右旋糖酐/蠶豆蛋白復合體系的流變及功能特性

陳玉春，湯回花，李欣憶，陳駿飛，劉畢琴，闞歡，史巧*

（1.西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223）

蛋白質具有良好的增稠、膠凝、乳化、發(fā)泡、持水和持油等功能特性，為人類提供多種氨基酸，可以作為營養(yǎng)補充劑和功能性食品的成分[1]。近年來，由于植物基食品的興起，植物蛋白已成為國內外的研究熱點。蠶豆具有蛋白質含量高（29%），營養(yǎng)豐富等特點被視為一種有價值的蛋白質來源，可作為功能性食品配料或營養(yǎng)補充劑[2]。蠶豆蛋白（faba bean protein isolate，F(xiàn)PI）主要由球蛋白組成，其氨基酸均衡，含有生物活性物質[3]。球蛋白含量過高會導致蛋白質的溶解性差[4]，而蠶豆蛋白由于球蛋白含量高，溶解性低，導致其功能特性差，因而在食品中的應用受到限制[5]。

多糖可以改善蛋白質的性質，是由于多糖加入蛋白體系中可以增加其黏度，阻止或延遲蛋白質顆粒沉淀[6]。Razi 等[7]研究發(fā)現(xiàn)羅勒籽膠能顯著改善蛋清蛋白的流變學性質和功能特性。右旋糖酐（dextran，L12），是乳酸菌以蔗糖為底物產(chǎn)生的同型胞外多糖，由主鏈α-（1→6）、支鏈α-（1→3）、α-（1→2）或α-（1→4）連接而成，具有良好的生物相容性，作為增稠劑、穩(wěn)定劑和膠凝劑等廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工等領域[8]。據(jù)報道，20 g/100 mL 右旋糖酐能改善蠶豆蛋白的流變學性質[9]，而較低濃度右旋糖酐對蠶豆蛋白流變學性質及功能特性的影響未見報道。

因此，本研究以右旋糖酐與蠶豆蛋白復合體系為研究對象，探究右旋糖酐濃度（1%、4%）對蠶豆蛋白體系流變學性質（流動曲線、頻率掃描、觸變性）及功能特性（乳化性能、泡沫性能、膠凝特性）的影響，以期為蠶豆蛋白的性質改善及開發(fā)應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆蛋白：寶雞森瑞生物化工有限公司；檸檬明串珠菌L12：保藏于云南省農(nóng)業(yè)科學院發(fā)酵食品微生物菌種庫；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；蔗糖（分析純）：西隴科學股份有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；玉米油：中糧福臨門食品營銷有限公司；十二烷基硫酸鈉（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；透析袋（截留分子質量14 kDa）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75SII 高壓滅菌鍋：上海博迅儀器有限公司；MARS40 哈克流變儀、Multiskan Go 酶標儀：美國Thermo 公司；LGJ-25C 冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；FJ200-SH 數(shù)顯高速分散均質機：上海滬析實業(yè)有限公司；S210 pH 計：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；DAWN HELEOS 8 激光光散射儀：美國Wyatt 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 右旋糖酐L12 的提取

參照湯回花等[10]的研究方法并稍作修改，取保藏于-80 ℃的檸檬明串珠菌L12，按1%（體積分數(shù)）接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2 代后作種子液備用。然后取1% 的種子液接種到MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖含量為10 g/100 mL；培養(yǎng)條件為30 ℃、80 r/min、48 h。將發(fā)酵液于8 000 r/min 離心10 min 去除菌體，上清液用80%的三氯乙酸調至終濃度5%，磁力攪拌2 h，8 000 r/min 離心10 min 去除蛋白，所得上清液用3 倍無水乙醇沉淀12 h，8 000 r/min離心10 min 收集沉淀，每12 h 換一次蒸餾水，透析液經(jīng)冷凍干燥得右旋糖酐（L12）。

1.3.2 L12 的性質測定

參照湯回花等[10]的研究方法，用多角度激光散射儀分析L12 的重均分子量，采用核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）分析L12 的結構組成，并參照Monteiro 等[11]的研究方法，選擇毛細管內徑為0.3～0.4 mm 的烏氏黏度計，25 ℃下測定L12 的特性黏度。使用Huggins 公式和Kraemer 公式來計算特性黏度[η]。

式中：K′為Huggins 常數(shù)；K″為Kraemer 常數(shù)；ηsp為增比黏度，值為ηr-1，dL/g；C為樣品質量濃度，mg/mL；ηr為相對黏度，dL/g；特性黏度[η]為在無限稀釋時的外推，dL/g。

1.3.3 FPI-L12 復合體系的制備

稱取一定量的FPI 及不同質量分數(shù)的L12，加入pH7.0、0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液，使得FPI 的濃度為15%，L12 濃度為1%、4%，以不添加L12 的為對照，取用前將各體系用磁力攪拌混勻。

1.3.4 FPI-L12 復合體系的流變學性質測定1.3.4.1 流動曲線測定

參照湯回花等[10]的研究方法并稍作修改，采用流變儀平板pp50 系統(tǒng)，板間距1 mm，應變1%，剪切速率的范圍為0.01～1 000 s-1，測量溫度25 ℃，系統(tǒng)平衡3 min后測定復合體系的表觀黏度，通過Carreau 模型擬合復合體系的表觀黏度（η）隨剪切速率（r）的變化趨勢。

式中：η0為零剪切速率表觀黏度，mPa·s；η∞為無限剪切時表觀黏度，mPa·s；λ為破壞流體結構的時間常數(shù)，s；n為流動特性指數(shù)。

1.3.4.2 頻率掃描

參照湯回花等[10]的研究方法并進行適當修改，采用振蕩模式進行參數(shù)設定，應變1%（處于線性黏彈區(qū)范圍），測量溫度25 ℃，剪切速率范圍為0.1～100 s-1，測定在不同角速度范圍內復合體系的彈性模量（G′）與黏性模量（G″）。通過冪律模型擬合G′和G″隨剪切頻率（f）的變化趨勢。

式中：K′、K″為黏度常數(shù)；n′、n″為頻率模量常數(shù)。

1.3.4.3 觸變性測定

參照胡方洋等[12]的研究方法并進行適當修改，采用平板pp50 系統(tǒng)，板間距1 mm，測定溫度為25 ℃，剪切速率從0.01 s-1增加到100 s-1，隨后從100 s-1下降到0.01 s-1，通過RheoWin Date Manager 軟件計算滯后面積。

1.3.5 FPI-L12 復合體系的功能特性測定

1.3.5.1 乳化性能測定

乳化性能包括乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index，ESI），復合體系的乳化性能參照Bask?nc? 等[13]的研究方法并進行適當修改，取8 mL 復合體系與2 mL 玉米油混合，用數(shù)顯高速分散均質機在20 000 r/min 下均質2 min，立即取50 μL 乳液加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，渦旋振蕩均勻，以0.1% 的SDS 溶液為空白，在波長500 nm 處測定吸光度；靜置10 min 后用同樣方法測定乳液的吸光度。EAI 和ESI 的計算公式如下。

式中：E為乳化活性，m2/g；N為稀釋倍數(shù)，100；C為蛋白質量濃度，g/mL；φ為乳液中油相的體積分數(shù)；S為乳化穩(wěn)定性，%；A0和A10分別為乳液靜置0、10 min時的吸光度。

1.3.5.2 泡沫性能測定

泡沫性能指標包括起泡性（foamability，F(xiàn)A）和泡沫穩(wěn)定性（foam stability，F(xiàn)S），復合體系的泡沫性能參照Bask?nc? 等[13]的研究方法并進行適當修改，取10 mL復合體系，用數(shù)顯高速分散均質機在20 000 r/min 下均質2 min 后立刻轉移到刻度管中，記錄均質后0 min和30 min 的泡沫體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計算公式如下。

式中：A為起泡性，%；F為泡沫穩(wěn)定性，%；V0為初始體積，mL；V1和V30分別為均質后0 min 和30 min 的泡沫體積，mL。

1.3.5.3 膠凝特性測定

復合體系的膠凝特性參照李倩文等[14]的研究方法并進行適當修改，對不同濃度的FPI-L12 復合體系進行溫度和頻率掃描。溫度掃描測試條件：樣板間隙1 mm，上樣1 mL，在樣品暴露的邊緣涂一圈硅油以防止水分蒸發(fā)，由20 ℃升溫至90 ℃，90 ℃下保溫30 min后再由90 ℃降至20 ℃，升降溫速率均為5 ℃/min，頻率1 Hz，應變1%。溫度掃描結束后，立即對樣品進行頻率掃描，頻率掃描的測試條件為樣板間隙1 mm、角速度1～100 rad/s、應變1%、測試溫度25 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗做3 次重復，采用SPSS 26.0 和Origin 2021 軟件進行統(tǒng)計分析與作圖，用單因素方差分析法檢驗結果統(tǒng)計學意義；所有結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 L12 的理化性質分析

L12 理化性質分析見表1。

表1 L12 理化性質分析Table 1 Physicochemical properties of dextran（L12）

由表1 可知，L12 的重均分子量為3.86×106Da，在0.01 s-1下的表觀黏度為408.7 mPa·s。經(jīng)過核磁分析后，L12 由α-（1→6）主鏈和α-（1→3）支鏈組成，其占比分別為87.79%和12.21%；此外，特性黏度一般用來衡量溶劑中多糖鏈所占據(jù)的流體體積，主要與多糖的分子結構和溶劑性質相關[15]。L12 在蒸餾水中的特性黏度為6.14 dL/g。在前期研究中，比較右旋糖酐濃度對蠶豆蛋白溶液流變學性質的影響，發(fā)現(xiàn)在15%蠶豆蛋白溶液中添加L12 的濃度低于1% 時，F(xiàn)PI-L12-1%復合體系的流變學性質與空白對照組相比無差異，而L12 的濃度為4% 時，接近實際添加濃度。故L12 的濃度選擇為1%、4%，研究不同濃度下復合體系的流變學性質及功能特性。

2.2 FPI-L12 復合體系的流變學性質分析

2.2.1 流動曲線分析

L12 濃度對FPI-L12 復合體系表觀黏度的影響見圖1。

圖1 L12 濃度對FPI-L12 復合體系表觀黏度的影響Fig.1 Effect of dextran（L12）concentration on apparent viscosity of faba bean protein isolate（FPI）-L12 composite system

由圖1 可知，隨著剪切速率的增加，表觀黏度先迅速下降后趨于平穩(wěn)，表現(xiàn)出了剪切稀化行為，呈現(xiàn)假塑性特征。復合體系的表觀黏度始終高于對照組且隨著L12 濃度的增加逐漸升高，這可能是由于L12 具有增稠性，濃度越大使復合體系的黏度越高。吳云輝[16]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白-魔芋葡甘聚糖體系的黏度隨著魔芋葡甘聚糖濃度的增加逐漸升高。

采用Carreau 模型對復合體系的流動曲線進行擬合，L12 濃度對FPI-L12 復合體系Carreau 擬合模型參數(shù)的影響見表2。

表2 L12 濃度對FPI-L12 復合體系Carreau 擬合模型參數(shù)的影響Table 2 Effect of dextran（L12）concentration on the Carreau fitting model parameters of faba bean protein isolate（FPI）-L12 composite system

如表2 所示，在0.01～1 000 s-1的剪切速率范圍內能較好地擬合流動曲線。隨著L12 濃度的增加，η0逐漸增大，說明復合體系在零剪切速率下的表觀黏度隨著其濃度的增加而逐漸升高。λ值是破壞流體結構的時間常數(shù)，λ值越小，表明破壞流體所需的剪切速率就越大[10]。從Carreau 擬合模型可以看出，隨著L12 濃度的增加，復合體系的λ值逐漸增大，破壞體系所需的剪切速率逐漸減小。

2.2.2 頻率掃描分析

復合體系的黏彈性行為可以通過黏彈性模量變化來表示，L12 濃度對FPI-L12 復合體系黏彈性的變化見圖2。

圖2 L12 濃度對FPI-L12 復合體系彈性模量（G′）與黏性模量（G"）的影響Fig.2 Effect of dextran（L12）concentration on storage modulus（G′）and loss modulus（G"）of faba bean protein isolate（FPI）-L12 composite system

由圖2 可知，在角速度為0～50 rad/s 時，復合體系的彈性模量（G′）與黏性模量（G″）隨角速度的增加而逐漸增大，且G′遠大于G″，說明所有的樣品都表現(xiàn)出彈性流體特征。加入L12 后，復合體系的G′和G″都高于對照組。白英等[17]研究果膠濃度（1～5 g/L）對乳清蛋白流變學性質的影響，發(fā)現(xiàn)隨著果膠濃度的增加，果膠-乳清蛋白混合體系的黏彈性模量逐漸增大，推測是由于果膠增加了混合體系的黏度，導致復合體系的G′和G″逐漸增大。

G′和G″隨頻率的變化趨勢用冪律模型擬合，L12濃度對FPI-L12 復合體系冪律模型參數(shù)的影響見表3。

表3 L12 濃度對FPI-L12 復合體系冪律模型參數(shù)的影響Table 3 Effect of dextran（L12）concentration on the power law model of faba bean protein isolate（FPI）-L12 composite system

K為黏度常數(shù)，數(shù)值越大，體系的彈性和表觀黏度越高[18]。由表3 可知，復合體系的K′和K″高于對照組，隨著L12 濃度的增加而逐漸增大，說明L12 能夠增加FPI 體系的彈性和表觀黏度，且濃度越高增加趨勢越明顯。頻率模量指數(shù)n為黏彈性模量與頻率的相關程度，數(shù)值越大影響越大[19]。復合體系的n′和n″值大于對照組，可能是由于L12 增加了體系的黏彈性模量，使FPI-L12 復合體系具有頻率依賴性。

2.2.3 觸變性分析

L12 濃度對FPI-L12 復合體系觸變性的影響見圖3。

圖3 L12 濃度對FPI-L12 復合體系觸變性的影響Fig.3 Effect of dextran（L12）concentration on thixotropy of faba bean protein isolate（FPI）-L12 composite system

滯后面積由哈克流變儀自帶的軟件計算得到，F(xiàn)PIL12 復合體系的滯后面積見表4。

表4 FPI-L12 復合體系的滯后面積Table 4 Hysteresis area of faba bean protein isolate（FPI）-dextran（L12）composite system

滯后環(huán)法是測定溶液觸變性質的重要方法之一，滯后面積的大小與破壞觸變結構所需的能量成正比[20]。由圖3 和表4 可知，F(xiàn)PI 體系和不同濃度的FPIL12 復合體系都有一定的觸變性，相較于對照組，加入L12 后FPI-L12 復合體系的觸變性增強，且添加1%L12 復合體系的滯后面積低于添加4% L12 的復合體系，可能是由于多糖添加量增大時，復合體系的黏度增大，從結構改變到恢復至初始狀態(tài)所需時間較長[21]，所以添加4% L12 復合體系的滯后面積更大。FPI 體系的滯后面積為557.5 Pa/s，L12 濃度為4% 時復合體系的滯后面積為20 992.3 Pa/s，這個較高的數(shù)值可能與4%L12 與FPI 體系產(chǎn)生的更緊密的結構相對應。

2.3 FPI-L12 復合體系的功能特性分析

2.3.1 乳化性能分析

L12 濃度對FPI-L12 復合體系乳化性能的影響見圖4。

圖4 L12 濃度對FPI-L12 復合體系乳化性能的影響Fig.4 Effect of dextran（L12）concentration on emulsifying property of faba bean protein isolate（FPI）-dextran（L12）composite system

乳化活性與乳化穩(wěn)定性可以反映出蛋白質形成及穩(wěn)定乳化體系的能力，可用于衡量蛋白質的乳化性。由圖4 可知，對照組的EAI 較低，為（19.42±1.33）m2/g。加入L12 后，復合體系的EAI 顯著提升（P<0.05）。穆婉菊等[22]研究菊粉添加量（2.5%～20%）對小麥面筋蛋白-菊粉復合物乳化特性的影響規(guī)律，發(fā)現(xiàn)添加菊粉后小麥面筋蛋白的EAI 顯著提高，推測是由于菊粉的吸水性強，改變了蛋白質內部水分分布，破壞了蛋白質分子間的靜電斥力，促進蛋白質中疏水基團相互作用，從而增加了復合體系的EAI。此外，對照組的ESI為（80.62±1.09）%，隨著L12 濃度的增加，ESI 也呈現(xiàn)上升趨勢。推測是由于L12 濃度的增加使復合體系的黏度增加，限制油滴的聚集，從而使乳液的穩(wěn)定性升高[23]。

2.3.2 泡沫性能分析

L12 濃度對FPI-L12 復合體系泡沫性能的影響見圖5。

圖5 L12 濃度對FPI-L12 復合體系泡沫性能的影響Fig.5 Effect of dextran（L12）concentration on foam property of faba bean protein isolate（FPI）-dextran（L12）composite system

由圖5 可知，隨著L12 濃度的增加，F(xiàn)PI-L12 復合體系的FA 呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。與對照組的FA[（62.33±2.05）%]相比，當L12 濃度為1%時，復合體系的FA 增加至（92.00±2.16）%，說明一定濃度的L12可以增加FPI-L12 復合體系的起泡性。當L12 濃度為4% 時，復合體系的FA 降低至（37.33±2.05）%。結合2.2.1 流動曲線的結果可知，此時復合體系的黏度過高，影響蛋白質的發(fā)泡能力，會使起泡性變弱，這也與高黏度時氣泡在蛋白質體系中的分散困難有關[24]。此外，F(xiàn)PI-L12 復合體系的FS 顯著高于對照組[（63.15±1.78）%]（P?0.05），隨著L12 濃度的增加，復合體系的FS 逐漸升高，這可能是由于多糖增加了復合體系的黏彈性和界面膜面積，提升了界面穩(wěn)定性，降低了界面面積損失和氣泡粗化[24]。

2.3.3 膠凝特性分析

L12 濃度對FPI-L12 復合體系膠凝特性的影響見圖6。

圖6 FPI-L12 復合體系溫度掃描及頻率掃描圖Fig.6 Temperature and frequency scanning diagrams of faba bean protein isolate（FPI）-dextran（L12）composite system

在20～90 ℃對復合體系進行溫度掃描以模擬凝膠的形成過程。由圖6 可知，同一溫度下，F(xiàn)PI-L12 復合體系的G′和G″始終高于對照組，這可能是由于多糖與蛋白質形成了復雜的網(wǎng)絡結構[25]。在20～90 ℃升溫階段，對照組與添加1%L12 的復合體系分別在86.43 ℃和56.20 ℃時G′與G″出現(xiàn)交點，表明此溫度下該體系由溶膠轉變成凝膠。Tseng 等[26]研究菊粉濃度1%～4%對大豆豆?jié){流變學性質的影響，發(fā)現(xiàn)隨著菊粉濃度的增加，豆?jié){形成凝膠的溫度逐漸降低，推測是由于菊粉的加入改善了蛋白質之間的相互作用，從而促進蛋白質-膠質分散體在更低溫度下形成凝膠。Lopes-Da-Silva 等[27]探究半乳甘露聚糖對大豆蛋白水解物膠凝特性的影響，發(fā)現(xiàn)半乳甘露聚糖可以降低復合體系的膠凝溫度，推測是由于蛋白質與多糖之間發(fā)生相分離，導致局部蛋白質濃度增加，降低復合體系的膠凝溫度。而添加4% L12 復合體系的G′始終大于G″，未出現(xiàn)交點，表明一定濃度的右旋糖酐可以促使蠶豆蛋白在室溫下形成凝膠。Netsopa 等[28]研究魏斯氏菌生產(chǎn)的右旋糖酐不同濃度（2.5%、5%、10%）的流變學性質，發(fā)現(xiàn)右旋糖酐由液體行為轉變?yōu)楣腆w行為的臨界范圍濃度是2.5%～5%。在90 ℃恒溫階段，對照組與FPI-L12 復合體系的G′和G″繼續(xù)增加。李倩文等[14]研究低聚木糖對乳清蛋白凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)在90 ℃恒溫階段，復合體系的G′和G″繼續(xù)升高，原因是此階段二硫鍵的形成促進蛋白分子交聯(lián)，此趨勢與試驗結果一致。在90～20 ℃降溫階段，各體系的G′和G″繼續(xù)升高。Zhao 等[29]研究魔芋膠和結冷膠對硫酸鈣誘導的大豆分離蛋白凝膠流變學特性的影響，發(fā)現(xiàn)在冷卻階段，所有復合凝膠的G′與G″都增加，推測是由于此階段凝膠結構中形成了其他非共價鍵和共價鍵。

由圖6（d）、圖6（e）可知，F(xiàn)PI-L12 復合凝膠的G′大于G″，且隨著角速度的升高，G′與G″逐漸增大，表明FPI-L12 復合凝膠具有頻率依賴性且以彈性特征為主。與對照組相比，當L12 的濃度從1%增加到4%時，復合凝膠的黏彈性模量逐漸增大，Pang 等[30]也發(fā)現(xiàn)隨著刺槐豆膠濃度增加，豆乳酸凝膠的黏彈性模量逐漸增加，推測刺槐豆膠增加了凝膠網(wǎng)絡結構的致密性，這與本研究的結果一致。因此，蛋白質凝膠可能在高濃度的多糖體系下形成復雜的網(wǎng)絡結構。

3 結論

本文探究L12 在不同濃度（1%、4%）下對FPI-L12復合體系的流變學性質和功能特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著L12 濃度的增加，F(xiàn)PI-L12 復合體系的表觀黏度、黏彈性模量、觸變性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性都逐漸增加，而高濃度多糖由于使復合體系的黏度過高，氣泡在蛋白質溶液中分散困難，導致起泡性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。此外，添加L12 顯著降低了FPI-L12 復合體系的膠凝溫度，添加4%L12 的復合體系在常溫下就形成了凝膠。總體而言，添加L12 能夠改善FPI-L12 復合體系的流變學性質和功能特性。本研究為拓展FPI 的開發(fā)應用提供新思路。