（表3）。

2.2 ZmACO基因家族的生物信息學分析

進化關系分析表明與、、的親緣關系較近，、、、、、與親緣關系較近。與在同一個分支中，親緣關系很近。和的氨基酸序列相似度為100%（圖1）。通過對ZmACO的結構域進行分析，發現除ZmACO11以外，其他蛋白均存在兩個保守結構域，分別為Fe2+離子結合位點和底物抗壞血酸結合位點。

2.3 玉米不同發育時期、不同器官/組織中ZmACO家族基因的表達規律

利用玉米數據庫搜集玉米不同發育時期的胚、胚乳、穗原基、節間、種子、葉、根等器官/組織中基因家族的表達量（圖2），結果顯示基因家族中的、、、在多個器官中均有不同程度表達，且表達量高于其他家族成員。在播種后2 d的萌發初期種子中表達量最高，在6—7、7—8節間、16—19 d的營養分生組織和幼嫩葉片中表達量較高，在穗原基和授粉后20 d的胚中表達量較高。在播種后2 d的種子、成熟葉和5 d的根皮層中表達量較高。在穗原基、授粉后27 d的果皮和糊粉層、雌花小穗和穗絲中表達量較高。在授粉后27 d的果皮和糊粉層、成熟的葉片和穗絲中表達量較高。在穗絲中表達量較高。在授粉后27 d的果皮和糊粉層和成熟葉片中表達量較高。在授粉后12 d的胚乳、授粉后27 d的胚乳頂端、果皮和糊粉層中存在表達。僅在根的不同發育階段存在極微弱表達。在穗原基中存在很低的表達。

圖1 ZmACO與其他植物ACO系統發育樹

表3 ZmACO家族基因及編碼產物信息

1：6—7節間6-7 Internode；2：7—8節間7-8 Internode；3：16—19 d的分生組織Meristem at 16-19 d；4：2—4 mm的穗原基Ear primordium of 2-4 mm；5：6—8 mm的穗原基Ear primordium of 6-8 mm；6：授粉后20 d的胚Embryo at 20 d after pollination；7：授粉后38 d的胚Embryo at 38 d after pollination；8：授粉后12 d的胚乳Endosperm at 12 d after pollination；9：授粉后27 d的胚乳頂端Endosperm crown at 27 d after pollination；10：播種后2 d的萌發種子Germination kernels at 2 d after seeding；11：授粉后27 d的果皮和糊粉層Pericarp/aleurone at 27 d after pollination；12：葉子對稱區Leaf zone 1 (symmetrical)；13：葉子氣孔區Leaf zone 2 (stomatal)；14：幼嫩葉片Leaf zone 3 (growth)；15：成熟葉片Mature leaf 8；16：5日齡的初生根Primary root at 5-day-old；17：5日齡的根皮層Root cortex at 5-day-old；18：5日齡的根伸長區Root elongation zone at 5-day-old；19：5日齡的根分生區Root meristem zone at 5-day-old；20：7—8日齡的次生根Secondary root at 7-8-day-old；21：成熟花粉B73 mature pollen；22：雌花小穗Female spikelet；23：穗絲Silk

2.4 乙烯利和水楊酸處理下ZmACO家族基因表達量

使用乙烯利、水楊酸處理玉米，選擇在玉米生長發育過程中表達較活躍的6個基因（、、、、、）進行表達模式分析（圖3）。以處理后0 h的基因表達量為對照，在乙烯利處理下，在0—3 h表達量呈上調趨勢，3—6 h顯著下調，在6—12 h表達量呈現上調趨勢，高于對照的表達量，在12—24 h表達量顯著下調，達到最低；、在0—6 h表達量呈現上調趨勢，之后6—24 h呈現下調趨勢，在24 h時達到最低，接近0。、表達量在0—6 h呈現下調趨勢，6—12 h上調，12—24 h下調，在24 h表達量接近0。在水楊酸處理下，、、的表達量呈下調趨勢。、的表達量在3—12 h存在波動，但總體呈現下調趨勢。的表達量在0—3 h上調，3—12 h下調，12—24 h上調。

圖3 乙烯利和水楊酸處理后ZmACO表達量變化

2.5 病菌侵染下ZmACO基因家族表達模式

根據病菌接種部位，選擇在玉米葉片高表達的、、、、、進行實時熒光定量PCR分析（圖4）。以處理后0 d的基因表達量為對照。接種大斑病菌后，、、、、的表達量波動幅度較大，均在接種1 d時表達量上升；在接種5 d時表達量較低，之后逐漸上升，在第10天達到最高水平；、在接種第3天表達量較低，然后開始上升，在第10天達到最高水平；的表達量變化趨勢不明顯，在接種后表達量便達到處理前的20倍，后續變化幅度不大。接種小斑病菌后，的表達量存在波動，無明顯變化趨勢，但病菌接種后表達量比對照組的表達量高9—90倍；的表達量在病菌接種后0—7 d呈上升趨勢，第10天的表達量均降低，的降低程度極大；的表達量總體呈下降趨勢，但在0—2和3—5 d呈微弱的上升趨勢；的表達量在0—1 d呈上升趨勢，之后的變化趨勢與大斑病菌接種后的變化趨勢相似，總體呈波動趨勢但變化幅度不大。接種立枯絲核菌后、、、、、的變化趨勢相似，在0—3 d呈上升趨勢，3—10 d呈下降趨勢，表達量均在第3天達到峰值。

圖4 病菌侵染后ZmACO表達量變化

3 討論

3.1 ZmACO在不同組織和器官中的表達規律

是一個多基因家族，其表達具有時空特異性，在不同組織、器官以及不同生長發育時期，基因的表達量存在差異。通過研究基因的表達規律可以揭示生物體內在的生長發育規律和分子調控機制，為研究玉米抗病及生產調控提供幫助。

早期關于的研究多圍繞植物的果實成熟調控開展。后續研究逐漸發現，的表達存在于植物整個生長發育周期。黃瓜存在5個，與性別分化相關，在花發育時期基本不表達[28-29]。在蘋果中發現了3個家族成員，的表達局限于果實，在蘋果的幼葉和幼芽中具有表達優勢，在成熟果實中幾乎不表達[30]。在桃的基因組中發現了2個，在成熟果實中表達量高，僅在果實發育初期表達[31]。在甘蔗中有3個，主要在根表達，在葉和根表達，主要在葉中表達[32]。對玉米進行編輯會導致發育的穗中乙烯產量減少，并促進分生組織和花的發育，從而使雜交系的每穗產量增加約13.4%[33]。上述研究表明基因家族成員的表達存在著明顯的時空差異性，其在植物整個生長發育過程中均發揮著重要作用。本研究中，玉米B73自交系16個基因家族成員在不同組織和器官中表達量差異明顯。其中大部分成員在玉米根的分生區、初生生長和次生生長的根中表達，以表達量較高，這3個基因還在授粉后的胚中表達活躍，推測其主要參與調控玉米幼嫩組織的發育成熟；則在穗原基和穗絲中表達量較高；主要在成熟葉片中表達。對這些基因表達的時空特點進行分析可為后續對其功能研究提供有力支持。

3.2 ZmACO對外源乙烯利和水楊酸處理的響應

乙烯利又稱2-氯乙基磷酸，可以釋放乙烯，從而發揮作用[34]。有研究表明，乙烯信號途徑和水楊酸信號途徑可以互相協同加速擬南芥葉片的衰老[35-36]，并且乙烯和水楊酸信號途徑在對植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫中發揮重要作用[37-38]。和的表達受到乙烯利的誘導[17]。水楊酸處理后表達上調[18]，但是在杏、蘋果、桃中則表現為抑制ACO酶活性或基因表達[23,27,31]。對啟動子區順式作用元件分析顯示，其含有植物激素調控元件和逆境脅迫相關元件[20]。因此，本研究分析了在乙烯利和水楊酸處理下的表達模式，發現乙烯利處理早期，可顯著誘導表達，但隨處理時間的延長，的表達量逐漸降低。而水楊酸處理后，、、、、的表達受到顯著抑制，說明玉米中的水楊酸信號途徑可能也對乙烯的生物合成具有抑制作用。

3.3 病菌侵染對ZmACO表達的影響

乙烯不僅是促進果實成熟、葉片衰老等一般的植物激素，更是重要的植物防衛激素。植物在受到病菌侵染時，會誘導乙烯的生物合成，進而通過信號傳遞，使下游抗病基因被誘導表達[39]。植物響應病菌侵染中的表現研究相對較少。水稻矮縮病毒會使過表達，導致水稻發病更加嚴重，而沉默水稻對矮縮病毒的抵抗能力變強。因為SAM為乙烯生物合成的底物，過表達使SAM含量增加，進而使水稻乙烯的產生量增加，從而使水稻抵抗矮縮病毒的能力減弱。將乙烯信號通路阻斷，可顯著增強水稻對矮縮病毒的耐受性[26]。這些證據表明的表達可以對生物脅迫作出響應。本研究采用的3種病菌均為半活體營養型真菌，被檢測的6個基因在玉米響應病原真菌侵染過程中表達量均產生變化，其中表達量在3種病菌接種后均發生顯著變化。而則在立枯絲核菌侵染中表達變化活躍，對玉米大斑病菌侵染有響應。此外，、對玉米大斑病菌侵染的響應相對滯后。推測參與玉米對病原真菌的響應過程，但可能存在不同的調控機制，后續將針對這些基因進行進一步的功能驗證。

4 結論

在玉米B73自交系的基因組數據庫中鑒定出16個。的表達具有明顯的時空特異性。的表達受乙烯利影響最大，的表達受水楊酸影響最大。同時也參與玉米對病原真菌侵染的響應過程。

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Bioinformatics and expression pattern analysis of maizegene family

WANG ChengZe1, ZHANG Yan1, FU Wei2, JIA JingZhe1, DONG JinGao1, SHEN Shen1, HAO ZhiMin1

1College of Life Science, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/ Hebei Bioinformatic Utilization and Technological Innovation Center for Agricultural Microbes/Hebei Key Laboratory of Plant Physiology and Molecular Pathology, Baoding 071000, Hebei;2Handan College, Handan 056005, Hebei

【Objective】The objective of this study is to perform the genome-wide identification of the maize(1-aminocyclopropane- 1-carboxylate oxidase) gene family, analyze its expression patterns in different organs and developmental stages of maize, as well as in response to exogenous hormones and pathogen infection, and to lay the foundation for clarifying the function of the maizegene family.【Method】Using bioinformatics methods, thewas identified in the genome of maize B73 inbred line, and its gene structure, protein physicochemical properties, phylogenetic relationships among family members, and conserved motifs were analyzed. The expression patterns of thegene family were analyzed using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) technology.【Result】Except for ZmACO11, all members of the ZmACO family have Fe2+binding sites and substrate ascorbic acid binding sites. The phylogenetic tree showed thatandare in the same branch and have a close genetic relationship, with a Bootstrap value of 98. The gene expression analysis indicated that,,,,andwere actively expressed at various developmental stages and exhibited dominant expression in leaves, so the six genes mentioned above were selected for the next step of testing. Spraying ethephon resulted in fluctuations in the expression of all six genes mentioned above, the expression level ofwas significantly affected, with a variation multiple of about 8 times. The expression levels of these six genes fluctuated within 0-24 h of ethephon treatment. But after 24 h of treatment, all gene expression levels were close to 0. After salicylic acid treatment, the expression level ofwas significantly affected, with a variation multiple of about 2 times. The expression levels of other genes were close to 0 at 24 h after treatment. The expression levels of,fluctuated between 3 to 12 h, and the expression levels of,,showed a downward trend. In response to biological stress, the expression levels of,showed the greatest changes after inoculation with the, and on the 10th day after inoculation, the expression levels of these two genes increased by 50 and 60 times, respectively, compared to the control group. After inoculation with the, the expression level ofchanged significantly, with a variation multiple of 40-90 times. After inoculation with, the expression levels of,showed the greatest changes, reaching 200 times on the 3rd day of inoculation.【Conclusion】The expression changes of,,andare most active during the growth and development of maize; The application of exogenous ethephon and salicylic acid can significantly affect the expression level ofgenes. The expression level ofgenes significantly changes after bacterial infection in maize, which is closely related to the response to biological stress.

maizegene family; qRT-PCR; gene expression; ethephon; salicylic acid;;;

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.07.008

2023-10-31；

2023-12-09

河北省自然科學基金（C2021204112）、河北省省級科技計劃（23567601H）、國家玉米產業技術體系（CARS-02）

王程澤，E-mail：2060848550@qq.com。張燕，E-mail：2419298400@qq.com。王程澤和張燕為同等貢獻作者。通信作者郝志敏，E-mail：haozhimin@hebau.edu.cn。通信作者申珅，E-mail：shenshen0428@163.com

（責任編輯 岳梅）