秀珍菇粉對小鼠腸道菌群、免疫功能及抗氧化活性的影響

呂建敏，袁海娜，肖功年，劉士旺

（1.浙江中醫藥大學 中醫藥科學院動物實驗研究中心，浙江 杭州 310053；2.浙江科技大學 生物與化學工程學院/輕工學院，浙江 杭州 310023）

食用菌在我國歷史悠久[1]。隨著人們對食用菌營養和生理功效研究的不斷深入，食用菌的食用價值受到關注。食用菌中富含多糖、多酚、氨基酸、煙酸、鉀、核黃素、硒、維生素和膳食纖維等重要營養成分，不僅具有多種生理作用，還具有益生元功效[2-3]。研究發現，日糧中添加雙孢菇粉可增加仔雞糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的數量[4]；灌服富硒猴頭菇凍干粉可使小鼠腸道中雙歧桿菌和乳桿菌等益生菌數量顯著增加，有害菌大腸埃希氏菌數量明顯減少[5]；灌服香菇酶解物可明顯增加小鼠腸道中細菌總數和乳酸菌數量，促進腸道中有益菌的生長，增強腸道免疫功能[6]。因此，食用菌及其提取物可作為天然益生元，對維持腸道微生態平衡、保證機體健康起到關鍵作用。但食用菌種類繁多，不同食用菌對腸道菌群作用效果不同[7]，且目前有關此功效研究僅集中在少數品種上，大多數食用菌仍亟待開發。

秀珍菇（Pleurotusgeesteranus）隸屬擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側耳科，側耳屬，最早發現于印度，現已在全國廣為栽培[8]。秀珍菇營養豐富，富含蛋白質和多糖，且氨基酸種類齊全[9]。研究發現秀珍菇多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、降血糖、增強免疫、保護肝、肺組織等藥理功效[10-14]，除多糖外，秀珍菇中還含有蛋白質、氨基酸、黃酮、多酚、維生素等營養物質[8-9]，能與多糖協同充分發揮其抗腫瘤、免疫調節、抗氧化等功效。本課題組前期利用H22 荷瘤小鼠證實，秀珍菇粉具有較好的抑瘤作用[15]。近年來，有關秀珍菇蛋白結構功能及其水解物的抗氧化功效研究備受關注[16-17]。但目前秀珍菇在腸道菌群調控和免疫調節方面研究報道鮮見。因此，本研究以小鼠為研究對象，重點探討秀珍菇粉對腸道菌群調節作用，并輔以生化、抗氧化和免疫功能指標的測定，旨在為秀珍菇功能食品的深層次研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6 小鼠40 只：上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，雌性，年齡為6 周齡，體質量為17～20 g，實驗動物質量合格證號為20130016009288。

新鮮秀珍菇：縉云縣珍稀食用菌專業合作社，經浙江科技大學劉士旺教授鑒定。

谷氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒、肌酐（creatinine，Crea）檢測試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，CHOL）檢測試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TC）檢測試劑盒、葡萄糖（glucose，GLU）檢測試劑盒：德賽診斷系統（上海）有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。Hanks 平衡鹽溶液（Hank balanced salt solution，HBSS）：美國Atlanta 生物科技公司；刀豆素（canavalin，ConA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640 medium，RPMI1640）完全培養液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Sigma 公司。

16S rDNA 測序試劑：熱啟動Flex DNA 聚合酶預混液（Pusion Hot start flex 2X Master Mix）：上海儀濤生物儀器有限公司；2 000 bp 范圍的雙鏈線狀DNA 分子量大小參照（DL2000 DNA Maker）：日本Takara 公司；核酸染料（Gene colour）：北京金博益生物技術有限公司；雙鏈DNA 熒光定量檢測試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit），500 次：美國Thermo Fisher 公司；G-10 瓊脂糖（Agarose G-10）：西班牙Biowest 公司；50×TAE 緩沖液[由三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，tris base）、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）組成]：生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）片段純化試劑盒（PCR Cleanup Kit）：美國Axygen 公司。

1.2 儀器與設備

RHP-600 型高速多功能粉碎機：浙江榮浩工貿有限公司；GM-SY-B 型納米沖擊磨：秦皇島市太極環納米制品有限公司；DK-450B 型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；X-15R 離心機：美國Beckman Coutler 公司；7020 型全自動生化分析儀：日本日立公司；iMark 酶標儀：美國伯樂公司；Forma3111 型CO2培養箱：美國Thermo 公司；Centrifuge 5424 常溫離心機：德國Eppendorf 公司；Microfuge R 22R Centrifuge 冷凍離心機：美國Beckman Coutler 公司；WH-861 Vortex Shaker 旋渦振蕩儀：太倉市華利達實驗設備有限公司；DK-8D 三溫三控恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司；A200 型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州朗基科學儀器有限公司；R EPS300 電泳儀、2500 型凝膠成像儀：上海天能公司；miseq 高通量測序儀：美國illumina 公司；DW-HL388 超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 秀珍菇粉（Pleurotusgeesteranuspowder，GP）制備

將新鮮秀珍菇于50～70 ℃下烘干8 h，使用高速多功能粉碎機粉碎成粉末，過40 目篩。為增加秀珍菇粉與溶劑接觸表面積，提高生物利用率[18]，將上述粉末用納米沖擊磨研磨，研磨時冷凝溫度為25 ℃，連續運行3 h 后，將所得粉末過6 000 目篩，即得實驗用秀珍菇粉。

1.3.2 小鼠分組及處理

將40 只6 周齡雌性C57BL/6 小鼠適應飼養1 周后，隨機分為4 組，每組10 只，分別為正常對照（normal control，NC）組，秀珍菇粉低（GPL）、中（GPM）、高（GPH）劑量組。正常對照組小鼠灌服0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液（carboxymethylcellulose sodium solution，CMCNa），秀珍菇粉低、中、高劑量組小鼠分別灌服劑量為500、1 000、2 000 mg/kg BW 的秀珍菇粉CMCNa混懸液，各組小鼠灌胃容量均為0.2 mL/10 g BW。動物實驗周期為40 d。動物實驗在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心進行，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2018-0012。動物實驗方案獲得實驗動物飼養管理使用委員會審查批準（審批號：IACUC 2018091705）。

1.3.3 平均日增重和臟器指數測定

分別在實驗開始（m1，g）和實驗結束（m2，g）稱量小鼠空腹體質量，小鼠平均日增重（A，g/d）的計算公式如下。

A=（m2-m1）/D

式中：D為實驗時間，40 d。

實驗結束取小鼠脾臟、胸腺、肝臟和腎臟并稱重，臟器指數（X，%）的計算公式如下。

X=M/m2×100

式中：M為臟器質量，g；m2為實驗結束時小鼠空腹體質量，g。

1.3.4 小鼠血清生化指標和抗氧化指標測定

實驗結束，取血，分離血清，參照試劑盒說明書，利用全自動生化分析儀測定小鼠血清中ALT 活性、GLU、BUN、Crea、CHOL、TC 含量；利用酶標儀測定小鼠血清中SOD 和GSH-Px 的活性及MDA 含量。

1.3.5 小鼠肝、腎抗氧化指標測定

實驗結束取小鼠肝、腎，分別制備肝、腎組織勻漿，參照試劑盒說明書，利用酶標儀測定小鼠肝、腎組織勻漿中SOD、GSH-Px 和CAT 活性及MDA 含量。

1.3.6 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

參照文獻[19]方法進行，無菌取脾，置無菌培養皿中將其磨碎，利用尼龍綢布過濾至10 mL 離心管中，用Hanks 平衡鹽溶液洗滌，合并洗滌液，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，加Hanks 平衡鹽溶液至7 mL，將細胞混勻，再4 ℃、1 500 r/min 離心5 min，重復2 次。所獲每個脾臟的淋巴細胞用2 mL RPMI 1640 完全培養液混懸。取上述脾淋巴細胞混懸液0.1 mL 加3.9 mL臺盼藍溶液，混勻，于顯微鏡下計數，再用RPMI 1640完全培養液將原液稀釋至1×107個細胞/mL。取96 孔板，每個樣品分別設4 孔重復和4 個陰性對照孔。先在每孔中加入1×107個細胞/mL 脾淋巴細胞混懸液100 μL，隨后在各樣品孔中加入100 μL 2.5 μg/mL 的ConA（或5.0 μg/mL 的LPS），在各陰性對照孔中加入RPMI1640 完全培養液100 μL。將加樣后96 孔板置于37 ℃的5% CO2培養箱中培養72 h，每孔加入MTT 10 μL，繼續培養4 h，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，加入DMSO 150 μL，充分振蕩，用酶標儀于570 nm 處分別測樣品孔（B1）、陰性對照孔（B2）的吸光度。T 淋巴細胞或B 淋巴細胞刺激指數（R）的計算公式如下。

R=B1/B2

1.3.7 小鼠腸道微生物16S rDNA 測序

實驗結束，用CO2吸入法處死小鼠，取小鼠結腸內容物，經DNA 提取及檢測、PCR 擴增、產物純化、文庫制備與庫檢、miseq 高通量測序儀上機測序等步驟，進行小鼠腸道微生物16S rDNA 測序。

1.4 數據處理

采用SAS 8.1 統計軟件的ANOVA 分析進行單因素方差分析，并進行Duncan 多重比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 秀珍菇粉對小鼠生長性能的影響

一般狀態觀察顯示，實驗組和正常對照組小鼠狀況良好，被毛光滑，采食、飲水正常，無死亡情況發生。體質量、臟器指數是評估藥物和食品毒副作用的重要指標，體質量和臟器指數異常變化一般先于器官組織的病理改變[20]。秀珍菇粉對小鼠平均日增重和肝、腎指數的影響見表1。

表1 秀珍菇粉對小鼠平均日增重和肝、腎指數的影響Table 1 Effects of Pleurotus geesteranus powder on average daily weight gain and liver and kidney indices in mice

由表1 可知，灌服秀珍菇粉CMCNa 混懸液40 d后，各實驗組小鼠均存活，實驗結束各組小鼠體質量均有增加，各實驗組小鼠平均日增重和肝、腎指數與正常對照組相比均無顯著差異（P>0.05），結果表明秀珍菇粉對小鼠無毒副作用，具有食用安全性。

2.2 秀珍菇粉對小鼠血清生化指標的影響

血清ALT、BUN、Crea、CHOL、TC、GLU 是進一步評估動物健康狀況的重要生化指標，指標異常升高可預示機體某些器官和功能的病變。如血清ALT 活性、BUN、Crea 含量異常升高是肝、腎功能受損的重要標志。秀珍菇粉對小鼠血清生化指標的影響見表2。

表2 秀珍菇粉對小鼠血清生化指標的影響Table 2 Effects of Pleurotus geesteranus powder on serum levels of biochemical indices in mice

由表2 可知，各實驗組GLU、CHOL、TC 含量與NC組相比均無顯著差異（P>0.05）。GPM 和GPH 組的ALT 活性極顯著低于NC 組（P<0.01）。灌服秀珍菇粉明顯降低小鼠血清中BUN 和Crea 含量，其中GPM、GPH 組的BUN 含量均與NC 組差異極顯著（P<0.01）；GPM 和GPH 組的Crea 含量與NC 組相比顯著降低（P<0.05）。結果表明，小鼠灌服秀珍菇粉后，秀珍菇對肝、腎的功能具有一定保護作用。

2.3 秀珍菇粉對小鼠抗氧化能力影響

SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA 含量是反映機體抗氧化能力的重要指標，其中SOD、GSH-Px 和CAT 是機體重要的抗氧化酶，具有清除超氧化或過氧化因子自由基、保護生物膜和生物大分子免受損傷的作用[21]；MDA 是一種脂質過氧化物，其含量越高表明機體細胞受自由基攻擊程度越嚴重[22]。秀珍菇粉對小鼠血清、肝、腎組織抗氧化能力的影響見表3。

表3 秀珍菇粉對小鼠血清、肝、腎組織抗氧化指標的影響Table 3 Effects of Pleurotus geesteranus powder on the antioxidant activity in the serum，liver，and kidney of mice

由表3 可知，GPM、GPH 組小鼠血清中MDA 含量均極顯著低于NC 組（P<0.01）。與NC 組相比，GPM、GPH 組小鼠血清SOD 活性顯著升高（P<0.05）；GPL 組小鼠血清GSH-Px 活性也顯著高于NC 組（P<0.05）。灌服秀珍菇粉后，GPM 和GPH 組小鼠肝CAT 活性顯著升高（P<0.05），各實驗組小鼠腎臟MDA 含量顯著低于NC 組（P<0.05，P<0.01），且GPM 和GPH 組小鼠腎GSH-Px 活性也顯著高于NC 組（P<0.05）。結果表明，秀珍菇粉能明顯提高小鼠血清SOD 活性、血清和腎GSH-Px 活性以及肝CAT 活性，并明顯降低血清和腎MDA 含量，體現出較好的抗氧化活性。此結果與前人對秀珍菇菌絲體和秀珍菇多糖及秀珍菇蛋白水解物抗氧化功效的研究報道一致[10，17，23]，說明秀珍菇粉的抗氧化活性與其所含的多糖和蛋白成分密切相關。但也不排除秀珍菇粉中其他的一些活性物質（如酚類化合物、維生素、番茄紅素、氨基酸等）與多糖共同參與機體抗氧化過程[24]，起到協同增效作用。綜上，秀珍菇作為多種活性成分的復合體，較其單一多糖提取物具有更好的營養功能。

2.4 秀珍菇粉對小鼠免疫功能的影響

秀珍菇粉對小鼠免疫功能的影響見表4。

表4 秀珍菇粉對小鼠免疫功能的影響Table 4 Effects of Pleurotus geesteranus powder on the immunity in mice

胸腺指數、脾臟指數、T 淋巴細胞刺激指數、B 淋巴細胞刺激指數是反映機體免疫功能的重要指標，其中胸腺指數和T 淋巴細胞刺激指數代表細胞免疫功能，脾臟指數和B 淋巴細胞刺激指數可反映體液免疫功能。由表4 可知，各實驗組小鼠的胸腺指數均顯著高于NC 組（P<0.05，P<0.01）；GPH 組的T 淋巴細胞刺激指數最高，與NC 組相比差異顯著（P<0.05）。秀珍菇可顯著提高小鼠的胸腺指數，且在2 000 mg/kg BW劑量下可顯著提高小鼠T 淋巴細胞刺激指數，說明秀珍菇具有一定的增強小鼠細胞免疫功能的作用。

2.5 秀珍菇粉對小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標，包含chao1、observed_species、Shannon 和Simpson 4 個次級指數。其中指數chao1 和observed_species 主要反映樣品中物種種類（operational taxonomic units，OTUs）的數目，Shannon 和Simpson 指數同時反映樣品中物種種類的數目以及樣品中不同種類的物種豐度的平均性或均勻性。

秀珍菇粉對小鼠結腸微生物Alpha 多樣性的影響見表5。

表5 秀珍菇粉對小鼠結腸微生物Alpha 多樣性影響Table 5 Effects of Pleurotus geesteranus powder on Alpha diversity indices of the colonic flora in mice

由表5 可知，與NC 組相比，各實驗組的chao1、observed_species 和Shannon 指數均有所增加，GPL 組的chao1、observed_species 和Shannon 指數均顯著高于NC 組（P<0.05），GPM 和GPH 組的chao1、observed_species 和Shannon 指數與NC 組無顯著差異（P>0.05）。

維恩圖可直觀反映不同樣本之間共同的或特有的物種數（operational taxonomic units，OUTs）。基于OUTs 聚類的維恩圖見圖1。

圖1 基于OUTs 聚類的維恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs in different groups

由圖1 可知，GPL、GPM、GPH 組與NC 組的小鼠腸道共同物種數（OUTs）分別為2 216、2 318 和2 177，GPL、GPM、GPH 組小鼠腸道的特有物種數（OUTs）均較NC 組多，分別為NC 組1.9、2.0 倍和1.7 倍，此結果進一步證實灌服秀珍菇粉能提高小鼠腸道菌群的多樣性，增加腸道微生物菌群數量。

2.5.2 Beta 多樣性分析

通過主成分分析圖和聚類分析樹分析Beta 多樣性，結果見圖2。

圖2 主成分分析圖和聚類分析樹Fig.2 Principal component analysis and UPGMA-based hierarchical clustering analysis

主成分分析圖中組與組之間的距離遠近代表組間相似程度的高低。由圖2（a）可知，秀珍菇各劑量組（GPL、GPM 和GPH）與NC 組間均存在一定距離，GPL和GPH 組距NC 組較遠，說明GPL 和GPH 組與NC組的微生物菌群相似度較低，差異較大。聚類分析樹也可反映樣本間的相似程度，兩個樣本間分支距離越短，相似度越高。由圖2（b）可知，3 個正常對照組樣本間分支距離較短，但正常對照組樣本與實驗組各樣本間分支距離較長，此結果與主成分分析結果較為一致，進一步驗證了灌服秀珍菇粉后，小鼠腸道的菌群結構發生了改變。

2.5.3 腸道菌群相對豐度分析

厚壁菌門和擬桿菌門為腸道優勢菌門。厚壁菌門的許多成員都是有益菌，如乳酸桿菌可通過發酵產生乙酸鹽改善胃腸道功能、抑制腸道內有害菌生長、提高機體免疫力等[25]。研究表明，腸道菌群可對腸道中未消化的碳水化合物進行酵解，產生的乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）對腸屏障功能的維護有重要作用[26]。其中，厚壁菌門發酵代謝產生丁酸，擬桿菌門發酵產生丙酸，而丁酸的作用效果強于乙酸和丙酸，并且丁酸可以增加乳酸桿菌的數量、抑制大腸桿菌增殖[27-28]。厚壁菌門下的毛螺菌科、梭菌科、優桿菌科等許多菌種均為產丁酸菌，被認為是潛在的有益菌。而擬桿菌門下普雷沃氏菌科的菌種可作為條件致病菌，引起牙周和牙齒、腸道炎癥、類風濕性關節炎、細菌性陰道炎等問題[29]。秀珍菇粉對小鼠腸道主要菌群相對豐度影響見表6。

表6 秀珍菇粉對小鼠腸道菌群相對豐度影響Table 6 Effects of Pleurotus geesteranus powder on the relative abundance of intestinal flora at phylum and family levels in mice

由表6 可知，在門水平下，GPM 和GPH 組小鼠的厚壁門菌群豐度顯著高于NC 組（P<0.05），而各實驗組擬桿菌門菌群豐度顯著低于NC 組。在科水平下，厚壁菌門下的毛螺菌科、脫硫弧菌科、乳酸桿菌科、梭菌科和優桿菌科的菌群豐度與NC 組相比，呈上升趨勢，而擬桿菌門下有的普雷沃氏菌科和未分類桿菌科的菌群豐度呈現下降趨勢。其中GPH 組的毛螺菌科、GPL 組的乳酸桿菌科、梭菌科以及GPM 和GPH 組的優桿菌科的菌群豐度均顯著高于NC 組（P<0.05）；而GPL、GPM、GPH 組的普雷沃氏菌科和GPM、GPH 組的未分類桿菌科的菌群豐度均顯著低于NC 組（P<0.01，P<0.05）。

以上結果表明，秀珍菇粉可增加小鼠腸道菌群物種數量和多樣性，顯著增加厚壁菌門下有益菌群豐度，抑制有害菌群產生，對腸道菌群具有正向調控作用。

3 結論

本實驗從抗氧化、增強免疫和調控腸道菌群等方面探討秀珍菇營養功效，旨在為秀珍菇保健產品開發提供依據。結果表明，秀珍菇粉可提高小鼠血清、肝、腎抗氧化活性，增強小鼠細胞免疫功能，有效調節腸道菌群結構，具有較高的食用價值。秀珍菇抗氧化和增強免疫的機制可能源于其對腸道微生態的調控作用。