褪黑素對鮮切馬鈴薯過冷貯藏期間褐變的影響

劉岳，李學進，王曉冉，馬笑巍，王曉東，姜瑜倩，李喜宏*，楊相政

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；2.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058；3.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250200）

近年來，全球經濟發展促進了人們對方便食品的需求，因而鮮切果蔬受到了廣泛的關注[1]。馬鈴薯作為最重要的農產品，含有豐富的碳水化合物、蛋白質、維生素C、微量元素和氨基酸[2]，常被用于餐飲業。然而，鮮切馬鈴薯在制備過程中的機械損傷會導致其在貯藏過程中的品質惡化，其中褐變是鮮切馬鈴薯品質惡化的主要原因[3]。褐變會導致其顏色和光澤度、口感、氣味甚至硬度等品質惡化。因此，在保持新鮮馬鈴薯風味和延長保質期的同時防止褐變是很重要的。

褪黑素（melatonin treatment，MT）是一種多效性分子，在生物體中具有許多不同的作用[4]。在植物中，褪黑素被當作種子萌發、根系增殖、開花、坐果和果實成熟的植物生長調節劑[5-7]。此外，褪黑素可以延長保質期并保持采后水果的品質[8-9]。過冷（supercooled，SC）貯藏是指存儲溫度降至冰點以下但不結冰的貯藏方法[10]。據報道，SC 貯藏可將大蒜、青蔥、鮮切蘋果和鮮切卷心菜的保質期延長1.0～2.5 倍[11-12]。鮮切馬鈴薯的SC 貯藏是可行的，因為它可以降低酶活性[13]。但過冷的環境會刺激膜脂質相關的酶活性，產生更多的丙二醛（malondialdehyde，MDA），并加速儲存過程中的褐變[14]。然而褪黑素除了影響這些正常的生理功能外，還具有抗氧化劑的功能，可以抑制酚類化合物的氧化并在清除活性氮和活性氧方面具有重要作用[15]。它通過調節抗氧化酶活性來維持活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝的平衡，從而減少膜脂質氧化，提高果蔬對冷脅迫的耐受性[16-17]。

褪黑素處理結合過冷貯藏有望對鮮切馬鈴薯的品質維持起到協同作用。因此，本研究對褪黑素處理過的鮮切馬鈴薯在8 d 過冷貯藏期間的理化變化和質量評價進行觀察和分析。具體研究SC 貯藏前褪黑素處理對鮮切馬鈴薯的抗褐變和抗冷害的影響，利用酶活性比，探究褪黑素處理是否可以抵消SC 對鮮切馬鈴薯的冷損傷，提高鮮切馬鈴薯的品質變質抵抗力，延長鮮切馬鈴薯的貨架期。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯：市售；聚乙烯吡咯烷酮、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、鄰苯二酚、三氯乙酸、乙二胺四乙酸、愈創木酚、硫代巴比妥酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical ，DPPH）、無水乙醇（均為分析純）、褪黑素（食品級）：天津百奧泰科技發展有限公司；過氧化氫試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧陰離子檢測試劑盒：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

冰箱（BC-142FQD）：TCL 科技集團股份有限公司；溫度記錄儀（FLUKE2638A）：美國福祿克電子儀器公司；超聲儀（SB-6000DT）、真空干燥機（SCIENTZ-12N/A型）、精密色差儀（WR-18）：寧波新芝生物科技股份有限公司；搖床（HY-60）：武漢匯成生物科技有限公司；離心機（TGL-16）：四川舒科儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冰點和過冷點的測定

鮮切馬鈴薯的初始冰點和過冷點的測定參考Koide等[18]的方法并稍加修改。將T 型熱電偶固定在每個馬鈴薯樣品（2 cm×2 cm×2 cm）的幾何中心，后將其放入聚丙烯盒后，置于-40 ℃冰箱中。采用溫度記錄儀以3 s 的間隔記錄溫度，直到樣品冷卻至-20 ℃。建立鮮切馬鈴薯的時間溫度曲線（n=10）用于確定冰點和過冷點。

1.3.2 樣品處理

選擇大小均勻、成熟度相同的馬鈴薯清洗后，用已殺菌的去皮器和切片器將馬鈴薯去皮并切成厚度約4 mm 的馬鈴薯鮮切片，根據預試驗所得結論，將馬鈴薯鮮切片用濃度為250 μmol/L 的MT 溶液浸泡15 min，另取一組用蒸餾水浸泡15 min 作為對照。將處理過的馬鈴薯鮮切片晾干表面水分后放入食品自封袋（聚乙烯材質，厚度0.7 mm），分別置于-2 ℃（SC 貯藏）和4 ℃條件下貯藏8 d，分別在第0、2、4、6、8 天評價分析3 組樣品：1）對照組（CK 組，4 ℃）；2）過冷貯藏組（SC 組，-2 ℃）；3）褪黑素+過冷貯藏組（MT+SC 組，250 μmol/L MT，-2 ℃）。

1.3.3 褐變指數測定

馬鈴薯鮮切片表面顏色采用便攜式精密色差儀進行測定，根據以下公式計算褐變指數（browning index，BI）。

式中：B為褐變指數；L*為亮度值；a*為紅綠值；b*為黃藍值。

1.3.4 丙二醛含量的測定

參考Li 等[19]的方法測定MDA 含量。

1.3.5 抗氧化能力測定

馬鈴薯中的酚類物質提取參考Tang 等[20]的方法并稍加修改。將冷凍馬鈴薯樣品在真空干燥機凍干24 h，然后磨成粉末。將馬鈴薯干粉（1 g）和含有體積分數0.1% 冰醋酸（5 mL）的70% 甲醇混合均勻，室溫下用搖床以400 r/min 避光提取2 h，然后175 W 超聲處理30 min。將混合物用離心機以10 000×g離心15 min。收集上清液，再提取剩余物2 次，合并上清液，補充提取液至15 mL。以上清液為粗提取物待用。

DPPH 自由基清除能力測定參考Tang 等[20]的方法并稍加修改。將樣品或水溶性維生素E（Trolox）溶液（25、62.5、125、250、500、750、1 000 μmol/L）加入到200 μL DPPH 溶液中。將混合物在室溫、避光條件下反應4 h，測定517 nm 處吸光值。以200 μL DPPH 溶液（350 μmol/L）為空白。DPPH 自由基清除能力表示為每克馬鈴薯干重的μmol Trolox 當量（μmol TE/g）（y=-0.000 9x+0.055 5，r2=0.999 9）。

總酚含量（total phenolic content，TPC）通過福林-酚法測定。TPC 表示為每克干馬鈴薯質量（mg GAE/g）的沒食子酸當量毫克數（y=0.004 9x+0.073 6，r2=0.999 9）。

1.3.6 活性氧的測定

過氧化氫的含量由過氧化氫試劑盒測定；超氧陰離子自由基產生速率由超氧陰離子檢測試劑盒測定。

1.3.7 相關酶活性的測定

參考Li 等[19]方法測定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，并按比例縮小而適用于96 孔板。

1.3.8 酶活比

酶活比的定義參考Li 等[19]，即貯藏期間防御酶（POD、CAT）和攻擊酶（PPO、LOX）的比值，反映不同處理的馬鈴薯鮮切片對外界不利環境的抵抗能力，以此來評估外冷害造成的褐變防御能力，計算公式如下。

式中：R1～R4分別為POD 和PPO、CAT 和PPO、POD和LOX 以及CAT 和LOX 酶活比；P0為貯藏初期多酚氧化酶活性，U/g；Pn為貯藏末期多酚氧化酶活性，U/g；D0為貯藏初期過氧化物酶活性，U/g；Dn為貯藏末期過氧化物酶活性，U/g；C0為貯藏初期過氧化氫酶活性，U/g；Cn為貯藏末期過氧化氫酶活性，U/g；L0為貯藏初期脂氧合酶活性，U/g；Ln為貯藏后期脂氧合酶活性，U/g。

1.4 數據處理

所有數據采用Excel 365 進行數據統計及標準偏差的計算；SPASS 19.0 軟件進行單因素方差分析；Origin 8.0 繪圖。每組試驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 初始冰點和過冷點

馬鈴薯鮮切片的初始冰點和過冷點如表1 所示。

表1 馬鈴薯鮮切片初始冰點和過冷點Table 1 Initial freezing point and supercooling point of fresh-cut potatoes

由表1 可知，馬鈴薯鮮切片平均初始冰點為（-1.7±0.2）℃，且與Comandini 等[21]的研究結果相近。馬鈴薯鮮切片的過冷點范圍為-2.5～-5.0 ℃，這表明其貯藏在-2 ℃條件下不會結冰。因此，本研究采用的SC 溫度為（-2.0±0.1）℃。

2.2 MT+SC 處理對褐變指數的影響

顏色變化是評價鮮切馬鈴薯品質的關鍵指標之一，BI 越大說明褐變越嚴重。MT+SC 處理對褐變指數影響如圖1 所示。

圖1 MT+SC 處理對褐變指數的影響Fig.1 Effect of MT+SC treatment on the browning index

由圖1 可知，在貯藏期間各組馬鈴薯的褐變指數都呈上升趨勢，但兩個處理組的BI 值顯著低于對照組果實（P<0.05），其中MT+SC 處理組的BI 值最低，約為對照組的37.8%，表明MT+SC 處理組在維持鮮切馬鈴薯顏色方面具有較高的潛在價值。

2.3 MT+SC 處理對褐變相關酶活性和總酚含量的影響

鮮切果蔬的褐變系統很復雜，并受到多種因素影響，其中包括底物含量、細胞損傷和相關酶活性[19]。MT+SC 處理對PPO、PAL 活性以及總酚含量的影響如圖2 所示。

圖2 MT+SC 處理對褐變相關酶活性和總酚含量的影響Fig.2 Effects of MT+SC treatment on browning-related enzyme activities and the total phenolic content

PPO 和PAL 都與酶促褐變直接相關，PAL 則是參與控制酚類物質的合成。如圖2a 所示，PAL 的活性在貯藏8 d 內整體先增加后下降，且MT+SC 組PAL 活性顯著低于其余兩組（P<0.05）。馬鈴薯切片后，PPO 從細胞膜中釋放出來，并在氧氣存在下與液泡中的酚類物質反應生成醌，醌進一步脫水并聚合形成深色物質。如圖2b 所示，除前2 d 外，SC 組PPO 活性顯著低于CK 組（P<0.05）；MT+SC 組在貯藏期間的PPO 活性顯著低于其余兩組（P<0.05）。SC 組兩種酶活性的變化可能是由于低溫抑制了酶的活性，進而延緩了鮮切馬鈴薯的褐變。而MC+SC 組對鮮切馬鈴薯的抑制褐變效果更佳。Li 等[22]的研究證明外源褪黑素處理降低了鮮切甘薯中PAL 和PPO 的活性。

酚類物質作為植物防御系統中重要的次生代謝產物具有較好的抗氧化作用，除了防止氫過氧化物成為活性氧自由基外，還可以螯合金屬離子。如圖2c 所示，在整個貯藏過程中各處理組的總酚含量整體上呈升高趨勢。CK 組在貯藏最后一天的總酚含量高達11.13 mg/g，相比于初期增長了94%，而MT+SC 組相比于初期只增長19%。因此，在本研究中，聯合處理有助于將總酚含量維持在更低水平。這可能是聯合處理抑制了PAL 活性，進而抑制馬鈴薯鮮切片中酚類物質在貯藏期的積累。

2.4 MT+SC 處理對O2-、H2O2 和MDA 含量以及LOX活性的影響

通過測定O2-、H2O2和MDA 含量以及LOX 活性，研究SC 結合MT 處理對鮮切馬鈴薯的氧化水平的影響，結果見圖3。

圖3 MT+SC 處理對H2O2、O2-和MDA 含量以及LOX 活性的影響Fig.3 Effects of MT+SC treatment on H2O2，O2-and MDA contents and LOX activity

膜脂過氧化被認為是細胞損傷和組織老化的特征，這是由ROS 或脂質氧化酶（如LOX）觸發的。過量的ROS 被LOX 催化，不飽和脂肪酸被氧化形成共軛的過氧脂肪酸，最終導致脂質過氧化的連鎖反應。由圖3a、圖3b 可知，MT+SC 組的O2-含量和LOX 活性都顯著低于SC 組和CK 組（P<0.05）。SC 組O2-含量又顯著低于CK 組（P<0.05），而SC 組和CK 組的LOX 活性沒有明顯趨勢。這可能是低溫造成冷害，積累的大量O2-加速了膜脂過氧化，進而加劇了組織的凍傷和褐變，而MT 具有良好的抗氧化作用，在清除ROS 方面具有重要作用[15]，所以MT+SC 組可有效地降低膜脂過氧化水平。

H2O2和MDA 被認為是植物細胞膜中脂質過氧化的產物。H2O2和MDA 的積累可以破壞細胞膜，從而促進棕色聚合物的積累，并導致果實褐變。如圖3c 所示，CK 組H2O2積累量增加迅速且明顯高于其余兩組；而MT+SC 組上升緩慢且顯著低于其余兩組（P<0.05）。同時Li 等[22]、Liu 等[23]、Zheng 等[24]的研究發現MT 處理在延緩H2O2積累方面具有顯著效果。因此SC 結合MT 處理有效地提高了鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，減少了H2O2的積累。由圖3d 可知，SC 組的MDA 積累量在貯藏的第2～6 天顯著高于其余兩組（P<0.05）；MT+SC 組在貯藏期間MDA 積累量低于CK 組。這可能是由于過冷處理溫度過低造成了冷害，有研究顯示，褪黑素可以通過抑制MDA 含量來減少冷害的發生[25]。因此，MT+SC 處理可以有效抑制冷害造成的MDA 的積累，進而降低膜脂過氧化水平。

2.5 MT+SC 處理對抗氧化能力的影響

通過測定POD 和CAT 活性以及DPPH 自由基清除能力，研究SC 結合MT 處理對鮮切馬鈴薯的抗氧化能力的影響，結果見圖4。

圖4 MT+SC 處理對抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of MT+SC treatment on antioxidant capacity

POD 和CAT 是清除自由基最重要的酶。由圖4a可知，貯藏第2～6 天MT+SC 處理組POD 活性顯著低于CK 組（P<0.05）。這可能是由于CK 組和SC 組產生更多的H2O2，進而誘導POD 活性升高。在整個貯藏期間，MT+SC 組的POD 活性最低，這表明MT+SC 組減少了細胞內活性氧和自由基的積累，從而維持了較好的細胞膜完整性。由圖4b 可知，CK 組、MT+SC 組和SC 組CAT 活性均呈下降趨勢，而MT+SC 組在第2～8 天CAT 活性無顯著性變化，其活性分別為35.6、34.3、35.75、35.7 U/g，且在貯藏的第4～8 天中顯著高于另外兩組（P<0.05）。這可能是由于MT 通過增強CAT活力進而有效消除了H2O2，減少了鮮切馬鈴薯的氧化損傷。

植物的抗氧化能力可以用DPPH 自由基清除能力進行評估。由圖4c 可知，SC 組的鮮切馬鈴薯的抗氧化能力顯著高于CK 組（P<0.05）。研究表明，褪黑素可以對鮮切梨和草莓產生非生物脅迫，從而達到更高水平的抗氧化能力[26]。本研究發現MT+SC 處理提高了馬鈴薯鮮切片的抗氧化能力，并且在整個貯藏期間表現出的抗氧化能力下降幅度最少，表現出了最佳的DPPH 自由基清除能力。因此，MT+SC 處理提高了鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，減少了活性氧引起的組織損傷。

2.6 酶活性比

酶活性比可用來評價處理方法對鮮切果蔬褐變方面的有效性[19]。酶活比是指單位時間內攻擊酶和防御酶增量的比值，可以表示樣品在貯藏期間的生命活性強度。MT+SC 處理對防御酶和攻擊酶活性比的影響見圖5。

圖5 防御酶與攻擊酶活性比Fig.5 Activity ratio of defense enzymes to attack enzymes

a.比率1；b.比率2；c.比率3；d.比率4。

由圖5a 和圖5b 可知，MT+SC 組的酶活性比率高于SC 組和CK 組。其中，第6 天MT+SC 組比率1 值達到最大，分別比SC 組和CK 組高2.64 倍和3.53 倍。這表明MT+SC 組可以有效抑制鮮切馬鈴薯的褐變效果。由圖5c 和圖5d 可知，MT+SC 組的酶活性比率均高于SC 組和CK 組。其中，第6 天MT+SC 組比率3、比率4 值達到最大。這表明MT 處理可使馬鈴薯塊莖具有更強的抗氧化能力，以抵抗切割和SC 貯藏對鮮切馬鈴薯造成的傷害。

3 結論

為延長鮮切馬鈴薯貨架期，探究MT+SC 處理對鮮切馬鈴薯品質的影響。研究結果表明，MT+SC 處理對抑制鮮切馬鈴薯果實褐變和增加抗寒性具有較好效果。MT+SC 處理顯著抑制了PPO 活性和總酚含量升高，同時維持了較低的PAL 活性，并且顯著減少了因低溫造成的MDA 積累，不僅降低了膜脂質過氧化程度，而且保持了細胞膜的完整性。MT+SC 處理還提高了鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，從而減少了自由基積累對細胞膜的損傷。綜上所述，MT+SC 處理可以有效延長鮮切馬鈴薯的貨架期，對于開發具有農業應用潛力的新型保鮮技術具有重要意義。